酶工程

II、采样时要注意的问题
气候、水分、空气
来源要广
结合产品的特点
标签：地点、时间、气候等
III、目的微生物富集的一些基本方法
富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。 富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件，进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计分类学中
酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。

α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根霉、枯草芽孢杆菌 和地衣芽孢杆菌
三、基因工程菌培养 I、概述 基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白 质和非蛋白质。 基因操作： 敲除或插入基因片段，代谢工程
细胞因子、疫苗、酶
产品最主要的用于疾病的诊断和治疗，此外 还有用于畜牧业、食品或工业用的生物催化 剂。 产品特点： 要求高纯度。如果不纯，病人可能产生的强 的免疫反应或副作用这对人是灾难性的。 有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、 磷酸化后才有活性。 附加值高。治疗蛋白最主要的是保证产品的 质量和安全，降低成本并不重要。
III、利用基因工程菌生产的特点 （一）基因工程菌带有外源基因，外源基 因可能在质粒上也可能整合到染色体上， 这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌 往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样 就会大大降低产物的表达。为了抑制基因 丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择 压力，如抗生素。 （二）基因工程菌的培养一般分两段。前 期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱 导因子，诱发产物表达。
可以利用的因素。
不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这
时只能通过随机分离的办法。
定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等。
但主要是通过培养的方法来实现定 向培养的目的。
定向培养的富集方法
1、底物
3、培养时间
2、pH条件
4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速 度的手段，培养（固体、液体；分批 连续）后使目的微生物在种群中占优 势。
3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物。现在发 展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等 优点 生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25%。 个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中 回收。 有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。 缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白 分泌到胞外也有限。 只能简单糖基化。 当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修 饰时，要用动物细胞组织培养来达到。
V、目的微生物富集方法的研究进展
目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的
多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。
分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物
的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等
In contrast to this traditional approach, modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening, which also enables access to enzymes of `nonculturable' organisms. By this strategy, for instance, the company Diversa (San Diego, CA, USA) identised 120 unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.
第二章 微生物发酵产酶
第一节 酶生物合成的基本理论
一、RNA的生物合成——转录 二、蛋白质的生物合成——翻译 三、酶生物合成的调节
一、RNA的生物合成——转录
转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为 底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用 下，生成RNA的过程。
二、蛋白质的生物合成——翻译
翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物， 在核糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因 子的作用，合成多肽的过程。 四个阶段 1、氨基酸活化生成氨酰－tRNA 2、肽链合成的起始 3、肽链的延伸 4、肽链合成的终止
2、G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是 G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌 （excretion）到胞外。它的这一性质对生 产非常有吸引力。
枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的应 用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶， 会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建 比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差， 所以在使用上有较大的限制。
微生物酶开发的一般程序
(九) 微生物产酶菌种的保藏 (1)斜面； (2)沙土管； (3)冷冻。
实验室工作与 工业化生产之间的差异
一、产酶菌种的要求 ：
1、发酵周期短，产量高； 2、容易培养和管理； 3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染； 4、有利于酶的分离和纯化； 5、安全性可靠，非致病菌。
(2)利用代谢工程和代谢调节机理来提高微 生物的酶产量；
微生物酶开发的一般程序
(七) 微生物产酶性能的进一步提高
(3)运用基因工程的手段将原有菌株中的目 的基因转移到另外一些对生产环境更适应 性的微生物细胞之内，使其高效表达。
微生物酶开发的一般程序
(八) 微生物酶的提取方法
(1)酶的粗提；
(2)酶的精制。
II、宿主-载体系统 构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统。 要求：翻译后的修饰要简单。
如果用于食品要考虑宿主菌要求安全。
常用的宿主系统有：大肠杆菌
G+细菌
低等真核细胞
哺乳动物细胞
1、大肠杆菌 如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠 杆菌作为宿主。 优点： 人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解 得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因 操作； 大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高 细胞浓度（50g/l）； 大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
IV、菌落的选出
从产物角度出发
在培养时以产物的形成有目的的设计培养基
利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素
从形态的角度
菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖 产生菌在适当的培养基上生长，从具有黏液性的菌落外观 上就可以初步识别。
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 文献:产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌 →80℃ 30分钟 处理 ↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落。 采样（造纸厂） 26株为组成型 从285个土样中获得62株 36株为诱导型
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出 现分离丢失。 为什么会出现质粒丢失呢？ 质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和 低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷 贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代 细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少 遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质 粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可 能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。 虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百 万细胞分裂中一个）。
微生物酶的开发
一、应用微生物来开发酶的优点：
(4)特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存 在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。因 此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可 以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。
微生物酶开发的一般程序
(一) 样品的采集
采样的目的、采样地点、采样方法及采样 的数量。
三、酶生物合成的调节
酶合成调节的类型： 诱导和阻遏 1、酶合成的诱导 乳糖诱导β -半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导α -淀粉酶的合成
2、酶合成的反馈阻遏作用 （末端代谢物阻遏、产物阻遏作用）
酶催化作用的产物或代谢物途径的末端产 物使该酶的生物合成受阻。引起反馈阻 遏的物质，称为共阻遏物（辅阻遏物）。 组氨酸对组氨酸合成途径中的10种酶的生 物合成均起反馈作用。
3、分解代谢物阻遏作用
葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生物合成； 果糖阻遏α-淀粉酶的生物合成
第二节 常用的产酶微生物
自然界中目的微生物分离的原则
I、菌种分离的一般过程 土样的采取 → 预处理
→ 培养
→ 菌落的选择
→ 产品的鉴定
目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 问题： 如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现
大肠杆菌作为宿主的主要问题是
大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在 细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被 水解或形成不溶的包含体。包含体中的蛋 白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活 性，必须重新溶解并使它复性。
大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响 应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白 水解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋 白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生 的速率。
(四) 菌种的复筛 初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是 在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更 符合生产要求的菌种。 酶活的测定方法的建立尤其重要。
微生物酶开发的一般程序
(五) 对复筛获得菌株的要求 (1)不是致病菌； (2)菌株不易变异和退化； (3)不易感染噬菌体； (4)微生物产酶量高； (5)酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外 酶； (6)产生的酶便于分离和提取，得率高； (7)微生物培养营养要求低。
基因插入载体，转化工程菌
非蛋白质产物大多可以通过代谢工程，改 造细胞的一些基因，如在细胞中插入编码 酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径， 从而得到新的化合物或增加产量。