实验一植物原生质体的分离和培养一教学目标了解植物原生质
植物原生质体的分离
植物原生质体的分离
植物原生质体的分离
植物原生质体(plant protoplasts)是植物细胞核以外的细胞质组成，它们可以通过去核反应获得。
原生质体可以分离出来，是植物胚性转化的一种重要方法，可以用来分离和获得植物细胞和细胞器的活性。
植物原生质体的分离可以采用不同的方法，以下是常用的几种方法：
一是用果胶酶和裂解酶将细胞膜降解，使细胞质中的内质网结构改变，使原生质体从细胞壁中分离出来。
二是用保护剂处理和胞质囊泡技术。
保护剂处理，把细胞质和细胞膜充分溶解，裂解出原生质体；而胞质囊泡技术，是通过用氯仿（等其他溶剂）将细胞膜脱落，或者将细胞膜和细胞质分开，使原生质体分离出来。
三是用低温处理，低温能使细胞膜结构改变，形成小孔，使原生质体从小孔中流出。
四是运用低温抗体介导的细胞膜破裂，在低温下用抗体对细胞膜特异性地结合，从而实现细胞膜的改变，使原生质体分离出来。
以上几种方法通常都能有效地获得植物原生质体。
另外，还可以采用全自动分离系统，自动化地破碎、清洗细胞，最终得到原生质体。
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综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养
综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义,在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。
它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。
植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。
1954年，植物单细胞培养才获得成功。
Mllir培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；I960年Jones等建立了微室培养法。
同年，Cocking 应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。
随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，现在常用的原生质体培养方法有：液体浅层培养法、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等。
实验目的了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞。
是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。
高Ca高pH法和电融合法：PEG作为一种高分子化合物，20〜50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗.使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醛键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可昨为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
原生质体无菌分离培养与融合
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离 心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法
头，滤膜（*4） 和电融合法。
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。 加1ml13%CPW洗液悬浮。
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，滤膜（*4）
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主 质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有
效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而 具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一 些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够 长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。
材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 原生质体的酶解与分离（无菌条件）
个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 CPW洗生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
植物原生质体培养
原生质体的培养1. 原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。
在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。
营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。
这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。
两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。
首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。
自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。
通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。
原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。
1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。
他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。
然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
植物原生质体培养的技术流程
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《细胞工程学》(实验)教学大纲
《细胞工程学》（实验）教学大纲课程代码：13.012课程名称：细胞工程学（Cell Engineering）学时学分：总学时56学时，实验课学时20学时；课程总学分3.5。
先修课程：普通生物学；细胞生物学；遗传学；细胞生物学；发育生物学。
实用专业：生物技术、生物学一、课程性质和任务细胞工程学是应用细胞生物学和分子生物学原理与方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有目标性状的细胞系或生物体的有关理论和技术的学科。
它是一门现代生物科学理论和工程技术相结合的综合性学科。
细胞工程学是生物技术、生物学及生物工程*专业学生的必修专业课，也是我校其它生物类各本科专业学生的重要选修课。
先修主要基础课程有普通生物学、发育生物学、遗传学、生理学、生物化学。
细胞工程是现代生物技术的重要组成部分，同时也是现代生物学研究的重要技术工具。
要求学生通过本课程的学习掌握生物组织、器官及其细胞离体培养的原理与技术，为从事生物学领域的相关研究及其与细胞工程有关的生物技术产业奠定良好的理论和技术基础。
二、教学目标和要求（一）理论知识方面重点掌握本学科的基本原理和基本技术即：细胞全能性学说在细胞工程中的指导作用；培养条件下的细胞分化和器官发生的调控；离体培养条件下的遗传与变异特点。
掌握不同组织、器官的培养特点和控制方法。
了解细胞工程的各类技术在现代生物学与生物技术领域的应用途径与发展潜力。
（二）实践技能方面重点掌握细胞工程的基本操作技术—无菌操作；掌握外植体选择、愈伤组织和胚状体诱导、器官发生调控等基本技术；了解细胞大批量培养方法，原生质体分离与体细胞杂交技术。
三、实验内容与学时分配四、教学方式及考核办法教学方式：主要采用在教师示范的基础上，学生自主操作、教师分别指导为主。
考核办法：本课程实验设置基本按照本学科研究的基本环节设计，因此，整个教学环节实行模拟研究型方式，每次实验学生进行详细观察记载，实验结束后形成完整实验资料，在此基础上撰写实验论文，作为实验考核的主要依据；同时，每次实验由指导老师对操作环节进行等级评定。
《细胞生物学》实验指导书(不太全供参考).doc
《细胞生物学》实验指导书（不太全供参考）适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌；(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液：(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基：3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备：1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解：材料切成1mm宽细丝，加入适量酶液，置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下，酶解5〜7h.3.分离：用200目网过滤除去未完全消化的残渣，在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在lOOOrpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.（二）原生质体融合：1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿，静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液，静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片，镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞，并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体，在实验中应注意那些问题？增多数量的方法:多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件？实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜)，静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆,相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件？实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次，每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢,DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加, 核质浓缩，核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯，姬姆萨染色剂，Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤（一）细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min使细胞坏死.（二）细胞凋亡的形态学观察：1.处理4h取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计.（三）DNA梯状条带的检测：1.离心收集鸡血细胞，弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37°C水浴12〜24h）,间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟，弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压，电泳45 min左右，8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解，取一个凝胶模子，两端用胶布封好，水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处，其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时，加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀，倒入模子，待冷却凝固后，取下梳子，撕去两端胶布,放入电泳槽中，使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。
简要说明原生质体分离的方法
简要说明原生质体分离的方法原生质体是植物细胞中的一种重要细胞器，它在细胞的生理活动中起着关键作用。
为了研究和利用原生质体，科学家们开展了一系列的实验，其中最重要的一步就是分离原生质体。
本文将以简要说明原生质体分离的方法为标题，介绍几种常用的原生质体分离方法。
一、低速离心法低速离心法是最常用的原生质体分离方法之一。
该方法的原理是通过离心将细胞破碎后的混合液分离成不同密度的组分。
具体步骤如下：1. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液。
2. 用离心机以较低的转速离心，使细胞破碎并分离成三个层次的组分：上层是液相，含有溶质和溶剂；中间层是细胞碎片和细胞核碎片；下层是较重的原生质体。
3. 将下层的原生质体用吸管或移液器小心地取出，并用缓冲液洗涤去除杂质。
二、梯度离心法梯度离心法是一种通过调整离心管中梯度浓度来分离不同细胞器的方法。
该方法可以得到纯度较高的原生质体。
具体步骤如下：1. 准备一个离心管，在离心管中加入不同浓度的梯度液，通常是葡萄糖或蔗糖梯度。
2. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液，制备细胞破碎液。
3. 将细胞破碎液轻轻地加入离心管中，避免与梯度液混合。
4. 用离心机以较高的转速离心，离心后不同细胞器会在离心管中分层。
原生质体一般会沉于梯度液的某一位置。
5. 小心地用吸管或移液器将原生质体分离出来，并用缓冲液洗涤去除杂质。
三、差速离心法差速离心法是一种通过调整离心速度来分离原生质体的方法。
该方法适用于分离密度较接近的细胞器。
具体步骤如下：1. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液，制备细胞破碎液。
2. 用低速离心将细胞破碎液离心一次，去除细胞碎片和细胞核碎片。
3. 将上一步得到的上清液转移至另一个离心管中，用较高的离心速度离心，原生质体会沉于离心管的底部。
4. 小心地将原生质体分离出来，并用缓冲液洗涤去除杂质。
四、亲和层析法亲和层析法是一种通过利用生物分子之间的特异性相互作用来分离原生质体的方法。
该方法适用于需要分离特定蛋白质的情况。
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实验一植物原生质体的分离和培养一．教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。
掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。
掌握细胞活性的检测方法。
掌握细胞计数的原理和方法。
二．重点：掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。
掌握细胞活性的检测方法。
掌握细胞计数的原理和方法。
三．难点：分离和培养原生质体的技术。
四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。
五．教学内容:实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。
其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。
其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。
从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。
但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。
所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不能被酶降解。
因此，取材成为实验成功与否的首要问题。
花期短的花瓣，由于其组织鲜嫩，又具有色素标记，是该实验中较好的材料。
实验方法1．把叶片(或花期短的花瓣)洗净，把表面水吸干。
（2人一组）2．撕去叶片背面的表皮，用2ml离心管的盖打下1圆片。
圆片扣压于酶液面上。
让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层。
酶液已放入2ml离心管中。
（酶液：4%纤维素酶， 2%果胶覆酶，，L甘露醇）。
3．28~30℃保温酶解2~6h（放培养箱中）；镜检叶肉细胞原生质体。
用血球计数板计数。
4．600 rpm 离心5min，使原生质体沉降。
吸除上面的酶液。
5．加 mol/L 的加氯化钙液，轻轻吹打均匀。
6．用1mL注射器向离心管底部缓缓注入20%的蔗糖溶液1ml，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液.以600rpm离心10 min，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体。
7．用1mL注射器取出管底的杂质、下部蔗糖溶液和上部氯化钙液。
少许原生质体于载片上，盖片观察其形态，检测纯度。
8．加MS培养液液1ml洗涤，轻轻混匀，600 rpm 离心5min，使原生质体沉降。
吸除上面的溶液。
9．加MS培养液液, 轻轻混匀, 用血球计数板计数细胞密度, FDA染色测定原生质体的活性。
10．扣上盖子，在26℃下进行暗培养。
观察细胞壁的再生和细胞分裂。
实验结果结果讨论六．课堂小结：根据学生的实验结果进行总结。
细胞计数板的使用：细胞计数板系一长方形厚玻片，常用的改良牛氏(Improved-Neubauer) 计数板在中央横沟的两边各有一计数室，两计数室结构完全相同。
计数室较两边的盖玻片支柱低毫米。
因此，放上盖玻片时，计数板与其间距即计数室空间的高为毫米(图8-1)。
在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成９个边长为１毫米的大方格。
四角的大方格又各分为１６个中方格，这是用来计数白细胞的。
中央大方格被划分为２５个中方格，每一中方格又划分成１６个小方格(图8－2称２５×１６=400小方格，也有的计数板为１６×２５=400格的，小方格面积一致)。
中央大方格的四角及中心５个中方格(１６×２５者则为四角上的中方格)为红细胞或血小板计数范围。
细胞计数先用试管稀释法制备禽类血细胞悬液：将禽类红细胞稀释液Ⅰ、Ⅱ分别置水浴锅中预热到４１～４２℃，取Ⅰ液１mL于试管中，用吸血管加入新鲜鸡血(或肝素抗凝血)２０霯，再加入Ⅱ液１mL混匀，置该水浴锅中保温５０s左右，置室温，即为待检的血细胞悬液。
可用于充液计数。
取干洁的计数板，置于水平的显微镜载物台上，盖上盖玻片，使两侧各空出少许。
摇匀血细胞悬液，用滴管吸取，将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外，让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜(图8－3)。
静置２min后计数，先用低倍镜观察，不均匀则抛弃。
计数时用虹彩、集光器、反光镜等调节入射光角度和强度，认清计数室位置。
采用“由上至下，由左至右，顺序如弓”的顺序，对压边线细胞采取“数上不数下，数左不数右”的原则(图8～4)。
依次计数并记录５个中方格中分别有多少个红细胞。
注意事项1．计数板、盖玻片和测定管用清水冲洗，再用绸布或细布沾干。
2．.充液前应充分混匀血细胞悬液，充液要连续、适量，充液后应待血细胞下沉后再计数。
3.计数板、盖玻片、吸血管及测定管等用过后必须立即按要求洗涤干净。
实验二、细胞膜的通透性观察实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
实验原理将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。
实验用品一、器材50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。
二、材料羊血。
三、试剂 L氯化钠，L氯化胺，L醋酸胺，L硝酸钠，草酸胺，硫酸钠，葡萄糖，甘油，乙醇，丙酮。
实验方法一、羊血细胞悬液取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份L氯化钠，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的羊血。
二、低渗溶液取试管一支，加入10ml蒸馏水，再加入1ml稀释羊血，注意观察溶液颜色的变化，有不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。
三、羊红细胞的渗透性1、取试管一支，加入L氯化钠10ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注意观察溶液颜色有无变化有无溶血现象为什么2、取试管一支，加入L氯化胺10ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注意观察溶液颜色有无变化有无溶血现象为什么3、分别在另外8种等渗溶液中进行同样实验。
步骤同2。
实验结果并对实验结果进行比较和分析。
实验三细胞骨架的观察一、实验目的掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法，观察光学显微镜下细胞骨架的网状结构。
二、实验原理植物细胞用适当浓度的TritonX—100处理后，可破坏细胞内蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白质却保护完好。
考马斯亮蓝R250(Coomassie brilliant blue R250)是一种蛋白质染料，处理后的材料用考马斯亮蓝R250(考马斯亮蓝R250) 染色后，用光学显微镜观察，可以见到一种网状结构，即是细胞骨架结构。
三、材料洋葱鳞叶四、试剂1)2％考马斯亮蓝R250染色液：称考马斯亮蓝R2501g，溶于250ml无水乙醇中，加冰醋酸35ml.再加蒸馏至500ml.(2)磷酸缓冲液(pH 6．8)：6．0mmol／L 磷酸缓冲液，调至(3)M缓冲液(pH 7．2)50mmol／L咪唑， 50mmol/L)氯化钾、0．5mmol／L氯化镁、1mmol/L 乙二醇(a-氨基乙基)醚四乙酸、L乙二胺四乙酸； 1mmol／L巯基乙醇，调至pH 7．2。
(4)1%Trion X-100：用M缓冲液配制。
(5)3%戊二醛：用磷酸缓冲液配制；(6)中性树胶。
仪器(请参看)：显微镜，烧杯，镊子。
玻璃滴管，载玻片五、实验步骤1.用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片约1cm2大小若干片)，置于50mL烧杯中，加入磷酸缓冲液，使其下沉；2.吸去磷酸缓冲液，用1％Triton X—100 处理20min。
3.吸去Triton X—100，用M缓冲液洗3 次,每次5min。
4.用3％戊二醛固定30min。
5.磷酸缓冲液(pH 6．8)洗3次，每次5min。
7.蒸馏水洗2次，然后将样品置于载玻片上,加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。
8.如果染色效果好，则可依次用50％乙醇、70%乙醇,95％乙醇、正丁醇、二甲苯处理样品,各5min,然后将样品平展于载玻片上，加一滴中性树胶，盖上盖玻片封片，制成永久切片。
六、实验报告描绘所观察到的洋葱鳞叶细胞骨架图。
实验四、线粒体和液泡系的超活染色与观察活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。
活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。
体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。
碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。
但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。
一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。
詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。
实验目的1、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布；2、学习一些细胞器的超活染色技术。
实验原理线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。
细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。
活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。
詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。
线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。