软骨细胞培养

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小鼠未成熟关节透明软骨细胞的培养与生物学特征研究

ｖｂｌｙｗｓｅｒｉｅｙＭＴｈｌｃｓｔｎｐｒｒＧｕ）１，ＰＫａｄｈｐｘｄｃｌｆｃｒ１ｉｉｔａｔｍｎｄｂＴ．Ｔｅｇｏｅｒｓｏｅｓ（ｌｔ一，３Ｇｎｙｏｉｉｕｉｅａｔ一ａｉｄｅｕａｔａｎｂｏ（Ｉ－）ｍＲＡａｄｐｏｉｘｒｓｏｅｅｃｅｋｄｗｔｅｌｉｅＰＲａｄＷｅｔｌｔｎｌｃｓＨＦｌ￣ｃＮｎｒｔｎｅｐｅｓｎｗｒｈｃｅｉｒａｔＣｎｓｒｂｏｅｉｈ —ｍｅｎ，ａｄｇｏｅｕ
Ｓｐｏｔｂｓａｇａｖｒａｏｐｒｔｎｐｎｎ０Ｄ０６６；Ｓａｇａｒｒｉｐｏｃｕｒｄｙｐｅｈｎｈｉｅｅｓｏａａｉｏｅｄ４Ｚ５０）ｏｓｃｏｆｈｎｈｉｉｉｚｒｅｔｐｏｔｅｊ
（５Ｚ２１）ＳａｇａＰｊｎｌｎｏｔｅｔｅｌｔ５Ｊ４６）０Ｄ２３７；ｈｎｈｉｕａｇｐａａｎｅｐｏｅＰ１０１ｉｆｌｄｐ０Ｃｒｓｏｄｎｕｏ：ＤＮｉｎｕＥｍａ：ｌｅｇＤｎｃｍｏｒｐｎｉａｔｒＥＧＬａ－，－ｉｆｎ＠Ｉ．ｏｅｇｈｆｌｄｓ
于低氧（：积百分比为２）常氧（：积百分比２％）件下培养，用四甲基偶氮唑盐（Ｔ）Ｏ体％和Ｏ体１条应ＭＴ法检测细胞活性；ＴＰＲ检测细胞葡萄糖转运体一，Ｒ —Ｃ１３及磷酸果糖激酶ｍＮＲＡ的表达；萄糖氧化酶方法葡测定细胞对葡萄糖的摄取量。结果 Ⅱ 胶原免疫组化和阿利辛蓝染色证实获得细胞为透明软骨细型胞。低氧培养环境可提升细胞的增殖能力，细胞表达低氧诱导因子；随低氧诱导因子一的表诱导１伴１达及其表达量的提高，萄糖转运体一，葡１３和磷酸果糖激酶的表达水平升高，胞对葡萄糖的摄取量细增加。结论所建立的分离、养方法可以获得高纯度的透明软骨细胞；骨细胞可通过氧感应机培软制以适应低氧环境而调整其代谢和生存状态。【键词】软骨细胞；细胞低氧；鼠关

软组织工程研究：软骨细胞的培养

型和 Ⅲ 合成基质，最终难于形成软骨组织。而生物相容性良好养过程中向成纤维细胞样转化，细胞开始表达Ｉ和生物可降解性细胞载体的应用，能为软骨细胞提供理型胶原，并逐渐丧失分泌软骨基质能力。体外培养的软想的表面支持和稳定的三维空间支架结构，以及足够的骨细胞是研究软骨分化以及细胞因子、生长因子对软骨孔隙率，供细胞在其中进行物质交换、生长代谢和分泌细胞表型促进或抑制作用的一种必要的实验模型。对于软骨基质。以三维立体培养为基础的组织工程技术在软用组织工程技术构建软骨的软骨细胞来说，研究其体外骨细胞培养方面已取得突破性进展。用软组织工程技术培养时细胞外基质的分泌情况，一方面可以了解软骨细构建软骨的重要条件之一就是获得一定数量的软骨细胞的功能状态；另一方面，任何体细胞在体外培养过程中都有一定生存期，不可能无限制地生长，对软骨细胞胞，体外培养、扩增并保持一定的功能活性。
｜ＳＳＮ１７．２５ＣＮ１１３９Ｒ６３８２２．５，ｃｏＤＥＮ：ＫＨＡＨＺＬ
节盘及耻骨联合等处；弹性软骨分布于耳廓等处。软骨
７３７１
７ｗｃ尺瑚伽
学部软织程究软细的养术＿：组Ｉ研：骨瞻培
中国组织工程研究与临床康复
劳７４誊笫４７
２１００—１０—０８出版
ＪｕｒａｉｉａｌＲｅｂｌａｉｅｉｓｅｎｏｎｌｏｆＣｌｃｈａｉｔｔＴｓｕＥｇｍｅｅｎｓａｃＯｃｏｅ．２０ＶＬ１，Ｎｏ４１ｎｉｖｎｇＲｅｅｒｈｔｂｒ８０１ｏ４．

软骨实验报告总结

摘要：本研究旨在通过体外培养软骨细胞，探讨软骨细胞的生长特性、增殖能力及其在生物医学领域的应用潜力。

通过一系列实验，我们对软骨细胞的体外培养条件、增殖状态、细胞形态及功能进行了深入研究。

以下为实验总结。

一、实验目的和要求：1. 建立软骨细胞体外培养体系，优化培养条件。

2. 观察软骨细胞的增殖状态、细胞形态变化及功能表达。

3. 探讨软骨细胞在生物医学领域的应用前景。

二、实验仪器设备：1. 培养箱2. 超净工作台3. 移液器4. 倒置显微镜5. CO2培养箱6. 电热恒温水浴锅7. 流式细胞仪8. 低温离心机9. 低温冰箱三、实验设计及调试：（一）实验内容：1. 软骨细胞分离与培养2. 软骨细胞增殖实验3. 软骨细胞形态观察4. 软骨细胞功能实验（二）实验电路：无（三）实验设计及调试步骤：1. 对实验内容和实验电路进行分析，理出完成实验的设计思路。

2. 列出程序设计所需的特殊标志位、堆栈sp、内部ram、工作寄存器等资源的分配列表，分配列表时注意考虑资源在程序执行过程可能会出现冲突的问题。

3. 画出程序设计流程图，包括主程序和各子程序流程图。

4. 根据上述内容写出实验程序。

5. 调试程序，使用模拟仿真器进行模拟实验，观察结果，修改程序，继续调试，直至实验成功。

（四）实验调试过程中所遇到的问题、解决问题的思路和方法：1. 问题：软骨细胞在培养过程中出现污染。

解决方法：加强无菌操作，提高实验室空气质量，定期更换培养箱内的空气。

2. 问题：软骨细胞增殖缓慢。

解决方法：优化培养条件，调整细胞密度，增加生长因子。

3. 问题：软骨细胞功能表达不足。

解决方法：延长培养时间，提高细胞浓度，优化培养条件。

四、实验结果与分析：1. 软骨细胞在体外培养条件下，成功分离并建立了稳定的细胞系。

2. 软骨细胞增殖实验结果显示，细胞在体外培养条件下具有较好的增殖能力。

3. 软骨细胞形态观察表明，细胞呈典型的软骨细胞形态，细胞质丰富，细胞核清晰。

软骨细胞培养及其调控(一)

软骨细胞培养及其调控(一)关键词：软骨细胞自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来〔1〕，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。

实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨〔2〕。

虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。

软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。

软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。

在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。

组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。

1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。

近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。

也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。

目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下：1.1转化生长因子beta(TGF-β)TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。

软骨细胞培养

实验方法各种溶液的配制1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9（1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g（2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。

（3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。

（4）将酚红液（３）加入（２）中。

（5）补加水至1000ml，混匀。

（6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。

2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml（1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。

（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。

（3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。

（4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。

（5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。

3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml（1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。

（2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。

（3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

（4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。

4、配制闪烁液（1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。

（2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。

取材与培养（1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。

（2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。

（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。

（4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。

每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。

用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。

兔软骨细胞的分离培养及其生物学特征的检测

置显微镜下观察、绘制生长曲线、组织化学染色及逆转录一聚合酶链反应（１ＰＲ等方法了解其生物学特性。Ｒ１ｃ）＿结果分离获取细胞活性率可达９％以上，８原代细胞和第１代细胞以三角形或多角形为主，生长融合时呈卯圆形，甲苯胺蓝
染色呈阳性。第３以后细胞出现反分化现象。结论代ｆ关键词１兔；软骨细胞；培养本方法是一种方便且有效的培养法。
［中图分类号］Ｑ３９３【２．３文献标识码】Ａ［文章编号］１０—７５２０）６０７－３００２１（０８０ —５３－０
Ｉｏａｉｎ，ｕｔｒａｄｂｏｏｉａｃａａｔｒｓｉｓｏｒｂｉａｔｕａｓｌｔｏｃｌｅｕｎｉｌｇｃｌｈｒｃｅｉｔｃｆａｂｔｒｉｌｒｃｃｏｄｏｙｅｈｎｒｃｔｓＳＮＧＨｏ。ＨＥＷｅ２ＯｎＣＮｉ（．ｅａｔｎｆＭｉｏｉｌｇ，Ｚｎｉｄｃｌｏｌｇ，ｕｚｏｕｙ６０３Ｃｉａ２１ＤｐｒｍｅｔｃｂｏｏｙｕｙｉａＣｌｅＧｉｕＺｎｉ３０，ｈｎ；．ｏｒＭｅｅｈ５
ｂｏｏｉａｈｒｃｅｉｔｔｄｅ．ｅｈｄｔｕａｈｎｒｃｔｓｗｒｂａｎｄｂｎｙｔｉｅｔｎｆｍｈａｉｇｆｉｌｇｃｌｃａａｔｒｓｃｓｕｉｓＭｔｏｓＡｒｉｌｒｃｏｄｏｙｅｅｅｏｔｉｅｙｅｚｍａｃｄｇｓｏｒｉｃｉｉｏｔｅｃｒｌｅｏｔａｒｂｉ．Ｔｅｂｏｏｉａｈｒｃｅｉｔｏｈｎｒｃｔｓｗｒｎｅｔａｅｙｉｖｒｅｃｏｃｐｂｅｖｎ，ｇｗｔｕｖａｂｔｈｉｌｇｃｌｃａａｔｒｓｃｆｃｏｄｙｅｅｅｉｖｓｇｔｄｂｎｅｄｍｉｒｓｏｅｏｓｒｉｇｒｈｃｒｅｉｏｉｔｏｄｐｃｎ，ｔｌｉｉｅｂｕｓｉｉｇ，ｅｅｓｒｎｃｉｔｐｌｍｅａｅｃａｎｒａｔｎｅｉｔｇｏｕｄｎｌｅｔｎｎｒｖｒｅｔａｓｒｐｏｙｒｓｈｉｅｃｉ．ＲｅｕｔｅｖａｉｔｆｔｅｈｒｅｔｄｉａｏｓｌＴｈｉｌｙｏａｖｓｅｓｂｉｈｃｏｄｏｙｅｓ９％ｏｖｒｇ．ｒｍａｙａｄｆｔａｓｇｈｎｒｃｔｓａｃｔａｇｅｏｌ－ｎｌｎｓａｅｎｅａｈｎｒｃｔｓｗａ８ｎａｅａｅＰｉｒｎｒｓａｅｃｏｄｙｅｒｎｌｒｉｐｓｏｒｉｍｕｔａｇｅｉｈｐ，ａｄｂｃｍｅｉｅｌｔｈｐｔｔｅｇｏｉｇｃｎｕｎｅｗｔｔｏｇｈｔｒｃｒｍｉｏｔｌｉｉｅｂｕ．ｒｍａｓｇ，ｈｘｒｓｉｎｏｐｌｐｉｓａｅａｈｒｗｎｏｆｅｃｈｓｒｎｅｅｈｉｃｌｉｏｏａｔｏｕｄｎｌｅＦｏｐｓａｅ３ｔｅｅｐｅｓｏｆｔｅｙ

人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养

人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养魏钰;魏民【摘要】背景:大量针对骨关节炎细胞水平的研究仍集中在动物模型关节软骨细胞的体外培养.动物模型引发的退变效应与人骨关节炎的发生并不完全一致.如何利用人骨关节炎软骨组织构建体外细胞模型并研究其特征性蛋白变化趋势,是模拟体内骨关节炎软骨退变过程的关键.目的:探讨人骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养方法,观察原代至第3代人骨关节软骨细胞的形态学特性和相关蛋白表达变化.方法:取6例因重度骨关节炎行关节置换术患者的废弃软骨组织(获得中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准,伦理批号为S2017-23-7),男2例,女4例;年龄62-72岁,平均(68.3±3.39)岁,采用一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)分离培养人骨关节炎软骨细胞,并进行传代培养,从而构建体外人骨关节炎软骨细胞培养体系.倒置相差显微镜观察各代细胞形态;苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色方法进行细胞鉴定.采用Western blot法检测各代软骨细胞于70％融合率时Col2a、Aggrecan与MMP-13的表达.结果与结论:经过Ⅱ型胶原酶消化后,培养1周左右可见组织块周围爬出散在的细胞,3周左右可传代进行下一步研究;形态学、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫荧光染色证明培养出的细胞为人软骨细胞.第3代软骨细胞Col2a、Aggrecan的相对表达量与原代比较有明显降低(P<0.01),且随着培养代数增加表达逐渐降低;MMP-13随着培养代数的增加表达逐渐增强(P<0.01).结果表明,Ⅱ型胶原酶一步消化法可成功从标本中分离出骨关节炎软骨细胞并传代培养.体外培养的骨关节炎软骨细胞去分化特性随着传代次数增加而逐渐增强,功能性蛋白表达整体下降.3代以内的软骨细胞符合人骨关节炎时软骨退变的表现,可能是用于实验研究的最佳选择.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2019(023)025【总页数】6页(P4056-4061)【关键词】骨关节炎;关节置换;人软骨细胞;一步酶消化法;Ⅱ型胶原酶;Ⅱ型胶原;聚集蛋白聚糖;国家自然科学基金【作者】魏钰;魏民【作者单位】中国人民解放军总医院,北京市 100000;中国人民解放军总医院,北京市 100000【正文语种】中文【中图分类】R459.9;R394.20 引言 Introduction骨关节炎是最常见的老年退行性关节疾病，以软骨磨损和骨质增生为主要特征[1]。

软骨细胞体外培养及鉴定

括：Ｉ、、Ⅺ型胶原、蛋白聚糖、软骨连接蛋白和基质蛋Ｉ Ⅸ
白，以及在不同生长阶段所表达的蛋白，其中儿型胶原和蛋白聚糖是评价软骨细胞功能的主要指标。
２软骨细胞的来源
体外软骨细胞培养可取材于成熟软骨组织，可由间充也
骨髓分造血和基质两大系统，骨髓基质含有能分化为成
骨细胞、骨细胞、软脂肪细胞及肌细胞的前体细胞群，称为骨髓基质细胞（ａｏｒｍａｃｌＭＳＳ）ｍｒｗｓｏｌｅ，Ｃ或骨髓间充质ｒｔｌ
干细胞（ｓｎｈｍａｅｃｌＭＳ）ｍｅｅｃｙｌｔｍｌｓｅ，ＣＳ。ＭＳｓ一种多潜Ｃ是能成体干细胞，主要存脂肪干细胞、血管内皮细胞、胚胎干细
３３
文章编号：ｗｇ２１１－２４ｓｋ０］ — ２０２
软骨细胞体外培养及鉴定
王勇平蒋壶
软骨组织（ａｔａｅ由软骨细胞（ｈｎｒｃｔ）和细ｃｒｌｇ）ｉｃｏｄｏｙｅ胞外基质（ｘｒｃｌｌｔｘＣ）成，软骨细胞是软ｅｔｅｌａｍａｒ，ＥＭ构ａｕｒｉ骨组织中唯一的细胞成分，是软骨破坏过程中的靶细胞，因此软骨细胞的体外培养是研究关节软骨生理及病理的常用体外实验模型 …。软骨组织内无血管，软骨细胞所需营养由软
２１０２年
－
０８月
第９卷第４期

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软骨细胞培养
(1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。

(2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节（保留周围肌肉，软骨不能暴露），75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软骨组织，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软骨组织被风干。

(3)PBS缓冲液充分漂洗软骨小块3次，然后用小剪刀将软骨块切碎至约lmm3大小。

(4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软骨块置入放有0.2%的Ⅱ型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37℃恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞（沉淀物），加入含10%的胎牛血清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软骨细胞混悬液。

(5)把消化所得的软骨细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2×105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。

将培养瓶放置于CO2培养箱内。

培养条件为37℃、5%CO2。

(6)未消化完的软骨小块继续用Ⅱ型胶原酶如上法消化，直至软骨块基本消失。

(7)每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照保存。

药物制备
龟甲胶、鹿角胶各10克，氨基葡萄糖1.5克，分别加PBS缓冲液30ml配成
10g/30ml、10g/30ml和1.5g/30ml的溶液。

然后分别取上述溶液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml放于不同的15ml离心管中，加PBS定容至10ml，各配成6管分别为2.5%、5%、10%、20%、30%、40%含药的PBS，放4℃冰箱备用。

药物组：将上述6管含药PBS分别各取1ml放于不同的15ml离心管中，加含10%胎牛血清的DMEM培养液定容至10ml，分别配成10%含药的胎牛血清DMEM培养液（避免胎牛血清的干扰），做好标记，放4℃冰箱备用。

另外取1ml PBS缓冲液加到9ml含10%胎牛血清的DMEM培养液中，配成10ml 10%PBS的含胎牛血清的DMEM培养液作为空白对照组，放4℃冰箱备用。