双向凝胶电泳(2-DE)_百替生物
双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景
双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景1双向电泳技术1.1双向电泳技术概述双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳技术的原理双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一。
它利用了各种蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分，具有较高的分辨率和灵敏度，目前已成为复杂蛋白质组分检测和分析的最好的生化技术。
IPG - DALT系统双向电泳技术原理简明：首先利用等电聚焦(isoelectric focusing ,IEF)将蛋白质沿pH梯度分离至各自等电点(isoelectric point ,pI)，通过电荷分离蛋白质；然后沿垂直的方向以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate polyacryla -mide gel electrophoresis ,SDS-PAGE)通过分子量分离蛋白质。
所得蛋白双维排列图中每个点代表样本中一个或数个蛋白质，而蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来。
双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景
双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景1 双向电泳技术1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2 双向电泳技术的原理双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一。
它利用了各种蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分，具有较高的分辨率和灵敏度，目前已成为复杂蛋白质组分检测和分析的最好的生化技术。
IPG - DALT系统双向电泳技术原理简明：首先利用等电聚焦( isoelectric focusing ,IEF) 将蛋白质沿pH 梯度分离至各自等电点(isoelectric point ,pI)，通过电荷分离蛋白质；然后沿垂直的方向以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( sodium dodecyl sulphate polyacryla -mide gel electrophoresis ,SDS-PAGE)，通过分子量分离蛋白质。
所得蛋白双维排列图中每个点代表样本中一个或数个蛋白质，而蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来。
双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置（经典）
双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置（经典）双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置(经典)3.2点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels(18cm，pH 3-10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品双向电泳实验过程及相关溶液配置A.实验过程一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息二、实验步骤：1.样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白：100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时其中每隔10~15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80oC保存2.Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul,5ul,10ul,15ul,20ul的BSA溶解液，另2管中分别加入2ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值(测量过程要在一个小时内完成)例如：编号蛋白量(ul)Buffer(ul)Bradford(ml)OD595值1 080 40 25 75 40.024 310 70 40.061 415 65 40.091 520 60 40.116 Bt4 278 40.079 Bt4 476 4转Bt4 278 40.075转Bt4 476 4标准曲线方程式：Y=aX b.其中Y为OD值，X为蛋白含量a、b 通过作图输入数据可知相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得OD值测量过程：比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值3.双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1水化液的制备称取2.0mg的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05%的溴酚兰，3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer(pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min除杂质，取上清在含300ug蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定(跑胶温度为20oC)S1(30v,12hr,360vhs,step)S2(500v,1hr,500vhs,step)S3(1000v,1hr,1000vhs,step)S4(8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)S5(8000v,5hr,40000vhs,step)共计44110vhs,19.5小时其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦3.4平衡用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干(胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去)，再以超纯水冲洗，滤纸吸。
双向电泳(2-D Electrophoresis)
銘傳大學 生物科技學系 學生: 學生:賴柏融 製 96年11月 96年11月
前言
此乃由操作二維電泳 二維電泳同學因需要而製作 二維電泳 的教學簡報,僅供參考使用,不足的部分 也請自行參照使用手冊或書籍,其中一定 有不少遺漏或錯誤,敬請改正指教,此外 要有教師指導後使用,避免因錯誤觀念而 誤導.
小心的將膠條上的保護塑膠條撕開，膠面 朝下，輕輕的把膠條放入含有rehydration solution的凹槽，小心移動膠條，讓整條 膠條都有覆蓋住液體。小心不要造成小氣 泡的產生。 在凹槽中滴入IPG Cover Fluid (膠條覆蓋 油) 直到膠條全部被覆蓋。 蓋上蓋子後至少靜置十個小時，最佳的操 作是讓膠條隔夜覆水。
第2章 IEF儀器
圖一 Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System
Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System Ceramic manifold Electrode assembly Rehydration tray Pre-cut electrode wicks Spirit level IPG Cover Fluid Cleaning solution Cleaning brush
第4章 IPG Strip Rehydration (IPG 膠條覆水作用） 先將rehydration tray (覆水槽) 的蓋子 打開，首先以ddH2O徹底沖洗覆水槽的凹 槽，滴入數滴的Ettan IPGphor Strip Holder Cleaning Solution (清潔液)， 用Cleaning brush (清潔刷子)仔細刷洗 凹槽，移除任何可能的殘留蛋白質，再用 ddH2O沖洗乾淨後，徹底風乾。
二维凝胶电泳和质谱技术剖析
双向凝胶电泳和质谱技术
刘东 TEL: 68771960 E-mail: liudong@ 全军免疫学研究所
CTCTCTOHOHOHLLIILRLIRLRLDEDEDEGGMMGMEEEIIILOLOLOIIIFFTTFTABABABRARARAYSYSYSIIIMCMMCC EMEMEMDDDEEEIIDIDDCCCIIAIAACCCLLLAAAULLULUNSNNSSCICCIVIIVIVIEEEEEENRNNRRSCSCISCETIEIESTTYSSYY
蛋白质分离首选技术：
双向凝胶电泳技术
目前唯一能分离上千种蛋白的技术
人肾脏细胞
细胞系K562
小鼠肝细胞
CTCTCTOHOHOHLLIILRLIRLRLDEDEDEGGMMGMEEEIIILOLOLOIIIFFTTFTABABABRARARAYSYSYSIIIMCMMCC EMEMEMDDDEEEIIDIDDCCCIIAIAACCCLLLAAAULLULUNSNNSSCICCIVIIVIVIEEEEEENRNNRRSCSCISCETIEIESTTYSSYY
双向电泳研究流程图 CTCTCTOHOHOHLLIILRLIRLRLDEDEDEGGMMGMEEEIIILOLOLOIIIFFTTFTABABABRARARAYSYSYSIIIMCMMCCEMEMEMDDDEEEIIDIDDCCCIIAIAACCCLLLAAAULLULUNSNNSSCICCIVIIVIVIEEEEEENRNNRRSCSCISCETIEIESTTYSSYY
双向电泳原理及实验步骤
银染（Silver Stain Plus™ stain）
荧光染色（SYPRO® Ruby protein gel stain）
适用于质谱的染色方法
考马斯亮蓝染色
银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。
快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。
聚焦时间的优化
IEF的基本条件
Stemp 1
Stemp 2
Stemp 3
total
voltage
Time
Volt-Hours
Ramp
250
20min
－－－
Linear
4000
4000
2hr
－－－
－－－
10,000V-hr
Linear
Rapid
5 hr
14,000V-hr
7 cm
Stemp 1
Stemp 2
双向电泳样品的溶解
是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标： 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除； 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。
02
样品上样缓冲液
标准溶液：
Reagent
Amount
8M urea
47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O
50mM DTT or 2mM TBP
385mg or 500ul of 200mM TBP stock
双向电泳技术手册之四胶蛋白质点的检测(考染和银染)
双向电泳技术手册之四:胶蛋白质点的检测(考染和银染)第四章2-DE 胶蛋白质点的检测2-DE 胶蛋白质点的检测方法大致有：1）考马斯亮兰染色法；2)银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5 ）放射性同位素标记法等。
这几种检测方法的灵敏度各不相同。
目前最常用的是银染法和考染法。
由于银染的灵敏度是考染的50 倍，故一般用银染法进行分析处理，再用考染法来进行样品微量制备。
4.1考马斯亮兰染色:4.1.1经典的考马斯亮兰染色程序：1 固定20 % TCA 1h2 染色0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid 2h3 脱色40% EtOH&10% acetic acid 2x 30 min4 强化1% acetic acid overnight5 清洗deionized H2O 30 min局限：灵敏度低（≈1μg protein/spot）4.1.2 Neuhoff 胶体考染法：1 固定：12％（w/v）三氯醋酸（TCA）2h2 染色：200ml 染色液混合50ml 甲醇16-24h染色液：在490ml 含2％（w/v）的H3PO4中加50g (NH4)2SO4 直至完全溶解，再加0.5g CBB G-250（已溶于10mlH2O中），搅拌混合。
无需过滤，使用前摇匀。
3 漂洗：1）0.1mol/L Tris-H3PO4缓冲液（pH 6.5）漂洗两分钟；2）25％（v/v）甲醇漂洗不超过1min4 稳定：在20％的(NH4)2SO4中稳定蛋白质－染料复合物。
优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot.4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法：1 染色（0.025%(w/v) 考马斯亮兰R350）：将1 片Phast Gel Blue 药片溶入1.6L 10%醋酸，将染色液加热到90℃倒入凝胶染色盘，振荡10min；2 脱色：10%醋酸室温振荡脱色2h ，期间需多次更换脱色液，脱色液可通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收；脱色液和染色液可重复使用。
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用一、双向凝胶电泳（2-DE）的原理双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；第二向则按分子量的差异用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
二、关键参数分辨率和可重复性。
目前，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点。
采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的、可以随意精确设定的pH梯度。
建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对意向区域在pH范围内做第二轮分析，从而大大提高分辨率，威斯腾生物实验中心对这方面的研究比较全面和成熟。
灵敏度。
双向凝胶电泳灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的是用同位素标记，20ppm的标记蛋白可通过其荧光或磷光的强度而测定。
双向凝胶电泳用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即“参考胶图谱”。
三、蛋白质组研究的主要困难对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量分析。
双向凝胶电泳最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF膜上后再进行分析，确定是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。
四、蛋白质的翻译后修饰和加工指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成等，可能有一百种以上。
双向凝胶电泳翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。
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双向凝胶电泳（2-DE）双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。
在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。
80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。
此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。
这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。
第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。
蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。
最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。
有文献报道，N末端4个残基序列的数据就可以给出很多的信息而得到相当准确的结果。
如再结合C末端序列，判断结果的准确性会更高。
对分离得到的蛋白质作进一步的确切鉴定需要有足够数量的纯蛋白，电泳时蛋白质已经过了高度纯化。
现在一块胶板可允许上到高达mg数量级的样品，因此每个分离的蛋白斑点可有μg数量的蛋白，这样使本来是微量的蛋白也可希冀被鉴定。
蛋白质的翻译后修饰和加工，是指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成，以及最近发现的蛋白质自剪接等等，可能有一百种以上。
翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。
用双向凝胶电泳可以进行翻译后修饰的研究，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化。
双向凝胶电泳中常可发现的蛋白质拖曳现象，很可能是一个蛋白的不同翻译后修饰产物所造成的。
拖曳图像变化在疾病诊断上可能提供重要的信息。
双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：(1)低拷贝蛋白的鉴定。
人体的微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。
除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上，但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。
(2)极酸或极碱蛋白的分离。
(3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD＝蛋白的分离。
(4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白。
(5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。
双向电泳操作方法1蛋白质样品制备秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000r/min离心15min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10mM β-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Ampholine(Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6%Triton X-100]，37℃育30min，期间搅动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000r/min离心15min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。
或者-70度保存2蛋白质浓度测定按Garrels（1983）的程序，稍加改动。
10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl水及50μl20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μl PBS溶液复溶，并按Bradford（1976）的程序测定蛋白质浓度。
2.3.1电聚焦（IEF）2.3.1.1玻管准备干净玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部，在16cm处作好标记,垂直放在泡沫板上。
电聚焦的管子，买原装的也可以，实在不行自己也可以做的，1ml的移液管，内径1.5mm左右的，长度取18cm，用玻璃刀做，玻璃管的处理，先用2M的NaOH泡至少1hr，用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换2，3次水;后用2M的HCL泡至少1个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1个小时，中间换3，4次水，可多泡一会。
最后泡在无水乙醇里面1hr，烘干就可以用了.2.3.1.2凝胶制备与电聚焦灌IEF的配方为3.09克尿素1.125ml10%NP-401.125ml水0.735ml30%屏息现案(ACR28.38BIS1.62)0.15ml Am3.5-100.375ml Am5-78卫生10%AP1.8卫生TEMED用注射器吸好胶液，装上7号针头，将7号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合1小时以上，适当长一点的时间更好。
待胶聚合好后，除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，加样80μg，上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要破坏样品与NaOH的界面。
即可进行电泳。
电极液为：上槽（负极）为50m mol/L NaOH液，下槽（正极）为25m mol/L H3PO4。
按200V×15min，300V×30min，400V×18h，1000V×1h的程序进行电聚焦。
或者直接400V17hr1000V2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37度左右，第一向温度特别重要，不然,电聚焦肯定不好.2.3.1.3电泳后的凝条处理电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200μl的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。
从顶部向下注水使胶条向下滑出注射器枪头玻璃管必须为一直线。
取一胶条，用双蒸水洗净两端，按酸端到碱端的顺序切成0.5cm的小段，各自浸入含1.3ml抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜，次日用酸度计分别测定各段的pH值，以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标作图，即为等电点标准曲线。
漫漫挤,管子,200卫生枪头,注射器,要成一直线,,要用一手扶着管子,一手拿住200卫生枪头,保证水不从枪头和管子处流出来,注射器顶在胸前把胶条挤出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久，在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要换至少5次水,每次用不同的小平皿。
对要进行第二向SDS-PAGE的胶条则必须用平衡液[2.3%SDS，62.5m mol/L Tris-HCL（pH6.8），10%甘油，5%β－巯基乙醇，0.1%溴酚蓝]进行二次平衡，第一次20min，第二次25min。
第2次的溶液为新的。
平衡过程中每隔几min轻轻的晃一下小平皿。
2.3.2第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离胶浓度为12%，无浓缩胶。
待胶聚合后，将电聚焦后已经平衡的胶条平放于浓缩胶顶端（避免胶条拉直），并用1%琼脂糖（电极缓冲液配制）封胶，特别应注意避免胶条与分离胶上沿产生气炮。
61厂板子之灌胶：坚决不用凡士林，用透明胶将两端（板子的2边）封住，再用2%琼脂之SDS-PAGE电极液封底，待琼脂凝固后再灌胶，最后用水封胶。
1，灌胶不会有任何问题，不能漏，2，不用浓缩胶，只用分离胶。
3，分离胶用水封，要保证凝聚好的PAGE胶，为一平的线。
用透明胶（约4cm宽），封住两边，下面还是用2％的琼脂封。
灌好电极缓冲液[25m mol/LTris，192m mol/L甘氨酸及0.1%SDS]，按25mA/板胶恒流进行电泳，待溴酚兰离底部1cm 时即可停止电泳，一般电泳耗时约4-5h。
银染：凝胶于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者过夜；用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min；水洗6×5min；0.02%硫代硫酸钠1min；水洗3×20s；0.2%硝酸银，0.02%甲醛快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;0.2%硝酸银，0.02%甲醛20min；水洗3×20s；显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠)快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠)显色到你所希望的程度,自己看,背景好,点又多的话就可以了；水洗20秒；0.05%甘氨酸停显。
染色理想温度：最好是20度左右。
10%TCA,0.07%2-ME丙酮（100ml）:100%TCA10ml2-ME0.07ml丙酮90ml0.07%2-ME丙酮（100ml）:2-ME0.07ml丙酮100ml0Farrel液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5%2-ME)50mlUrea28.5gNP-401mlAmpholine5~72.0ml3.5~100.5ml2-ME2.5ml定容，配好后用1.5ml管分装！-70度保存UKS液(含9.5M Urea,5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%Triton X-100)25ml50mlUrea14.25g28.5gK2CO317.25mg34.5mgSDS0.3125g0.625gDTT0.125g0.25g2-MEAmpholine(3.5~10)1.25ml2.5mlTriton X-1001.5ml3ml(0.86ml2枪，4枪)2-ME可适当加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分装！-70度保存！双向电泳IPG（summer）一、样品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法（1）在液氮中研磨叶片（2）加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。