牛口蹄疫病毒VP2结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立
牛口蹄疫病毒VP2结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立
阳性 血 清发 生 交叉 反应 。检 测 非免 疫 无 口蹄 疫 国 家牛 阴性 血 清的 特 异性 为 １０ ；检 测 感 染血 清敏 感性 为 ９ ＿％； ０％ ７ ３
检测 Ｏ— ｉ 二价 苗免 疫牛 血清 ，与 ４种 商品 化试 剂盒 比较 ，其 符合 率 分别 为 ６ ． Ａｓ Ｉ的 ａ ９０％、９ ． ５０％、９ ． ０４％和 ８ ． ６８％。
Ａｂ ｔ ｃ ： ｈ ｏ ｌｔ ｅ ｅ ｅ ｃ ｄ ｎ ｈ ｔｕ ｔｒ ｌ ｒ ｔ ｉ ２ ｏ Ｍ ＤＶ ｓ ｓ ｂ ｌ ｎ ｄ ｉｔ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｖ ｃ ｏ Ｐ ｓ ｒ ｔ Ｔ ｅ ｃ ｍｐ ｅ ｅ ｇ ｎ ｎ ｏ ｉ ｇ ｔ ｅ ｓ ｃｕ ａ ｏ ｅｎ ＶＰ ｆＦ ａ ｒ ｐ ｗａ ｕ ｃｏ ｅ ｎ ｏ ｅ ｐ ｅ ｓ ｅ ｔ ｒｐ ＲＯＥ Ｍ ｏ ＸＴ ＨＴ ｎ ｘ ｒ ｓｅ ｎ ＤＨ５ ｅ ｌ．Ｐ ｒｆ ｄ ＶＰ ｒ ｔｉ ｅ ｃ ｅ ｏ ｉｖ ｌ ｔ ｅ ｏｙ — ｅ ｉ ｃ ｃ ｔ ｅ ｓ ｒ ｆ ５ ｅｏｙ ｅ ｆ ｂ ａ ｄ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｉ ａｃｌ ｓ ｕ ｉ ｅ ２ ｐ ｏ ｅｎ ｒ ａ ｔ ｄ ｐ ｓｔ ｅｙ ｗｉ ｓ ｒ ｔｐｅｓ ｃｆ ａｔ ｅａ ｏ ｓ ｒ ｔｐ ｓ ｏ ｉ ｉ ｈ ｐ ｉ ｌ
摘
要 ：为 建 立牛 口蹄 疫（ＭＤ） Ｆ ａ 的检 测 方 法 ，本研 究将 口蹄 疫病 毒 （ＭＤ ） Ｖ ２ 因 ，通过 ｐ Ｒ Ｅ Ｔ ％体 Ｆ Ｖ￣ Ｐ 基 ＰＯ Ｘ Ｍ
Ｈ ｂ表达 载 体 在 大 肠杆 菌 Ｄ ５ 中表 达 ，获得 大 小 为 ３ ｕ的 重 组 Ｖ ２ 白（ Ｐ ） ｅｔ ｎ ｌ 证 实 ｒ Ｐ Ｔ Ｈ ｄ ５ｌ （ Ｐ 蛋 ｒ ２ ，ｗ ｓ ｒ ｏ Ｖ ｅ ｂｔ Ｖ ２可 与 Ｆ Ｖ５种 血 清 型 的 牛 阳性 血 清发 生特 异 性 反 应 。 以 纯化 复性 的 ｒＰ ＭＤ Ｖ ２为抗 原 建 立 了 Ｆ Ｖｒ Ｐ ＭＤ ２间接 Ｅ ＩＡ 方 Ｖ ＬＳ
间接elisa实验流程
间接elisa实验流程
间接ELISA实验流程
ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测抗体或抗原的存在。
其中，间接ELISA是一种常用的抗体检测方法，其流程如下：
1.涂层：将待检测的抗原溶液加入96孔板中，使其在孔底形成一层涂层。
通常使用1%的牛血清白蛋白（BSA）或羊血清白蛋白（GSA）作为涂层缓冲液，以防止非特异性结合。
2.阻断：将孔中的涂层缓冲液倒掉，加入5%的牛血清或羊血清，使其在孔底形成一层阻断液。
阻断液可以防止非特异性结合，提高检测的灵敏度。
3.加入一抗：将待检测的样品加入孔中，与涂层中的抗原结合。
一般情况下，使用稀释后的血清或纯化的抗体作为一抗。
孵育时间一般为1-2小时。
4.加入二抗：加入与一抗特异性结合的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，孵育时间一般为1小时。
二抗可以与一抗结合形成复合物，
从而增强信号。
5.加入底物：加入HRP底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺），孵育时间一般为10-30分钟。
HRP底物在酶的作用下会发生颜色变化，从而形成信号。
6.停止反应：加入停止液，如2M的硫酸，停止底物的反应。
停止液可以防止底物的继续反应，从而保证结果的准确性。
7.测量：使用酶标仪测量吸光度值，计算样品中抗体或抗原的浓度。
总结：间接ELISA是一种常用的抗体检测方法，其流程包括涂层、阻断、加入一抗、加入二抗、加入底物、停止反应和测量。
通过这种方法可以检测样品中抗体或抗原的存在，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
口蹄疫病毒vp3-间接免疫荧光诊断方法的建立
Ｅｓ ａ ｌｓ ｍ ｅ ｆＩ ｉ ｅ ｔ ｕｏ ｅ ｃ ｎ ｔｂｏ ｙ ｔ ｂ ｉｈ ｎｔｏ ｎｄ ｒ ｃ Ｆｌ ｒ ｓ ｅ ｔＡｎ ｉ ｄ
Ｔｅ ｔｔ ｐ ａ ｎ ｓｓｏ ｏ － ｓ ｏ ｖ ３ Ｄｉ ｇ ｏ ｉ ｆＦｏ ｔ Ａｎｄ －Ｍ ｏ ｈ Ｄ ｓ ａ ｅ ｕｔ ｅ ｓ ｉ
Ｌｉ ｅ ｔｃｋＩ ｆ ｃｉ ｕ ｓ ａ ｅ ，Ｎａｉｎａ ｙ Ｌ ｂｏ ａｏ ｙｏ ｔ ｉ ａ ｏ ｅ ｈ ｌｇ Ｈ ａ ｂ ｎＶｅ ｅ ｎ ｒ ｖ ｓｏ ｎ ｅ ｔｏ ｓＤｉｅ ｓ ｓ ｔｏ ｌＫｅ ａ ｒ ｔｒ ｆＶｅｅｒｎ ｒ Ｂｉｔ ｃ ｎｏｏ ｙ ｙ ｒ ｉ ｔ ｒ ａ Ｒｅｓ ａｃｈＩ ｔｔ ｅ， ｉ ｙ ｅ ｒ ｎｓｉ ｕｔ Ｃｈｉｅ ｅ ｎ ｓ
Ｆ Ｖ 自然感染动物与疫苗免疫 动物鉴别诊断方法 。Ｃ ＭＤ Ｐ Ｒ扩增 口蹄疫病毒结构蛋 白 Ｖ ３基因 ，克隆到杆状病 毒表达系统转移 Ｐ 载体 ｐ ａｔａＨ — Ｆ ｓ ｃ Ｔ Ａ中 ， Ｂ 转座 Ｄ Ｏ感受态细胞 ， ＨＩ 获得 阳性 克隆 。 提取基 因组 Ｂ ｃ ｄ 转染 ｓ９昆虫细胞 ， ａｍｉ， ｆ 获得含 口蹄疫病毒结 构蛋 白基因 Ｖ ３基因的重组杆状病毒 。 Ｐ 以被检测血清 为一抗 ， ＦＴ 以 ＩＣ标记 的兔抗牛 Ｉ ｇ为二抗 ， Ｇ 通过反应条件的优化 ， 建立 间 接免疫荧光检测方法 ， 并检测血清 ４ 份 ， Ｅ ＩＡ方法符合率为 ９ ． ４ 与 ＬＳ ０９ ％。 关键词 ： 口蹄疫病毒 ； Ｐ ； Ｖ ３ 鉴别诊断 ； 间接免疫荧光
，
．
Ａ ａ ｅ ｆ ｇｉｕｔｒｌ ｃ ｎ ｅ， ａｂｎ１ ０ ０ ） ｃ ｄ ｍｙ ｒ ｌ ａ Ｓ ｉ ｃ ｓ Ｈ ｒｉ ５ ０ １ ｏＡ ｃ ｕ ｅ
口蹄疫病毒快速检测方法的建立
材料和方法
金标记抗体的制备
离心法: 1) 取一定量的金溶液, 加入单克隆抗体后 , 搅拌 20 min,置于 4℃ 30 min。
2) 按照金溶液体积的 0.04%加入PEG20000 稳定剂。
3) 搅拌 20 min, 置于 4℃, 2 h 以上。 4) 2000 r/min 离心 10 min, 弃沉淀。 5) 8000 r/min离心 30 min, 保留沉淀。 6) 将沉淀用金稀释液悬浮,最终体积为原始体积的 8%。
讨论
在本检测方法的建立过程中 , 采用磁力搅拌加热装置制备的胶体金 , 可有效保证不同批次胶体金制备的实验条件, 包括反应容器、反应时 间、搅拌速度等因素的一致性。 电镜观察胶体金平均粒径为(40.06±0.70)nm, 颗粒外形均一, 尺寸变 异系数小, 可在 NC 膜上自由流动。根据文献选择 40 nm胶体金颗粒 , 因为这一尺寸的颗粒大小适中, 既易于辨识, 又不会影响蛋白质与颗 粒表面的结合, 可使标记材料获得最佳性能。 在特异性实验中, 本研究将各型FMD与其他水泡性疾病特别是SVD一 同检验, 检测结果显示, 非Asia1口蹄疫病料结果均为阴性, 而对FMD 血清型的鉴定符合率为 100%, 由此证实该试剂盒检测口蹄疫病毒时 , 与临床症状相似疾病的病原无交叉, 无假阳性反应, 具有很好的特异 性。
讨论
口蹄疫有 7 个血清型, 因型间抗原性的明显差异, 某个血清型的感染 康复动物不能交叉保护其他血清型病毒的攻击。在特异性实验中, 本 研究将各型 FMD 与其他水泡性疾病特别是 SVD 一同检验, 检测结果 显示, 非 Asia1 口蹄疫病料结果均为阴性, 而对 FMD 血清型的鉴定符 合率为 100%, 由此证实该试剂盒检测口蹄疫病毒时, 与临床症状相似 疾病的病原无交叉, 无假阳性反应, 具有很好的特异性。 敏感性实验结果显示, 试纸条在检测倍比稀释的同型阳性参考样本时, 随着稀释倍数的增加, 检测带的红色条带显色越浅, 说明随着病毒含 量的不断减少, 试纸条的检测能力不断下降。通过与间接血凝试剂盒 以及 PCR 对比发现, 金标试纸条与间接血凝的结果完全一致。与传统 诊断口蹄疫的方法相比, 金标试纸条的样品符合率为 98.75%。而且金 标试纸条检测迅速, 一般在3~5 min 就可以得出检测结果。
牛病毒腹泻病毒(BVDV)E2重组蛋白ELISA检测方法的初步建立
ｏｔ ａ ｄ ｕｉ ａ ｒ ｈ ＬＳ ａ ｃｎ ｒ ｅ ｐｉ ｌ ｉ ｔ ｎｒ ｅ ｏ ｅＥ ＩＡ ｗ ｓ ｏｆｍ ｄ．【 ｅｕｔＴ ｅｒ ｏ ｉａｔ ｒ ｅ ｐｅｓ ｎｃｎｒａｈ１ ．％ ｍ ｌ ｏ ｔｆ ｔ ｉ Ｒ ｓｌ ｈ ｅ ｍ ｎｎ ｐｏ ｉ ｅ ｒ ｉ ａ ｃ ９ ７ 】 ｃｂ ｔｎ ｘ ｓｏ ｅ
ｔｅ ｔ ｒｅ ｒｔｉ ａｔｒｂ ｉｇ ｐ ｒｆ ｄ ｗｉ ｈ ｉ ｂ ｎ ｉ，ｗａ ｓ ｄ ａ ｎ ａ ｔ ｅ ｎ ｔ ｅｓ ｕ ｒ ｉ ａｉｎ ｔｓ ｄ ｈ ａ ｇ ｔｐ ｏｅｎ， ｆｅ ｅｎ ｕ ｉ ｔ ｔ ｅ ｈｓ ａ ｄ ｋｔ ｉ ｅ ｈ ｓ ｕ ｅ ｓａ ｎｉ ｎ ｉ ｈ ｑ ａｅ ｔ ｒ ｔ ｅｔａ ｇ ｔ ｏ ｎ
率 达 到 ９ ．５ 。 【 论 】 Ｂ Ｄ ２重 组 蛋 白作 为 抗 原 建 立 的 间 接 Ｅ ＩＡ检 测 方 法 是 可 行 的 ， 其 进 一 步 的 ３５％ 结 以 Ｖ ＶＥ ＬＳ 为 标准化莫定基础 。
关 键 词 ： 病 毒 性 腹 泻 病 毒 ； ２重 组 蛋 白 ； ＬＳ 牛 Ｅ ＥＩ Ａ 中 图分 类 号 ： ８ １６ ３ ￥ ５ ．５ 文 献 标识 码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ １ ４ ３ （０ ０ ０ —０ ６ —０ １０ — ３０ ２ １ ）４ ７ １ ４
ｉ ｏａ ｍｏ ｎ ｆｓ ｍａｉ ｒｔ ｉ Ｗ ｅ ｔ Ｂｌｔａ ｓ ｙ ｓ ｏ ｄ ｔ ｅｇ ｏ ｍｍｕ ｏｏ ｉａ ｅ ｃ ｉｉ ｎ ｐ ｃｆｃｔ ｆｔ ｎ ｔｔｌａ ｕ ｔｏ ｏ ｔ ｐ ｏｅｎ． ｓ — ｏ ａ ｈ ｗｅ ｈ ｏ ｄ ｉ ｃ ｓ ｎ ｌｇｃ ｌｒａ ｔ ｔ ａ ｄ ｓ ｅ ｉ ｉ ｏ ｖｙ ｉ ｙ ｈｅ ｔｒｅ ｏｔｉ ４ ｂ ｖｎ ｅａ ａ ｌｓ ａ ｇ ｔｐｒ ｅｎ， ３ ｏ ｉ ｅ ｓ ｒ ｓ ｍｐ ｅ ｗｅｅ ｄ ｔ ｃｅ ｔ ｔｅ ｉ ｄｒ ｃ ＥＬ Ｓ ｒ ｅｅ ｔｄ ｗｉｈ ｈ ｎ ｉｅ ｔ Ｉ Ａ ａ ｓｙ． ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｗｅ ｔ ａ ｔ ｓａ Ｔｈ ｅｕ ｔ ｓ ｏ ｄ ｈ ｔ ｈｅ
建立一种用重组蛋白检测抗口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法
［ 摘
要 ］ 目的 ： 研究 以重组蛋 白作 为包 被抗 原检测 口蹄疫病毒 （ ＭＤ 感染后 的动物血 清 中特 异性抗体 的可能性 ， Ｆ Ｖ） 为
建 立 一 种 非 病 毒 颗 粒 的 Ｅ ＩＡ检 测 试 剂 盒 提 供 实 验依 据 。 方 法 ： 用 自行 构 建 表 达 的 Ｏ 型 口蹄 疫 病 毒 Ｖ １表 位 肽 重 组 蛋 白 ＬＳ 利 Ｐ
（ Ｐ ｅ ｉ作 为包 被抗 原 ， Ｖ １ｐ） 采用 间接 Ｅ ＩＡ方法 确定抗 原的最佳工作浓 度和包被 方法 ， ＬＳ 优化 各项实 验条件 ， 以 Ｆ Ｖ感 染后 并 ＭＤ
［ ｓｒｃ］ Ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｒｖ ｅｓｍ ｘ ｅ ｍ ｎ ａａ ｏ ｓ ｂｉ ｉｇａ ＬＳ ｉｗｔｏｔ ｉ ｓ ａｔ ｌ ａ ｏｔ ｇａｔ ｅ ． Ａｂｔ ｔ ａ ｊｃ ｖ ：ｏｐｏｉ ｏ ｅｅｐ ｒ ｅ ｔ ｔ ｆｒ ｔ ｌｈｎ ｎＥ ＩＡｋｔ ｉ ｕ ｒ ｒｃ ｓ ａｉ ｎｉ ｎ ｉ ｄ ｉ ｄ ｅａ ｓ ｈ ｖ ｕ ｐ ｉｅ ｃ ｎ ｇ
的 豚 鼠 血 清 作 为 标 准 阳性 血 清 确 定 Ｅ ＩＡ 方 法 的 特 异 性 和 灵 敏 度 。 结 果 ： Ｍ Ｖ 感 染 后 的 阳性 豚 鼠血 清 可 以 很 好 地 识 别 ＬＳ Ｆ Ｄ Ｖ １ｐ 重 组 蛋 白 ， 此 蛋 白包 被 检 测 抗 Ｆ Ｖ抗 体 的 灵 敏 度 可 达 １３２ ０ 并 证 明 所 检 测 的抗 体 是 Ｆ Ｖ 特 异 性 的 。 结 论 ： Ｐ ｅｉ 用 ＭＤ ： ０ ， ＭＤ Ｖ １ｐ 重 组 蛋 白可 以替 代 Ｆ Ｄ Ｐ ｅｉ Ｍ Ｖ颗 粒 用 于 建 立 检 测 抗 Ｆ Ｖ抗 体 的 Ｅ ＩＡ试 剂 盒 。 ＭＤ ＬＳ
211240635_口蹄疫病毒抗体SA-ELISA_快速检测方法的建立
畜牧兽医学报 2023,54(5):2020-2029A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.05.023开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):口蹄疫病毒抗体S A -E L I S A 快速检测方法的建立周广青1,2,刘晓庆2,史喜绢1,2,杨大鹏1,袁莉刚1*,常惠芸2*(1.甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,兰州730046)摘 要:旨在解决如何对现有方法进行优化创新以建立口蹄疫抗体检测新方法的问题,本研究在基于原有液相阻断E L I S A 的基础上进行方法优化,实现口蹄疫病毒抗体的快速㊁灵敏检测㊂本研究通过对抗口蹄疫I g G 抗体标记生物素技术与H R P 标记链霉亲和素(H R P -S A )相结合建立新的液相阻断E L I S A 检测方法(S A -L P B E ),在猪,牛㊁羊血清样品中具有较高的符合率㊂结合实际情况,判定优化后牛㊁羊血清抗体效价ȡ128,猪血清效价ȡ64时,判定为阳性,与商用检测试剂盒结果一致㊂并且经符合率分析,与原试剂盒具有92.3%的符合率,其批内变异系数<5%,批间变异系数<10%㊂该方法改变了原有的需要制备兔抗豚鼠抗血清再标记H R P 技术路线,根本上提高了酶促反应的效率,保证了方法原有敏感性的同时提高了方法的特异性;利用生物素标记抗体与H R P -S A 反应迅速㊁标记原料稳定㊁检测背景值等优点实现了将液相阻断E L I S A 试剂盒操作时间由2d 缩短为3h,解决了原有方法操作繁琐㊁用时过长㊁操作疲劳㊁不稳定㊁易出错等问题㊂建立的S A -L P B E 可应用于F M D V 抗体检测,为F M D 流行和临床检测提供了技术方法㊂关键词:口蹄疫病毒;液相竞争E L I S A ;E L I S A ;抗体检测;链霉亲和素中图分类号:S 855.3 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)05-2020-10收稿日期:2022-09-27基金项目:甘肃省动物生殖生理及繁殖调控重点实验室建设项目(20J R 10R A 563)作者简介:周广青(1978-),男,山东郓城人,博士生,主要从事动物传染病研究,E -m a i l :z h o u g u a n g q i n g@c a a s .c n *通信作者:袁莉刚,主要从事基础兽医学研究,E -m a i l :y u a n 2918@126.c o m ;常惠芸,主要从事动物传染病研究,E -m a i l :c h a n g h u i yu n@c a a s .c nE s t a b l i s h m e n t o f a R a pi d D e t e c t i o n S A -E L I S A M e t h o d f o r A n t i F o o t -a n d -M o u t h D i s e a s e V i r u s Z HO U G u a n g q i n g 1,2,L I U X i a o q i n g 2,S H I X i j u a n 1,2,Y A N G D a p e n g 1,Y U A N L i g a n g 1*,C H A N G H u i yu n 2*(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,G a n s u A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730070,C h i n a ;2.S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f V e t e r i n a r y E t i o l o g i c a l B i o l o g y ,O I E /N a t i o n a l F o o t -a n d -M o u t h D i s e a s e R e f e r e n c e L a b o r a t o r y ,L a n z h o u V e t e r i n a r y R e s e a r c h I n s t i t u t e ,C h i n e s e A c a d e m y o f A gr i c u l t u r a l S c i e n c e s ,L a n z h o u 730046,C h i n a )A b s t r a c t :I n o r d e r t o s o l v e t h e p r o b l e m o f h o w t o o p t i m i z e a n d i n n o v a t e t h e e x i s t i n g me t h o d s t o e s t a b l i s h a n e w m e t h o df o r F M D a n t i b o d y d e t e c t i o n ,t h i s s t u d y a i m e d t o o pt i m i z e t h e m e t h o d b a s e d o n l i q u i d p h a s e b l o c k i n g E L I S A t o a c h i e v e r a pi d a n d s e n s i t i v e d e t e c t i o n o f F M D v i r u s a n t i -b o d y .I n t h i s s t u d y ,a n o v e l l i q u i d p h a s e b l o c k i n g E L I S A m e t h o d (S A -L P B E )w a s e s t a b l i s h e d b yc o m b i n i n g t h e p u r i f i c a t i o n o f I g G l a b e l ed b i o t i n (d o l ph i n a n t i -f o o t -a n d -m o u t h d i s e a s e )f r o m g u i n e a p i g s e r u m w i t h H R P l a b e l e d s t r e p t a v i d i n (H R P -S A ).S A -L P B E h a s a h i g h c o n s i s t e n c yCopyright ©博看网. All Rights Reserved.5期周广青等:口蹄疫病毒抗体S A-E L I S A快速检测方法的建立r a t e i n b o v i n e a n d s h e e p s e r u m s a m p l e s.C o m b i n e d w i t h t h e a c t u a l s i t u a t i o n,t h e o p t i m i z e d s e r u m a n t i b o d y t i t e r o f c a t t l e a n d s h e e p w a s d e t e r m i n e d t o b eȡ128,a n d t h a t o f p i g s s e r u m s a m-p l e w a s d e t e r m i n e d t o b eȡ64.T h e r e s u l t s w e r e d e t e r m i n e d t o b e p o s i t i v e,w h i c h w a s c o n s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t s o f c o mm e r c i a l d e t e c t i o n k i t s.A n d a f t e r c o m p l i a n c e a n a l y s i s,i t h a s a c o m p l i a n c e r a t e o f92.3%w i t h t h e o r i g i n a l k i t,a n d t h e i n t r a-b a t c h v a r i a t i o n c o e f f i c i e n t i s l e s s t h a n5%,a n d t h e i n t e r-b a t c h v a r i a t i o n c o e f f i c i e n t i s l e s s t h a n10%.T h i s m e t h o d c h a n g e d t h e o r i g i n a l r o u t e o f p r e p a r i n g r a b b i t a n t i-g u i n e a p i g a n t i s e r u m a n d l a b e l i n g H R P,i m p r o v e d t h e e f f i c i e n c y o f e n z y m a-t i c r e a c t i o n,g u a r a n t e e d t h e o r i g i n a l s e n s i t i v i t y o f t h e m e t h o d a n d i m p r o v e d t h e s p e c i f i c i t y o f t h e m e t h o d;U s i n g t h e a d v a n t a g e s o f q u i c k r e a c t i o n b e t w e e n b i o t i n-l a b e l e d a n t i b o d y a n d H R P-S A, s t a b l e l a b e l i n g r a w m a t e r i a l a n d d e t e c t i o n b a c k g r o u n d v a l u e,t h e o p e r a t i o n t i m e o f l i q u i d p h a s e b l o c k i n g E L I S A k i t w a s s h o r t e n e d f r o m2d a y s t o3h o u r s,w h i c h s o l v e d t h e p r o b l e m s o f t e d i o u s, l o n g t i m e,o p e r a t i o n f a t i g u e,i n s t a b i l i t y a n d e r r o r-p r o n e o f t h e o r i g i n a l o p e r a t i o n.I t c a n b e a p p l i e d t o F M D V a n t i b o d y d e t e c t i o n,p r o v i d i n g a t e c h n i c a l m e t h o d f o r F M D e p i d e m i c a n d c l i n i c a l d e t e c t i o n.K e y w o r d s:f o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e v i r u s;l i q u i d-p h a s e b l o c k i n g E L I S A;e n z y m e-l i n k e d i mm u-n o s o r b e n t a s s a y;a n t i b o d y d i a g n o s i s;s t r e p t a v i d i n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:Y U A N L i g a n g,E-m a i l:y u a n2918@126.c o m;C H A N G H u i y u n,E-m a i l:c h a n g h u i y u n@c a a s.c n口蹄疫(f o o t a n d m o u t h d i s e a s e,F M D)是由口蹄疫病毒(f o o t a n d m o u t h d i s e a s e v i r u s,F M D V)引起的猪㊁牛㊁羊等偶蹄动物易感的一种急性㊁热性㊁高度接触性传染病[1],被感染动物多以在口腔黏膜㊁蹄部和乳房皮肤发生水泡性疹为主要临床特征,该病传播途径多㊁速度快,每次暴发均给当地的畜牧养殖业造成巨大经济损失[2]㊂世界动物卫生组织(O I E)将其列为必须申报的传染病,中国也将其列在一类动物传染病的首位[3]㊂口蹄疫病毒在全世界主要有7个血清型:O㊁A㊁亚洲1㊁C型及南非1㊁2㊁3型,疫苗免疫不能使各型之间交叉保护㊂现阶段中国主要针对O㊁A和亚洲1型口蹄疫病毒进行疫苗接种[4]㊂1986年,H a m b i n等[5]以V N T和液相E L I S A 试验原理建立了用于检测F M D V抗体的液相阻断E L I S A(l i q u i d p h a s e b l o c k i n g E L I S A,L P B E),由于在液相状态下,病毒抗原的中和表位完全处于自然状态,能与血清中的抗体进行充分的反应,因而L P B E具有更好的重复性和可靠性[6-7]㊂液相阻断E L I S A检测口蹄疫病毒抗体是世界动物卫生组织(O I E)和国际贸易中指定的参考方法,也是中国用于口蹄疫病毒疫苗免疫效果评价及流行病学调查的推荐方法[8]㊂世界口蹄疫参考实验室(P i r b r i g h t L a b o r a t o r y)及国内外口蹄疫参考实验室推荐的口蹄疫病毒液相阻断E L I S A抗体检测试剂盒虽然具有灵敏㊁准确等优点,但均存在试验操作繁琐㊁用时长㊁不易保存等问题,极大地影响了操作人员的愉悦感,给产品的推广及使用都带来了不便,尤其是在缺乏专业技术人员的企业中的推广阻力较大,操作过程中容易出错,抗原保存不稳定导致试剂盒的保存稳定性差[9-10]㊂解决这些根本问题的关键是要对操作体系和反应过程进行理论和实践结合的创新㊂为了在试验中节省时间,可以从提高反应的灵敏度开始㊂目前,研究人员在检测方法中已经使用了多种发光或荧光材料来提高灵敏度[11-15],但这些材料主要是光敏材料,并且操作过程需要避光才能完成,造成许多不便㊂链霉亲和素(s t r e p t a v i d i n,S A)可以标记半抗原㊁抗原㊁抗体㊁辣根过氧化物酶(H R P)或发光材料[16],它可以结合四个生物素分子,使更多的H R P 酶分子能够催化底物反应,从而改善免疫分析中的信号传递[17]㊂特别是在小分子检测方面,基于S A-生物素扩增系统的E L I S A在分析真菌毒素和兽药残留方面表现出比传统E L I S A更高的灵敏度和准确性[18]㊂新操作程序和试剂盒生产工艺的改进应提高试剂盒操作的便利性以及试剂盒保存的稳定性和检测性,以确保经典方法的原始灵敏度和特异性㊂本研究利用S A和生物素的高亲和力,建立了更快捷的L P B E检测方法㊂如图1所示,作者将S A 标记抗体,使S A-H R P更易被捕获,整体提升了1202Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜牧兽医学报54卷L P B E的灵敏度,进而减少了反应所需时间㊂结果表明,S A-L P B E在实现更快速检测的同时,还保持了传统L P B E的准确性㊂因此该项工作为口蹄疫的诊断与防控提供了快速简便的免疫学检测方法㊂图1S A-L P B E检测示意F i g.1S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f S A-L P B E f o r d e t e c t i o n1材料与方法1.1血清样本来源于牛的O型口蹄疫抗体阳性标准血清:使用口蹄疫灭活疫苗对牛进行免疫,首次免疫后第30天加强免疫一次,二免2周后采血以获得高免血清㊂经口蹄疫O型抗体液相阻断E L I S A检测试剂盒(兰州兽医研究所)测定为阳性㊂以此血清抗体效价结果为参照,依次确定各试剂的工作浓度㊂口蹄疫抗体阴性血清:从未接触口蹄疫疫苗的临床健康猪和牛中各自分别采集15份血清,这些血清使用O-L P B E和A-L P B E测试,结果均为阴性,滴度<1ʒ4㊂来源于不同动物的O型口蹄疫抗体阳性血清:采自由灭活疫苗免疫动物的血清共60份(牛20份,羊20份,猪20份),经O-L P B E测试结果为阳性㊂30份田间牛血清,30份田间羊血清,30份田间猪血清,这些血清用于评估诊断性能并比较与O-L P B E的符合率㊂1份亚洲1型口蹄疫灭活疫苗免疫牛的血清,1份A型口蹄疫灭活疫苗免疫牛的血清,这些血清用于与O-L P B E原来的操作方法作平行检测㊂1.2实验动物2.0k g左右的健康新西兰大白兔和200g左右的健康豚鼠,购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心㊂1.3F M D V抗原浓缩及冻干将适量体积的口蹄疫病毒灭活疫苗(O/M y a98株)加入8%P E G6000㊁4%N a C l,4ħ搅拌4h后4~8ħ静置过夜,500m L离心管6000r㊃m i n-1离心60m i n弃去上清,继续加入未离心抗原进行离心,抗原量大时重复以上操作,最后用p H7.6的0.01m o l㊃L-1P B S悬浮离心管内的抗原沉淀,定容至原抗原体积的1/50,加入对等体积预冷的三氯乙烯进行乳化并离心脱脂,吸取抗原层液体,加入5%海藻糖,0.01%P r o c l i n300防腐剂,分装冻干,贴签,于4ħ保存㊂1.4F M D V146S抗原制备取适量浓缩冻干后的抗原液融于P B S中,45000r㊃m i n-1,4ħ超速离心1h,将离心管底壁的沉淀用P B S重悬至2m L,经蔗糖密度梯度(45%㊁35%㊁25%㊁15%)35000r㊃m i n-1离心2.5h,按0.5m L取样并合并同一级峰,并经260n m紫外分光光度仪检测,收集含口蹄疫病毒完整病毒粒子146S抗原的吸收峰(第二峰)并合并㊂1.5抗口蹄疫病毒血清制备将纯化的146S抗原与等量的完全弗氏佐剂乳化后对新西兰大白兔和豚鼠进行免疫以分别制备抗口蹄疫病毒血清,兔的免疫方式为背部两侧皮下多点注射,每只60μg㊂豚鼠采用腹股沟内皮下注射, 2202Copyright©博看网. All Rights Reserved.5期周广青等:口蹄疫病毒抗体S A-E L I S A快速检测方法的建立每只30μg,均于免疫后第30天采血并分离血清,分装后于-70ħ冻存㊂1.6O型豚鼠抗口蹄疫病毒血清I g G纯化及生物素化标记免疫制备的O型豚鼠抗口蹄疫病毒血清使用P r o t e i n A亲和层析纯化,获得豚鼠血清I g G㊂将豚抗I g G用0.1m o l㊃L-1碳酸氢钠缓冲液(p H8.0)稀释至1m g㊃m L-1,每次标记量为1~2.5m L,在透析袋内互作,将待生物素化的豚抗I g G加入透析袋(MW C O8000)置于0.1m o l㊃L-1碳酸氢钠缓冲液(p H8.0)充分透析;每毫克蛋白加入120μL浓度为1m g㊃m L-1的N H S B(N-羟基琥珀酰亚胺生物素)溶液(即用1m L D M S O溶解1m g N H S B),室温下搅拌2~4h,加入9.6μL1m o l㊃L-1N H4C l (每25μg N H S B加1μL),在室温下搅拌10m i n㊂用p H7.2的0.01m o l㊃L-1缓冲体系除去游离的生物素,吸取袋内标记物,加入50%甘油,0.01%P r o-c l i n300,分装,-70ħ冻存㊂1.7建立S A-L P B E检测方法用兰州兽医研究所提供的商品化口蹄疫O型F M D V液相阻断E L I S A检测试剂盒对兔抗口蹄疫病毒血清测定㊂同时设置O型F M D V阳性血清对照㊁A型及亚洲1型F M D V高免血清对照㊂使用P B S将兔抗血清稀释,以不同浓度(1ʒ50~ 1ʒ400)每孔50μL加入96孔E L I S A板中㊂封板膜封板,4ħ过夜㊂使用P B S T洗涤E L I S A板5次并拍干待用㊂在U型孔底的载体反应板上,将F M D 阴性(N)㊁阳性(P)血清使用P B S T进行连续稀释(1ʒ2~1ʒ32),每孔60μL,紧接着所有孔内加入60μL不同稀释浓度(1ʒ50~1ʒ400)的O型口蹄疫病毒抗原,每块反应板均设置至少4孔病毒抗原对照,最终E L I S A反应板内液体量均为120μL㊃孔-1,封板膜封板,震荡,37ħ孵育90m i n㊂将U型板中100μL作用充分的抗原抗体混合物移置E L I S A兔抗口蹄疫血清包被板上,37ħ孵育10~60m i n㊂使用P B S T洗板5次并拍干,加入豚抗I g G-生物素抗体工作液,100μL㊃孔-1,37ħ孵育10~60m i n㊂同上洗板并拍干,加入酶标链霉亲和素(H R P-S A)工作液,100μL㊃孔-1,37ħ孵育10~60m i n㊂同上洗板5次,拍干后加入T M B底物溶液,50μL㊃孔-1,37ħ孵育15m i n后再每孔加入50μL的1.25% H2S O4终止反应,酶标仪450n m波长下读取吸光值㊂1.8最佳反应时间的优化使用标准阳性血清㊁阴性血清确定最佳反应时间,其中,标准血清与商用试剂盒采用相同稀释度, n=5,对各反应条件下的标准阳性阻断率进行对比分析,取阻断率最大的稀释度为最佳反应条件㊂阻断率=1-样品或标准阳性血清O D值/标准阴性血清O D值1.9S A-L P B E临界值的确定以病毒抗原的O D平均值的50%作为病毒抗原被阻断50%的临界值㊂将阴性㊁阳性对照血清和被检血清相应孔的O D值与临界值相比较,血清抗体效价即为该份血清稀释孔O D值略高于临界值与略低于临界值孔对应的抗体滴度的平均值㊂用原L P B E试剂盒的方法确认了20份牛F M-D V抗体阳性血清㊁45份牛F M D V抗体阴性血清㊁20份羊抗体阳性血清㊁20份猪F M D V抗体阳性血清和15份猪F M D V抗体阴性血清,使用本研究中开发的S A-L P B E测试了这些血清样品㊂当特异性和灵敏度的百分比通过接收器操作特征曲线(R O C)分析达到最大值时,确定临界值㊂1.10符合性分析O型F M D V灭活抗原免疫动物血清60份(牛20份㊁羊20份㊁猪20份),亚洲1型F M D V灭活免疫牛血清1份,A型F M D V灭活抗原免疫牛血清1份㊂它与L P B E试剂盒的原始操作方法并行进行测试㊂1.11重复性试验重复性试验包括批间重复试验和批内重复试验,以评估改进L P B E方法的重现性㊂使用不同批次包被的E L I S A板做批间重复试验,同批次不同E L I S A板做批内重复试验㊂并计算批间和批内的变异系数(C V)㊂2结果2.1豚鼠和兔抗口蹄疫病毒血清I g G纯化对纯化的抗F M D V多克隆血清进行S D S-P A G E分析㊂结果如图2所示,纯化的多克隆血清主要有两条带,一条重链45k u,一条轻链25k u㊂图2条带中1和3分别为兔和豚鼠未纯化的多克隆血清,2和4为对应纯化后的条带㊂2.2建立S A-L P B EO型口蹄疫阳性血清抗体效价经液相阻断E L I S A方法检测确定为720(512~1024),作为3202Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜 牧 兽 医 学 报54卷M.蛋白质相对分子质量标准;1.兔抗血清;2.纯化后的兔抗血清;3.豚鼠抗血清;4.纯化后的豚鼠抗血清M.P r o t e i n m a r k e r ;1.R a b b i t a n t i -F M D V s e r u m ;2.T h ep u r i f i e d o f t h e r a b b i t s e r u m ;3.G u i n e a p i g a n t i -F M D V s e r -u m ;4.T h e p u r i f i e d o f t h e g u i n e a p i g s e r u m 图2 电泳分析多克隆血清I g G 纯化结果F i g .2 S D S -P A G E a n a l y s i s o f p u r i f i e d s e r u m p o l y c l o n a l I gG S A -L P B E 的阳性对照血清,其抗体效价同样控制在720(512~1024),此时反应条件如表1所示㊂优化各组分的浓度㊂在S A -L P B E 中,兔抗146S 血清的工作稀释度为1ʒ1000,病毒抗原稀释度为1ʒ1000,生物素标记豚鼠抗146S 血清的稀释度为1ʒ1000,H R P -S A 稀释浓度为1ʒ1000㊂2.3 反应时间优化依照商业L P B E 工艺方法,使用标准阳性血清㊁阴性血清计算阻断率将各反应时间优化,阻断率越大,为最佳反应时间㊂如表1所示,移板后反应时间选取30m i n ,抗血清反应时间选取30m i n ,H R P 反应时间选取10m i n ,优化后的S A -L P B E 工艺方法路线如图1和图3所示,反应时间明显缩短㊂此反应条件下,测定的F M D V A 型和亚洲1型高免阳性血清抗体滴度均不超过64,4孔病毒抗原O D 值为1.0~2.0㊂表1 S A -L P B E 各反应时间阻断率统计表结果T a b l e 1 T h e s t a t i s t i c s o f s t a n d a r d p o s i t i v e s e r u m P I o f d i f f e r e n t r e a c t i o n c o n d i t i o n s反应时间R e a c t i o n t i m eS A -L P B E商用试剂盒C o mm e r c i a l r e a ge n t k i t 移板后反应时间/m i n60301530303030303060抗血清反应时间/m i n 60606030153030303060H R P 结合时间/m i n6060606060301510560阻断率B l o c k i n g r a t e 0.8310.8130.5970.8160.8180.8190.8120.8030.7150.791图3 S A -L P B E 操作方法流程图F i g .3 S A -L P B E o pe r a t i o n m e t h o df l o w c h a r t 4202Copyright ©博看网. All Rights Reserved.5期周广青等:口蹄疫病毒抗体S A-E L I S A快速检测方法的建立2.4临界值的确定使用S A-L P B E共测试分析了191份牛(30份阳性血清,101份阴性血清)㊁羊(22份阳性血清,38份阴性血清)血清样品㊂结果如图4a所示,当临界值为96时,特异性值和敏感性值分别为97.84%和100%,当临界值为192时,特异性值和敏感性值分别为100%和96.15%,R O C曲线下面积为0.999 (标准差=0.00049,95%,0.9986~1.0005),因此结合实际情况,判断优化后的牛羊血清抗体效价ȡ128时,为抗体阳性,与原商用试剂盒相同㊂使用S A-L P B E共测试分析了猪61份阳性血清样本,90份阴性血清样本,结果如图4b显示,当临界值为64时,特异性值和敏感性值均为100%,故猪血清抗体效价ȡ64时,判断为阳性,与商用试剂盒结果相同㊂a.牛㊁羊S A-L P B E样本(0.阴性血清样本,n=139;1.阳性血清样本,n=52),R O C曲线上的每个点代表一个敏感性-特异性对;b.猪样本(0.阴性血清样本,n=90;1.阳性血清样本,n=61);A U C.曲线下的面积a.C a t t l e a n d s h e e p s a m p l e s i n S A-L P B E(0.N e g a t i v e s e r u m s a m p l e s,n=139;1.P o s i t i v e s e r u m s a m p l e s,n=52),e a c h p o i n t o n t h e R O C c u r v e r e p r e s e n t s a s e n s i t i v i t y-s p e c if i c i t y p a i r;b.S w i n e s a m p l e s(0.N eg a t i v e s e r u m s a m p l e s,n=90;1.P o s i t i v e s e r u m s a m p l e s,n=61);A U C.A r e a u n d e r t h e c u r v e图4采用交互点图和R O C分析确定S A-L P B E的临界值F i g.4I n t e r a c t i v e d o t d i a g r a m a n d R O C a n a l y s i s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e c u t o f f v a l u e o f S A-L P B E2.5符合性试验使用92份血清评估S A-L P B E与原方法的一致性,结果如表2所示,在60份免疫过灭活疫苗的猪㊁牛㊁羊血清中,只有一份牛血清样本与原方法结果不一致㊂在标准阴性血清中,只有一份牛阴性血清与原方法不一致㊂其余样本均符合㊂在田间的90份样品中,有5份样品与原L P B E方法结果不同,整体符合率为92.3%㊂并且使用S A-L P B E与原方法对免疫后动物血清阻断值作图比较,差异较小,详见图5㊂2.6批间与批内重复性测试各检测6种血清样本,如表3所示,S A-L P B E 批内变异系数均<5%,批间变异系数均<10%,表明所建立的方法重复性良好㊂5202Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜 牧 兽 医 学 报54卷表2 S A -L P B E 与原L P B E 方法符合率分析T a b l e 2 C o m p l i c i t y r a t e a n a l y s i s o f S A -L P B E a n d t h e o r i gi n a l L P B E m e t h o d 样品来源S a m pl e s o u r c e 样品总数T o t a l N o .o f s a m pl e s 诊断性能D i a gn o s t i c p e r f o r m a n c e L P B ES A -L P B E阳性P o s i t i v e 阴性N e ga t i v e 阳性P o s i t i v e阴性N e ga t i v e O 型灭活疫苗免疫猪血清(O /M y a 98/2010)S e r a f r o m p i g s i mm u n i z e d w i t h i n a c t i v a t e d t y pe O F M D V v a c c i n e (O /M ya 98/2010)202020(20)0O 型灭活疫苗免疫牛血清(O /M ya 98/2010)S e r a f r o m c a t t l e i mm u n i z e d w i t h i n a c t i v a t e dt y p e O F M D V v a c c i n e (O /M ya 98/2010)2020019(19)1(0)O 型灭活疫苗免疫羊血清(O /M ya 98/2010)S e r a f r o m s h e e p imm u n i z e d w i t h i n a c t i v a t e d t y p e O F M D V v a c c i n e (O /M ya 98/2010)2020020(20)0亚洲1型灭活疫苗免疫牛血清S e r a f r o m c a t t l e i mm u n i z e d w i t h i n a c t i a t e dA s i a l 1F M D V v a c c i n e10101A 型灭活疫苗免疫牛血清S e r a f r o m c a t t l e i mm u n i z e d w i t h i n a c t i v e d t y pe A F M D V v a c c i n e10101标准猪阴性血清S t a n d a r d p i g n e ga t i v e s e r a 15015015(15)标准牛阴性血清S t a n d a r d c a t t l e n e ga t i v e s e r a 150151(0)14(14)田间牛血清C a t t l e f i e l d s e r a30131711(10)19(18)田间羊血清S h e e p fi e l d s e r a 30201020(17)10(7)田间猪血清P i g fi e l d s e r a 3028228(27)2(1)符合率/%C o i n c i d e n c e r a t e92.3图5 S A -L P B E 与原方法L P B E 对免疫后动物血清符合率评价F i g .5 E v a l u a t i o n o f t h e s e r u m c o m pl i a n c e r a t e o f S A -L P B E a n d t h e o r i g i n a l m e t h o d L P B E f o r p o s t -i m m u n e a n i -m a l s3 讨 论O I E 推荐的F M D V 检测方法包括病毒分离㊁核酸检测㊁补体结合试验和间接夹心E L I S A ㊂病毒分离是检测口蹄疫病毒的金标准㊂但病毒分离耗时长㊁难度大㊁需要实验室专业人员操作,且分离效果取决于样本质量,因此其应用受到限制㊂补体结合试验可以作为病原体的检测方法㊂这是最早用于病毒血清型鉴定的方法㊂然而,该方法仅适用于检测水泡上皮和新鲜的水泡样本;对样本的质量要求相对较高[9]㊂核酸检测方法发展得多种多样,如R T -P C R ㊁R T -L AM P ㊁R P A 等[9]㊂该技术具有高灵敏度和快速性,但对操作人员,操作环境要求较高,易污染[19-21]㊂E L I S A 是1972年用于定量和定性分析的方法,是放射免疫分析技术的改进版本[22-23]㊂E L I S A 是检测口蹄疫病毒最常用的方法之一[9]㊂最初,人们使用E L I S A 方法来鉴定病毒血清型㊂后来利用该技术进行抗原表位的分析和突变株分离[5,24-25]㊂L P B E 是国际公认的标准化诊断方法㊂该方法可用于检测F M D V 感染,并可用于检测动物6202Copyright ©博看网. All Rights Reserved.5期周广青等:口蹄疫病毒抗体S A-E L I S A快速检测方法的建立表3S A-L P B E批内㊁批间重复性测试T a b l e3I n t r a-,i n t e r-b a t c h r e p r o d u c i b i l i t y t e s t o f S A-L P B E重复性试验R e p r o d u c i b i l i t y t e s t样品S a m p l e抗体滴度A n t i b o d y t i t e r123x-ʃs变异系数(C V)/%C o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n批内重复性测试I n t r a-b a t c hr e p r o d u c i b i l i t y t e s t #12.8572.7092.7092.758ʃ0.0702.53 #22.4082.5562.4082.457ʃ0.0702.84 #32.5562.5562.7092.607ʃ0.0722.77 #42.1072.2552.1072.206ʃ0.0703.16 #52.4082.5562.4082.458ʃ0.0702.84 #62.4082.2552.2552.206ʃ0.0723.27批间重复性测试I n t e r-b a t c hr e p r o d u c i b i l i t y t e s t #72.7093.0102.5562.759ʃ0.1896.84 #82.4082.5562.7092.558ʃ0.1234.80 #92.8572.7092.8572.808ʃ0.0702.49 #103.0112.7093.0102.910ʃ0.1424.88 #112.8573.0102.7092.859ʃ0.1234.30 #122.5562.4082.5562.507ʃ0.0702.78免疫状态和疫苗耐药性的评估㊂由于L P B E测定抗体是直接用最自然的146S时的抗原构象,因此其重现性更好,结果更准确,但这种方法耗时长,限制了其在检测中的应用[26]㊂生物素与S A的结合是自然界已知的最有效的非共价相互作用之一[27]㊂生物素-S A复合物能够抵抗恶劣环境,如有机溶剂㊁蛋白水解酶以及极端温度和p H[28]㊂因此,该系统可广泛应用于分子生物学和生物纳米技术㊂在免疫检测系统中,链霉亲和素通常直接固定在传感器芯片㊁磁珠㊁电极等上㊂然而,这些方法通常需要高质量的材料和仪器㊂S A 与生物素的结合在某些E L I S A检测应用中表现出潜力㊂Y a n g等[29]开发了一种新的竞争性夹心免疫分析方法,使用改良的生物素-链霉亲和素系统与多聚赖氨酸耦合,灵敏准确地检测组胺㊂Y a n等[30]通过使用生物素化纳米体N b26和链霉亲和素共轭聚合过氧化辣根(S A-P o l y H R P),开发了一种生物素-链霉亲和力放大E L I S A,用于灵敏快速检测谷物中的黄曲霉毒素B1(A F B1)㊂为了快速㊁经济㊁准确地检测F M D V,作者选择用生物素修饰一级抗体(图1)㊂它在L P B E检测方法中发挥了优势㊂S A的高结合性能,使原来与I g G 结合反应时间为1h缩短为10m i n,并且使移板反应时间和抗血清反应时间缩短为原来的一半,从而大大减少了L P B E的操作时间,经过田间采集血清及标准血清的测试,该方法有较高的符合率㊂并且生物素标记抗体标记原料稳定㊁检测背景值低,使其具有较高的经济实用优点,并且还解决了猪血清中检测容易发生的倒置现象,避免了对试验结果抗体效价的误判㊂本研究的S A-L P B E试剂盒率先突破了L P B E 试剂盒的原理㊂克服L P B E原始方法的高昂成本,且易导致人员测试失败的缺点㊂保持经典技术固有的敏感性和特异性,提高产品的稳定性,使F M D V L P B E试剂盒的操作和生产过程更加完善㊂本研究的创造性方案解决了F M D V L P B E抗体检测试剂盒的操作步骤多㊁稳定性差㊁易腐蚀以及猪血样本清洗等问题㊂建立的S A-E L I S A方法使试剂盒操作方便㊁省时㊁易于生产,保持了灵敏度㊁特异性,并简化了经典工艺的使用周期,从而提高了产品质量,提高了经济效益,降低了成本和试剂盒操作员的工作负担,增加了使用者的乐趣,这有利于扩展F M D V S A-E L I S A试剂盒推广应用㊂4结论基于生物素标记抗体技术和H R P-S A,建立了一种新的快速检测口蹄疫病毒抗体的E L I S A方法(S A-E L I S A)㊂该方法适用于F M D V免疫抗体监测㊁疫苗免疫效果评估㊁流行病学调查和免疫指导的持续技术支持㊂7202Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜牧兽医学报54卷参考文献(R e f e r e n c e s):[1] D OM I N G O E,B A R A N OW S K I E,E S C A R M I S C,e t a l.F o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e v i r u s[J].C o m p a r a tI mm u n o l M i c r o b i o l I n f e c t D i s,2002,25(5-6):297-308.[2] R O D R I G U E Z L L,G A Y C G.D e v e l o p m e n t o fv a c c i n e s t o w a r d t h e g l o b a l c o n t r o l a n d e r a d i c a t i o n o ff o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e[J].E x p R e v V a c c,2011,10(3):377-387.[3] L U Z,C A O Y,B A O H,e t a l.T e c h n i q u e sd e v e l o p e d i n C h i n a f o r f o o t-a n d-m o u t h d i s e a s ed i a g n o s i s[J].T r a n s b o u n d E me r g D i s,2008,55(5-6):196-199.[4] Z HU Z,Y A N G F,H E J,e t a l.F i r s t d e t e c t i o n o ff o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e v i r u s O/M E-S A/I n d2001i nC h i n a[J].T r a n s b o u n d E m e r gD i s,2018,65(6):2027-2031.[5] HAM B L I N C,B A R N E T T I T R,H E D G E R R S.An e w e n z y m e-l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y(E L I S A)f o r t h e d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s ag a i n s t f o o t-a n d-m o u t hd i se a s e v i r u s I.D e v e l o p m e n t a n d m e t h o d of E L I S A[J].J I mm u n o l M e t h o d s,1986,93(1):115-121.[6] V A N MA A N E N C.A c o m p l e x-t r a p p i n g-b l o c k i n g(C T B)E L I S A,u s i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a n dd e t e c t i n g s p e c i f i c a l l y a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t f o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e t y p e s A,O a n d C I I.A p p l i c a t i o n[J].V e t M i c r o b i o l,1990,24(2):179-191. [7] HAM B L I N C,K I T C H I N G R P,D O N A L D S O N AI,e t a l.E n z y m e-l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y(E L I S A)f o r t h e d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s a g a i n s t f o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e v i r u s:I I I.E v a l u a t i o n o f a n t ib o d i e sa f t e r i n f e c t i o n a n d v a c c i n a t i o n[J].E p i d e m i o l I n f e c t,1987,99(3):733-744.[8] D I N G Y Z,C H E N H T,Z HA N G J,e t a l.A no v e r v i e w o f c o n t r o l s t r a t e g y a n d d i a g n o s t i c t e c h n o l o g yf o r f o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e i n C h i n a[J].V i r o l J,2013,10:78.[9] WO N G C L,Y O N G C Y,O N G H K,e t a l.A d v a n c e s i n t h e d i a g n o s i s o f f o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e[J].F r o n t V e t S c i,2020,7:477.[10] C HÉN A R D G,M I E D E MA K,MO O N E N P,e t a l.A s o l i d-p h a s e b l o c k i n g E L I S A f o r d e t e c t i o n o f t y p e Of o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e v i r u s a n t i b o d i e s s u i t a b l e f o rm a s s s e r o l o g y[J].J V i r o l M e t h o d s,2003,107(1):89-98.[11] L I C,Y A N G Y C,WU D,e t a l.I m p r o v e m e n t o fe n z y m e-l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a yf o r t h em u l t i c o l o r d e t e c t i o n o f b i o m a r k e r s[J].C h e m S c i,2016,7(5):3011-3016.[12] WU J,C H E N Y P,Y A N G M Z,e t a l.S t r e p t a v i d i n-b i o t i n-p e r o x i d a s e n a n oc o m p l e x-a m p l i f i e dm i c r o f l u i d i c s i mm u n o a s s a y s f o r s i m u l t a n e o u sd e t e c t i o n o f i n f l a mm a t o r y b i o m a r k e r s[J].A n a l y tC h i m A c t a,2017,982:138-147.[13] S H E N P,L I W,L I U Y,e t a l.H i g h-t h r o u g h p u t l o w-b ac k g r o u nd G-q u a d r u p le x a p t a m e r c h e m i l u m i n e s c e n c ea s s a y f o r o c h r a t o x i n a u s i n g a s i n g l e p h o t o n i c c r y s t a lm i c r o s p h e r e[J].A n a l y t C h e m,2017,89(21):11862-11868.[14] WA N G C H,N E S T E R O V E E.A m p l i f y i n gf l u o r e s c e n t c o n j ug a t e d p o l y m e r s e n s o r f o r s i n g l e to x y g e n d e t e c t i o n[J].C h e m C o mm u n,2019,55(61):8955-8958.[15] D I N G S Y,HU H L,Y U E X L,e t a l.A f l u o r e s c e n tb i o s e n s o r b a s e d o n q u a n t u m d o t-l a b e l e d s t r e p t a v i d i na n d p o l y-L-l y s i n e f o r t h e r a p i d d e t e c t i o n o fS a l m o n e l l a i n m i l k[J].J D a i r y S c i,2022,105(4):2895-2907.[16] F A N G Z Y,J I A N G B S,WU W,e t a l.E L I S Ad e t e c t i o n o f s e m i c a r b a z i d e b a s e d o n a f a s t s a m p l ep r e t r e a t m e n t m e t h o d[J].C h e m C o mm u n,2013,49(55):6164-6166.[17] L I N Z,WA N G X,L I Z J,e t a l.D e v e l o p m e n t o f as e n s i t i v e,r a p i d,b i o t i n-s t r e p t a v i d i n b a s e dc h e m i l u m i n e s c e n t e n z y m e i mm u n o a s s a y f o r h u m a nt h y r o i d s t i m u l a t i n g h o r m o n e[J].T a l a n t a,2008,75(4):965-972.[18] S U N Z C,WA N G X R,T A N G Z W,e t a l.D e v e l o p m e n t o f a b i o t i n-s t r e p t a v i d i n-a m p l i f i e dn a n o b o d y-b a s e d E L I S A f o r o c h r a t o x i n A i n c e r e a l[J].E c o t o x i c o l E n v i r o n S a f,2019,171:382-388.[19] P I N H E I R O-D E-O L I V E I R A T F,F O N S E C A A AJ R,C AMA R G O S M F,e t a l.D e v e l o p m e n t o f ad r o p le t d i g i t a l R T-P C Rf o r t h e q u a n t i f i c a t i o n o f f o o t-a n d-m o u t h v i r u s R N A[J].J V i r o l M e t h o d s,2018,259:129-134.[20] B A T H C,S C O T T M,S HA R MA P M,e t a l.F u r t h e r d e v e l o p m e n t o f a r e v e r s e-t r a n s c r i p t i o n l o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(R T-L AM P)a s s a yf o r t h e d e t e c t i o n o f f o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e v i r u s a n dv a l i d a t i o n i n t h e f i e l d w i t h u s e o f a n i n t e r n a l p o s i t i v ec o n t r o l[J].T r a n s b o u nd E me r g D i s,2020,67(6):2494-2506.8202Copyright©博看网. All Rights Reserved.5期周广青等:口蹄疫病毒抗体S A-E L I S A快速检测方法的建立[21] L I U L B,WA N G J F,Z HA N G R X,e t a l.V i s u a la n d e q u i p m e n t-f r e e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n r e c o mb i n a s ep o l y m e r a s e a m p l i f i c a t i o n m e t h o d f o r r a p i d d e t e c t i o no f f o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e v i r u s[J].B M C V e t R e s,2018,14(1):263.[22] E N G V A L L E,P E R L MA N N P.E n z y m e-l i n k e di mm u n o s o r b e n t a s s a y,E l i s a.3.Q u a n t i t a t i o n o fs p e c i f i c a n t i b o d i e s b y e n z y m e-l a b e l e d a n t i-i mm u n o g l o b u l i n i n a n t i g e n-c o a t e d t u b e s[J].JI mm u n o l,1972,109(1):129-135.[23] C O O N S A H,C R E E C H H J,J O N E S R N.I mm u n o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f a n a n t i b o d y c o n t a i n i n g af l u o r e s c e n tg r o u p[J].P r o c S o c E x p B i o l M e d,1941,47(2):200-202.[24] A L E X A N D E R S E N S,Z HA N G Z,D O N A L D S O N AI,e t a l.T h e p a t h o g e n e s i s a n d d i a g n o s i s o f f o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e[J].J C o m p a r a t P a t h o l,2003,129(1):1-36.[25] S O R E N S E N K J,MA D E K U R O Z WA R L,D AW EP.F o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e:d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s i nc a t t l e s e r a b y b l o c k i n g E L I S A[J].V e t M i c r o b i o l,1992,32(3-4):253-265.[26] T E K L E G H I O R G H I S T,W E E R D M E E S T E R K,V A N H E M E R T-K L U I T E N B E R G F,e t a l.C o m p a r i s o n o f t e s t m e t h o d o l o g i e s f o r f o o t-a n d-m o u t hd i se a s e v i r u s s e r o t y p e A v a c c i n e m a t c h i n g[J].C l i nV a c c I mm u n o l,2014,21(5):674-683. [27] G R E E N N M.A v i d i n[J].A d v P r o t e i n C h e m,1975,29:85-133.[28] L I S Z K A M J,C L A R K M E,S C HN E I D E R E,e t a l.D e v e l o p i n g e n z y m e s t h a t f u n c t i o n u n d e r e x t r e m ec o nd i t i o n s[J].A n n Re v C h e m B i o m o l E n g,2012,3:77-102.[29] Y A N G F F,X U L,D I A S A C P,e t a l.A s e n s i t i v es a n d w i c h E L I S A u s i n g a m o d i f i e d b i o t i n-s t r e p t a v i d i na m p l i f i e d s y s t e m f o r h i s t a m i n e d e t e c t i o n i n f i s h,p r a w n a n d c r a b[J].F o o d C h e m,2021,350:129196.[30] Y A N T T,Z HU J,L I Y,e t a l.D e v e l o p m e n t o f ab i o t i n y l a t e d n a n o b o d y f o r s e n s i t i v e d e t ec t i o n o fa f l a t o x i n B1i n c e r e a l v i a E L I S A[J].T a l a n t a,2022,239:123125.(编辑白永平)9202Copyright©博看网. All Rights Reserved.。
犊牛冠状病毒和轮状病毒间接ELISA诊断方法的建立与初步应用
犊牛冠状病毒和轮状病毒间接ELISA诊断方法的建立与初步应用犊牛冠状病毒和轮状病毒间接ELISA诊断方法的建立与初步应用摘要：犊牛冠状病毒（Bovine Coronavirus，BCoV）和轮状病毒（Rotavirus，RV）是引起牛犊腹泻的主要病原。
本研究旨在建立一种高效可靠的间接酶联免疫吸附测定法（indirect enzyme-linked immunosorbent assay，indirect ELISA）用于检测和鉴定BCoV和RV的抗体水平，为疾病的预防和控制提供依据。
通过对标准样品的测试和实际样品的验证，该方法具有较高的灵敏度和特异性，并且能够在大规模应用中提供准确的结果。
1. 引言犊牛腹泻是导致牛犊死亡率和产肉性能下降的重要因素之一，其主要致病原为BCoV和RV。
由于两种病毒的临床症状相似，传统方法往往不能准确区分引起腹泻的病原体，因此需要建立一种高效、准确的诊断方法。
2. 材料和方法2.1. 实验材料本实验所使用的标准品来自BCoV和RV感染阳性牛血清样品，阴性对照为健康牛血清样品。
实验室准备了相应的兔抗BCoV和RV的抗体。
2.2. 间接ELISA方法建立将标准品、阳性和阴性对照样品的血清稀释至一定浓度，分别加入底物包被的微孔板中，孵育一定时间后，加入兔抗BCoV和RV的抗体，再加入辣根过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白素。
通过洗涤和底物反应，光学密度（OD）在450nm波长下测定，计算并比较阳性对照与阴性对照差值。
3. 结果与讨论在建立的间接ELISA方法中，通过对标准样品的测试，得出了BCoV和RV的阴性对照与阳性对照的差值。
在应用该方法检测实际样品时，结果与病毒PCR检测方法进行了比较。
结果表明，该间接ELISA方法的阳性率和阴性率均高于PCR方法，具有更高的特异性和敏感性。
4. 结论本研究建立了一种高效可靠的间接ELISA诊断方法，用于检测和鉴定BCoV和RV的抗体水平。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
敏 感性 高 ， 始模板 的检 出下 限均 达到 １ ｌ ｏ ｉｓＩ 特 异性 强 ， 增 产物 形 成 单一 的特 异 性熔 解峰 ； 初 ｘ ０ ｃｐｅ ｘ ／ Ｌ； 扩 重 复性 好 ． 内与组 间的 变异 系数 均 小于 ３ 组 ％。应 用所 建立 的方 法对猪 繁 殖与 呼吸 综合征 病毒 （ＲＲＳ ） 染仔 Ｐ Ｖ感 猪 外周血 单 个核 细胞 （Ｂ Ｐ ＭＣ） Ｉ一 、 一 中 Ｌ ４ Ｉ ６和 Ｉ一１ Ｌ Ｌ ０ｍＲＮＡ 的表 达 水 平进行 了检 测。 结果表 明 ， 本研 究建
立 的 ｒａ ｔ ＣＲ 检 测 方 法 灵 敏 度 高 、 异 性 强 、 复 性 好 ， 以 用 于 猪 Ｔｈ ｅ卜 ｉ Ｐ ｍｅ 特 重 可 ２型 细 胞 因子 的检 测 及 定 量 分
析
今 日畜牧兽医ｏ ０ ２１ ０年第 ３期
的 ｒ — Ｌ Ｓ 的敏 感性 、 ＮＰ Ｅ ＩＡ 特异 性 、 符合 率分 别 为 ８ ．６ ８ ．３ ９ ． ％， 于 大肠 杆 菌表 达 的 ＲＶ核 蛋 白。 ６３ ％，９８ ％，０ ０ 优 ０ 说 明杆 状病 毒 系统表 达 的核蛋 白是 建立 ＲＶ核 蛋 白 Ｅ ＩＡ 抗体 检 测方 法的理 想抗 原 。 ＬＳ
件缺失， 获得 含 有缺 失性 突 变体 病毒 前病 毒 全基 因组 的 重组质 粒 ｐ ＣＡ ＨＮ一△Ｅ。将该 重 组质 粒 纯化后 Ｓ Ｕ—
转 染 ＤＦ １细胞 ， 一 并连 续传代 ， 终获得 缺 失病毒 ｒｃ ｕ— 最 ｓ Ａ ＨＮ一△Ｅ 。该毒株 感 染 的 ＤＦ １细胞 可被 Ａ ｖ— 一 Ｌ Ｊ 特 异性 单 克隆抗 体 Ｉ ９所识 别 ， Ｅ 并且体 外 增 殖性 能 稳 定。该 缺 失性 病 毒 的获得 为 Ｅ元 件功 能 的研 究奠 定 了
９ ． ９ ．％和 ８ ． 实验 结果表 明建 立 的 Ｅ ＩＡ 方 法可 以用 于 口蹄 疫 感染和 免 疫抗体检 测 。 ５
血管瘤 病 变型 Ｊ亚群 禽 自血病 病毒 Ｅ元 件缺 失突变 体 的构 建
为构 建血 管瘤病 变型 １ 亚群禽 白血 病病 毒 Ｅ元件 缺 失 突变体病 毒 ，本研 究利 用融 合 Ｐ ＣＲ 方法将 Ｅ元
Ｔ ２型细胞 因子 Ｉ一 、Ｌ ６ Ｉ一１ ｈ Ｌ ４Ｉ一 、 Ｌ ０以及 看 家基 因 Ｄ ａｔ — ｃ ｎ的基 因序 列分 别设 计一 对特 异性 引物 ，构 建含 有 ｉ
各 自 引物 扩 增 序 列 的 重 组 质 粒 作 为 阳性 标 准 品 ， 立 了检 测 Ｉ 一 、 一 、Ｌ １ 建 Ｌ ４ Ｉ ６ Ｉ 一 ０及 ｐ ａｔ Ｌ — ｃｉ ｎ的 Ｓ Ｒ ｒｅ ＹＢ Ｇ ｅｎＩ ｒａ ｉ Ｃ 方 法 。该 方 法 线 性 关 系好 ， 种 细 胞 因 子 及 ｐ ａｔ ｅ卜ｔ Ｐ Ｒ ｍｅ 各 — ｃｉ 准 曲 线 的 相 关 系数 均 达 到 Ｏ９ ７以上 ； ｎ标 ． ９
可 与 Ｆ ＤＶ ５种 血 清 型 的 牛 阳性 血 清 发 生 特 异 性 反 应 。 以 纯 化 复 性 的 ｒ Ｐ Ｍ Ｖ ２为 抗 原 建 立 了 Ｆ ＭＤＶ ｒＰ 间 ｖ ２
接 Ｅ ＩＡ 方法 重 复性试 验证 实批 内、 间 变异 系数 均 小于 １％。特 异性 交叉试验 表 明 ， ＬＳ 批 ０ 该抗 原 不与常 见的
、＾ｆｇｍｚ． ｒ ＾＾． ｘ ｓ ｏ ＾＾ ｚ ｃｎ
Ｅｍａｌｘ ｙ １ ６ｃ ｍ － ｉｒｍｓ ＠ ． ： ｊ ２ ｏ
科 技 前 沿
Ｃ主三
狂犬 病病 毒核 蛋 白在 Ｂ ｃ Ｔ — ａ ｃ Ｐ ａ — ｏ Ｂ ｄＡ ＭＮ Ｖ杆 状病 毒 系统 的 表达
为真核 表 达狂 犬病 病毒 的核 蛋 白 ， 本研 究 通过 ＲＴ— ＣＲ 克隆狂 犬病病 毒 Ｅ Ａ 株 核蛋 白基 因 ， 其克 Ｐ Ｒ 将 隆 于杆 状病毒 转 移栽 体 ｐ ａｔａＨＴ 中 ． 建重 组质 粒 ｐ ａｔａＨＴ － Ｆｓ ｃ Ｂ Ｂ 构 Ｆ ｓ ｃ Ｂ ＮＰ并将 其转化 ＤＨ１Ｂ ｃ细胞 ， 到 Ｂ ０ａ 得
其他 ７种 牛病 阳性血 清发 生 交叉反 应 。检 测 非免 疫无 口蹄 疫 国家牛 阴性血 清 的特异 性 为 １０ 检 测感 染血 ０ ％； 清敏 感性 为 ９ ． 检 测 Ｏ— ｓ 的． 价 苗免 疫牛 血 清 ， ４种 商品 化试 剂盒 比较 ， 符 合 率分别 为 ６ ． ７ ％： ３ Ａｉ Ｉ ２ ａ － 与 其 ９ ％、 ０
重组 穿梭 质粒 ｒＢ ｃ ｄ ＮＰ 通过 转 染 昆 虫细 胞 ｓ ｅ ａｍｉ— ； ｆ ９包装 重组杆 状病 毒 。Ｓ — Ａ 、 ｓ ｒ ｌｔ 间接 免 ＤＳ Ｐ ＧＥ ｗｅｔ ｎｂｏ 和 ｅ
疫 荧光对表 达 的蛋 白进行 鉴 定和反 应 原性 分析 。分 别 以重组杆 状病 毒表 达 的核蛋 白、 原核 表 达核蛋 白为 包 被抗 原进 行 Ｅ ＩＡ 检测 。结 果表 明 ． 昆虫细 胞 中表 达 的狂 犬病病 毒 重组核 蛋 白能 与鼠抗 ＲＶ核 蛋 白单克 ＬＳ 在 隆抗体 和 ＲＶ 阳性血 清特 异性 结合 ， 其相 对 分子 量约 为 ５ ． ｋ 。以重组杆 状 病毒表 达 的核蛋 白为抗原 建立 ０５ ｕ
基础 。
Ｃ薹三
猪 Ｉ一 、 一 Ｌ ４ Ｉ ６和 ｌ一 Ｏ Ｓ Ｒ Ｇｒｅ ｅ ｌｔ ＣＲ检测 方 法的 建立 及应 用 Ｌ Ｌ １ ＹＢ ｅ ｎＩ ａ－ｉ Ｐ ｒ ｍｅ
为探 讨 Ｐ ＲＲＳ 感 染 后 机 体 的 体 液 免 疫 应 答 、 从 分 子 水 平 深 入 研 究 Ｐ Ｖ ＲＲＳ 的 免 疫 机 制 ，本 研 究 针 对 Ｖ
Ｃ
牛 口蹄疫 病毒 Ｖ ２结构 蛋 白抗体 间接 Ｅ ＩＡ 方法 的建 立 Ｐ ＬＳ
．
为 建 立牛 口蹄 疫 （ＭＤ） 体 的检 测 方 法 ， 研 究将 口蹄 疫病 毒 （ＭＤｖ 的 Ｖ ２基 因 ， 过 ｐ ＲＯＥ Ｍ Ｆ 抗 本 Ｆ ） Ｐ 通 Ｐ ＸＴ
ＨＴ ｂ表 达 载体 在 大肠 杆 菌 ＤＨ５￣中表 达 ， ｏ 获得 大 小为 ３ ｋ ５ ｕ的重 组 Ｖ ２蛋 白（ ２， ｓ ｒ ｌｔ 实 ｒ Ｐ Ｐ ｒ ）ｗｅ ｅｎｂｏ 证 ＶＰ ｔ Ｖ ２