实验二 培养材料消毒和接种26页PPT文档

• （4）射线灭菌 主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、 操作台等，灭菌时间20-30min。 注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯 后要打开风机 、
• （5）火焰灼烧灭菌 用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的
灭菌。Βιβλιοθήκη （6）消毒剂 适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。 几种常用消毒剂的效果比较
消毒剂
使用浓度(%)
消毒时间 (min.)
乙醇
70-75
0.1-3
新洁尔灭 10～20
5～30
氯化汞
0.1～1
2～15
过氧化氢 抗菌素
10～12 4～50mgl-
1
5～15 30～60
次氯酸钙/纳 9 ～ 10
5～30
效果
好 好 最好 较好 较好 好
残液去除 难易 易 易 最难 最易
较难
易
• 二、实验原理
• （7）接种用的镊子使用前插入95%的乙 醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片 刻，冷却后待用。也可以插入培养基边 缘促使其冷却。
• （8）在酒精灯火焰旁揭去培养皿封口膜，在 靠近火焰处，右手用灭菌的镊子夹取绿豆种子， 将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其 部分浸入培养基。每瓶可放8-12个外植体。
• （9）封上封口膜，标上接种日期、材料名称、 姓名等，将接种材料移到培养室培养。
五、作业
1、观察接种后2～5天的污染情况，填入下表
• （3）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然 后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。
• （4）将绿豆种子在流水下冲洗干净。
• （5）将种子放于广口瓶中，用75%的酒精溶液 浸泡30s，无菌水冲洗，然后用0.1%升汞溶液 浸泡3、5、10min，期间不断摇动溶液，用无 菌水洗涤5遍待用。
• （6）取出培养皿，有必要的话可以用沾有75% 的酒精的棉球把皿表面擦一下。
• 用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外 植体。在组织培养中，外植体如果是带菌的， 在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养 成功的最基本的和重要的前提。常用消毒剂对 外植体进行消毒。从室外取的材料，一般先用 自来水冲洗数分钟.
• 接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤3～5 遍，最后用无菌纸擦干净。使用消毒剂的原则 是既要达到消毒目的，又不能损伤植物组织和 细胞，还要符合就地取材的原则。对一些容易 污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用 单一消毒剂不能收到好的效果，所以常选用两 种消毒剂交替浸泡法。
• 一、实验目的 • 1、掌握植物组织培养中的无菌操作技术 • 2、掌握植物外植体表面消毒的常规方法
• 操作前的准备工作
• 接种室在接种前4-5 d必须通风换气。在 接种前一天对接种室进行全面消毒，一 般用40%福尔马林进行全面喷雾，并密闭 24 h，然后打开换气窗10-15 min.。
• A: 实验器具和材料的准备 B: 用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及 超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意： 台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免 降低灭菌效果。 C: 关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲 间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和 口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽 量不要下工作台）
沾去污剂（粉）洗刷，然后用自来水彻底洗净 去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用。
• 清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗. • C、金属用品洗涤
金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的 可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般 用酒精擦洗，然后火焰干燥
• （1）干热灭菌 适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法： 150℃ 、40min
• 一般，首先用75％乙醇浸泡外植体数秒钟至 30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min 或 含有2％活性氧的次氯酸钠溶液5～30min，然 后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或次氯酸钠灭 菌后，用无菌水洗，进一步剥去几层组织或器 官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌3～5min，无 菌水漂洗3 次后，切割、用于接种。 消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行。 完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基 中。
• 三、实验材料
• 器材： • 超净工作台、镊子、酒精灯、脱脂棉、烧杯、
广口瓶、培养皿。
• 药品及材料： • 0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、绿豆种
子、培养基。
• 四、实验步骤
• （1）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。 • （2）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，
打开超净台紫外灯开关，照射至少20分钟，关闭台 内的紫外灯，通风五分钟后，再开日光灯进行无菌 操作。
• D: 用70－75％乙醇消毒双手。试验用具也应 该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其 火焰上灼烧，冷却待用。 注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。 移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶
材料过火焰不能时间太长。
接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免 空气中微生物落入瓶中
错误
整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要 迅速
• （2）湿热灭菌 适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、 纸等。121℃ 维持20~30min
• （3）过滤灭菌 • 培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长
调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。
• 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度， 用注射器注入微孔滤膜虑。制培养基时，现将 培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适 量的激素。
正确
错误
防止操作带来的污染 接种过程中尽可能达到悬空要求
正确
错误
• 培养器材的清洗与灭菌
• 在细胞工程实验中，离体细胞对任何毒性物质 都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物和细 胞残余物以及非营养的化学物质。某些化学物 质仅0.01μg/L就会对细胞产生毒性作用，因 此对培养器皿的清洗是组织培养中一项极为重 要的环节。
• A、新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物 质，可先用0.5％的去污剂洗刷，再用自来水洗净， 然后浸泡在1％～2％盐酸溶液中过夜（不可少于 四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲
洗两次，在100℃～120℃烘箱内烘干备用。
• B、使用过的玻璃仪器的清洗 先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷