国家自然科学基金标书范文3
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面上项目申请书撰写提纲
（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：
1. 项目的立项依据
（1）老龄心肌缺血/再灌注（IR）损伤与缺血预适应（IPC）保护
人口老龄化是当今世界一个突出性的社会问题，我国人口老龄化发展速度尤其之快。提高老年人的生活质量，已经成为全社会研究的重要课题。冠心病是引起老年人死亡的最常见原因，其基本病理生理过程是心肌缺血，尽早恢复缺血心肌的血液供应能够挽救缺血心肌，但再灌注引起缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury, IRI）。缺血预适应（ischemic preconditioning, IPC）是心肌保护的新概念，是迄今为止最强的内源性心肌缺血保护方法。但由于老龄心肌细胞发生退行性变，心肌细胞自噬能力降低，线粒体功能下降（mtDNA突变），氧化应激增强，老龄导致内源性保护物质的生成减少以及IR损伤中发重要作用的蛋白质（膜受体、下游的激酶、磷酸酶、促炎细胞因子等）表达/活性发生改变等，导致老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性减弱或消失【1,2】。因此，迫切需要有效的措施改善或恢复老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性，提高老龄心肌抗缺血损伤的能力，进而提高老年人的生存率。
（2）多胺代谢
带有多价正电荷的小分子多胺（polyamine, PAs）包括精胺（spermine, SP）, 精脒（spermidine, SPD）及腐胺（putrescine, PU），广泛存在于迄今人们所研究的所有真核
细胞和原核细胞内，为细胞的生长、分化和增殖所必需，并在许多病理过程中发挥重要作用【3】。目前，小分子多胺作为一种内源性信号分子，已成为国际研究的热点【3-24】。
生物体内多胺水平受精确调控。鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase, ODC）和精脒/精胺乙酰转移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase, SSAT）分别为多胺合成与分解代谢的限速酶。ODC催化鸟氨酸脱羧生成腐胺，腐胺连接到S-腺苷甲硫氨酸上，在S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC）的催化下脱羧生成精脒，精脒通过精胺合成酶催化产生精胺。ODC可被多种生长因子、原癌基因、肿瘤促进剂和应激刺激等激活【4,5】；SSAT催化多胺的逆转化分解代谢，依次催化精胺转化为精脒，精脒转化为精胺。此分解反应过程中产生两种有毒代谢副产物3-氨基丙醛和过氧化氢（H2O2），因此，SSAT过度激活（多胺分解代谢增强）引起组织细胞损伤【6】。
（3）多胺的生物学作用
多胺具有广泛的生物学功能，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、调控线粒体通透转运（MPT）、调控离子通道、促细胞增殖及在细胞内信号转导中发挥重要作用等【7-15】。文献报道，连续3天给小鼠腹腔注射精胺(10 mg/kg) 能明显抑制内毒素诱导的血清中炎症介质的释放【7】；多胺可抑制幅射等所引起的DNA损伤和脂质过氧化。活性氧可导致DNA 断裂和/或硷基修饰，发生程序性细胞死亡，天然多胺含有类似叠氮钠(单线态氧淬灭剂)的氨基而发挥保护作用【8】；多胺可通过与细胞内带负电荷的生物大分子如核酸及蛋白质等结合稳定染色质、核酶、核酸和/或细胞膜。在分离的肝脏线粒体，精胺通过清除羟自由基，维持谷胱苷肽和巯基的还原状态，抑制线粒体通透转运孔（mPTP()开放【9】。在小鼠WEH1231B细胞和人的T细胞，多胺合成抑制剂引起线粒体膜电位（
ψm）下降和
△
caspase-3激活，外源性多胺可逆转之【10】；细胞内精胺负责内向整流钾通道（ir K1）的固有门控和整流特性，精胺通过调控谷氨酸盐受体的某些亚型，影响神经系统神经元和神经胶质细胞的兴奋性和Ca2＋的内流【11】；多胺可直接激活TPK和MAPK，促进原癌基因c-myc, c-jun和c-fos的表达【12】。RTK，PI3K和PKC抑制剂均能抑制生长因子诱导的ODC 的磷酸化【13】。多胺为生长过程所必需，但过度产生也常伴有致癌和致组织细胞损伤作用【14,15】。
随年龄增加哺乳类动物组织器官多胺水平降低（肝、肾、骨骼肌、心脏、肺等）,多胺合成限速酶ODC也呈相同下降趋势【16】。在老龄的组织细胞，激素诱导ODC激活的能力也明显降低【17】；健康人血清及尿液中多胺水平也随年龄增加而降低【18】。目前已知，
多种食物中富含多胺包括蔬菜、水果、鱼、肉、蛋、奶以及发酵食物如奶酪等，摄食富含多胺的食物对老年人的健康有益【19】。动物实验也证明，小鼠长期摄食富含多胺的食物，能明显降低老化相关的疾病，如肾小球硬化、动脉硬化，降低死亡率【20,21】。最新研究显示（2009, 2010年文献），多胺可通过诱导细胞自噬延长生物体的寿命，具有抗衰老作用【22-24】。Morselli的研究显示，精脒能够诱导培养的酵母、线虫、果蝇、小鼠细胞及人的肿瘤细胞自噬，敲除或沉默重要的自噬相关基因（如atg-7，bec-1）取消了精脒延长寿命的作用；小鼠的饮水中加入多胺，也能显著减少衰老引起的氧化应激和细胞坏死【23】。Eisenberg证明精脒延长寿命的机制是通过抑制组蛋白乙酰转移酶使组蛋白去乙酰化，进而转录激活自噬相关基因atg7, atg11和atg15,诱导细胞自噬【24】。
（4）衰老心肌自噬能力下降及其影响的下游事件
自噬是存在于真核细胞中的生命现象，通过自噬清出细胞内受损的蛋白质和细胞器，维持细胞内稳态，对生物体正常发育及防治老化有积极的作用。分子水平上的研究发现，调节自噬和调节衰老的信号通路之间存在相互联系【25】。研究显示，随着年龄增加心肌细胞自噬能力明显降低，导致变性的蛋白质和损伤的细胞器不能有效被清除,细胞稳态发生变化【26】。衰老心肌线粒体自噬减少导致线粒体功能异常，表现为线粒体数目减少，体积增大，呼吸链上的各种酶复合体活性下降，呼吸链电子传递功能障碍，能量代谢障碍。线粒体功能异常导致呼吸链电子漏出ROS产生增加、线粒体DNA发生突变、蛋白质交联、巯基氧化、DNA甲基化下降、组蛋白乙酰化失控和生物膜脂质过氧化，造成大量的变性蛋白质和受损细胞器堆积在细胞内【27】。线粒体损伤使线粒体膜电位降低，线粒体发生通透性转运，cytc及凋亡诱导因子（AIF）释放入胞浆，引起细胞凋亡。近年来研究发现，自噬可通过清除受损的线粒体延迟和对抗凋亡【28】。在营养缺乏的情况下，少量线粒体通透转运孔（mPTP）开放，启动细胞自噬清除受损的线粒体，对细胞有保护作用。损伤严重时，大量的线粒体mPTP开放，cytc和AIP等释放入胞浆，激活凋亡程序。Xue等学者应用自噬抑制剂或基因沉默等手段证明自噬的发生早于凋亡【29】。Yan 在猪慢性心肌缺血的实验中证实，自噬能够抑制慢性缺血引起的细胞凋亡，减轻缺血性心肌损伤【30】。Tracy的研究也显示线粒体损伤和mPTP开放是低氧诱导自噬的关键因子，能够促进营养缺乏状态下自噬体的形成,有利于细胞存活【31】。因此提示：衰老的心肌细胞→自噬能力下降→老化和受损的线粒体堆积→氧自由基产生增加→mPTP开放数目
增加→细胞凋亡。这可能是老龄心肌丧失缺血预适应保护作用的重要机制。小分子多胺在这一级联反应中发挥怎样的作用? 还不清楚？
(5)国内外研究现状及我们的工作基础
从文献检索看，关于多胺的研究，国内外差距较大。表现在国内发表的论文数量少,主要涉及肿瘤诊断及癫痫、胃炎等多胺含量测定【32-34】，个别涉及细胞凋亡相关基因克隆、多胺代谢等【35】。多胺与心血管系统的关系少见报道（仅见于我们自己发表的文章，见作者代表作）。国外的大部分研究主要集中在多胺与肿瘤和脑损伤的关系，小部分涉及肠、肝、肺、肾等器官[36]。多胺在心肌的作用主要集中在多胺与心肌肥大的关系涉及
释放伴再灌注性心肌缺血的较少。Woodcock 等报道到，大鼠心肌缺血/再灌注引起IP
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心律失常发生，庆大霉素和精胺(5mM)有效抑制之【37】。Ventura等的研究发现，精胺可诱导电刺激大鼠心脏发生负性肌力作用伴[Ca2+]i短暂降低，无刺激则不改变静息状态下的[Ca2+]i【38】。我们自己最的系列研究显示，多胺在成年大鼠心肌IR损伤及IPC保护中发挥重要作用【39,40】。但关于多胺在老龄缺血心肌的作用，国内外均未见报道。因此，多胺在老龄心血管系统中的生理作用和病理意义有待研究。
前期我们在国家自然科学基金课题的资助下（NO.30770878，2007-2010，本人为课题主持人）在离体灌流成年大鼠心脏上首次发现，IPC处理能够上调成年大鼠心肌的多胺合成代谢（多胺合成限速酶ODC表达增加，总多胺池增加），给予ODC特异性抑制剂α-difluoromethylornithine(DFMO) 取消了I PC介导的心肌保护作用，证明多胺是介导IPC心肌保护作用的内源性信号分子（见后面工作基础）；进一步证明IPC诱导的ODC/多胺通路上调主要与PKC、Erk1/2、PI3K/Akt信号转导通路的激活有关【39】。文章发表在Mol Cell Biochem.2009 (332) 135–144上。之前我们的另一项国家自然科学基金资助课题(NO.30470688，2005—2007,本课题申请人为第二完成人）的研究发现,缺血/再灌注(IR)损伤心肌多胺代谢失衡，腐胺增加，精脒、精胺减少总多胺池耗竭。外源性精胺(1mmol/L)能补充细胞内的多胺池，并通过下调死亡受体通路、抑制线粒体凋亡通路、清除自由基、抑制细胞内钙超载发挥心肌保护作用【40】。文章发表在European Journal of
Pharmacology 2007,（562）236–246.上（见后面工作基础）。
（6）本课题关注的问题
基于我们前期的研究发现及文献报道心肌组织中的多胺随年龄增加而减少，多胺具有诱导细胞自噬、抗炎、抗氧化清除自由基、抗凋亡、调节线粒体钙缓冲以及多胺在细胞内信号转导中发挥重要作用等独特的生物学功能。我们提出：“外源性多胺可能恢复老龄心肌对IPC刺激的敏感性”。预实验结果初步证实了我们的推测。我们在离体心脏灌流模型上观察到，老龄大鼠心脏在离体灌流前慢性给予外源性多胺（多胺灌胃6周，参照文献给药量【20】），多胺恢复了老龄心肌对IPC刺激的敏感性（心脏功能有明显改善，冠脉流出液中LDH水平有明显降低），多胺合成限速酶ODC特异性抑制剂DFMO取消了这种改变（实验数据见后面的研究工作基础）。但关于老龄IR与IPC心肌多胺代谢的特点和规律如何？外源性多胺能否恢复老龄心肌对IPC刺激的敏感性？如果能，其机制是什么？以及多胺在老龄IPC心肌保护中作用的准确效应靶点是什么？这些还不清楚，这些是本课题研究的主要内容。
本课题将在原有工作基础上，在器官、细胞及分子水平上观察青年与老年IR与IPC 心肌多胺代谢变化的规律和特点，探讨老龄心肌IR损伤及IPC保护和多胺水平变化的内在联系。观察外源性多胺对老龄IPC心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化应激及细胞凋亡的影响。通过诱导或阻断自噬（siRNA干扰）和调控线粒体通透转运（开放或抑制mPTP）干预，探讨外源性多胺是否通过诱导自噬/减少线粒体损伤/抑制氧化应激/抗凋亡级联重现老龄心肌IPC保护作用。并进一步细胞、亚细胞水平上探讨多胺发挥作用的准确效应靶点。以上问题的解决将能够验证我们提出的“多胺是介导缺血预适应心肌保护的内源性信号分子、多胺代谢通路可能成为老年心肌缺血/再灌注损伤防治的新靶点”的假说。目前，国内外未见相关报道。本课题的完成，为老龄心肌缺血/再灌注损伤的防治提供一种新思路、新靶点和新的技术平台。具有重要的理论意义和应用价值。
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2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。
2.1研究内容
（1）在器官水平上观察青年与老年大鼠IR、IPC心肌多胺代谢变化的特点与规律。应用离体灌流大鼠心脏，复制青年与老年大鼠心肌缺血/再灌注（IR）与缺血预适应（IPC）模型，观察心肌多胺代谢情况（多胺合成与分解限速酶与多胺池的变化）。观察指标：多胺代谢分析：①高效液相色谱法测定心肌组织中多胺，包括腐胺、精脒、精胺的含量；②14C-标记，液闪计数法分析多胺合成限速酶鸟氨酸脱羧酶（ODC）与分解代谢限速酶精脒/精胺乙酰转移酶（SSAT）
活性；③免疫印迹法分析多胺合成与分解代谢限速酶ODC和SSAT蛋白表达。
（2）在器官水平上观察外源性多胺能否通过恢复细胞内多胺池重现老龄心肌IPC 保护作用。老龄大鼠多胺灌胃给药6周，取心脏复制离体灌流心脏IPC模型，与未给药的老龄IPC心脏比较，观察外源性多胺对老龄大鼠心肌多胺池的影响，同时观察外源性多胺对老龄大鼠心肌IPC刺激敏感性降低或丧失的恢复能力（心脏功能与心肌损伤评价）。再给予多胺处理的IPC心脏多胺合成限速酶ODC的特异性抑制剂DFMO观察其对IPC 心肌保护的干预作用。观察指标:
多胺代谢分析：（同上）。心功能评价:多导生理记录仪记录心功能变化（LVDP、LVEDP、±dp/dt、心率、冠脉流量等）。心肌损伤评价：①TTC染色法测定心肌死面积观察；②比色法检测冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）含量变化；③透射电镜观察心肌细胞超微结构观察
（3）在器官上观察外源性多胺对老龄IPC心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化应激及细胞凋亡的影响，给予多胺抑制剂、自噬抑制剂以及mPTP开放剂干预，探讨外源性多胺的作用机制。老龄大鼠多胺灌胃给药6周后，取心脏复制离体灌流心脏IPC模型，与未给药的老龄IPC心脏比较,观察心肌细胞自噬、线粒体功能、细胞氧化应激及细胞凋亡情况。再分别给予多胺处理的IPC心脏多胺合成限速酶ODC的特异性抑制剂（α-difluoromethylornithine，DFMO）、细胞自噬抑制剂(3-methyladenine，3-MA）及mPTP 开放剂(atractyloside, Atr) 干预，观察药物干预是否取消了外源性多胺在IPC心脏的作用。观察指标：
细胞自噬分析：①透射电子显微镜观察双层膜的自噬体；②Real-time PCR 方法检测自噬相关基因atg-5,Beclin-1表达；③免疫印迹法检测自噬体膜标志性蛋白质LC3，Beclin-1表达。线粒体功能评价：①线粒体呼吸酶复合体Ⅰ，Ⅱ, Ⅲ，Ⅳ的活性变化；②线粒体呼吸控制率变化（RCR）；
③高效液相色谱分析心肌ATP, ADP, AMP水平，观察心肌能量代谢情况。细胞氧化应激水平分析:①细胞脂质过氧化水平，丙二醛（MDA）；②抗氧化酶的变化：超氧化物歧化酶（MnSOD）,谷胱甘肽过氧化物酶（CAT）活性测定；③线粒体氧化损伤的评价：测定线粒体DNA(mtDNA)氧化产物（8-OHdG）生成量和mtDNA编码的呼吸酶复合I成分ND6的表达（免疫印迹法）。细胞凋亡观察：①细胞凋亡检测(TUNEL法)；②促凋亡蛋白Cyt c, Bax, Caspase-9和抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL表达水平（免疫印迹方法检测）。
（4）在衰老的心肌细胞模拟IPC模型上观察外源性多胺对心肌细胞自噬、线粒体功能、细胞氧化应激及细胞凋亡的影响。给予多胺抑制剂、自噬抑制剂及mPTP开放剂干预，观察外源性多胺对IPC心肌的影响。在细胞水平上观察外源性多胺能否恢复老龄心肌细
胞IPC保护作用并探讨其机制。应用D-半乳糖诱导分离培养的乳鼠心肌细胞衰老。应用
模拟缺血/缺氧液复制IR与IPC心肌细胞模型。给予外源性多胺处理的IPC心肌细胞后，
再予多胺合成抑制剂（DFMO）、细胞自噬抑制剂（3-MA）及mPTP开放剂（Atr）干预，
观察外源性多胺对衰老的IPC心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化损伤以及细胞凋亡影响。
观察指标：
心肌细胞自噬分析：①透射电子显微镜观察双层膜的自噬体；②荧光显微镜下观察自噬体膜标志蛋白（LC3-GFP）转染细胞后，LC3荧光变化；③荧光显微镜下观察丹(磺)酰戊二胺(MDC)荧光染色情况；④免疫印迹方法检测自噬相关蛋白Beclin1, LC3 的表达。线粒体功能评价:（同上）。心肌细胞氧化损伤：①MTT方法检测细胞存活率；③H2-DCFDA标记心肌细胞，流式细胞仪检测ROS生成率；
④DHE荧光探针标记细胞，荧光显微镜检测ROS的生成情况。细胞凋亡观察：①Hoechst33342染色检测细胞凋亡。②促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表达水平（同上）。
（5）在细胞水平上观察外源性多胺对衰老心肌细胞自噬、线粒体损伤及细胞凋亡
的影响。在此基础上调控自噬或调控mPTP开放，探讨外源性多胺发挥作用依赖的信号级
联。应用D-半乳糖诱导分离培养的乳鼠心肌细胞衰老。在给予外源性多胺处理衰老的细
胞之后，再分别给予①多胺合成抑制剂(DFMO)，②自噬诱导剂(rapamycin,Rap)，③自
噬抑制剂(3-MA)，④自噬相关基因atg-5 siRNA，⑤线粒体通透转运孔开放抑制剂
(C yclosporin A,Cys A)。⑦线粒体通透转运孔开放诱导剂(atractyloside,Atr) ⑥观
察其对心肌细胞自噬、线粒体功能以及细胞凋亡情况。观察指标：
心肌细胞自噬检测、心肌线粒体功能评价、细胞氧化应激评价、心肌细胞凋亡的评价。同上（4）。
（6）在分离的老龄大鼠心肌细胞及线粒体上，观察外源性多胺对线粒体膜电位、
线粒体通透转运孔（mPTP）开放的影响，以及多胺抑制剂和自噬抑制剂的干预作用，探
讨多胺发挥作用的效应靶点。应用离体心脏灌流技术分离老龄大鼠心肌细胞，应用差速
离心方法分离老龄心肌细胞线粒体用于实验。观察外源性多胺对老龄大鼠心肌细胞线粒
体膜电位（
ψm）及线粒体通透转运孔（mPTP）开放的影响，给予多胺合成限速酶ODC △
的特异性抑制剂（DFMO）或自噬抑制剂(3-MA),观察抑制剂的干预作用。观察指标：
细胞氧化损伤：DHE荧光探针标记心肌细胞，荧光显微镜下观察ROS产生。线粒体膜电位（△ψm）变化：JC-1染色，激光扫描共聚焦显微镜观察。线粒体通透转运孔（mPTP）开放观察：①应用钙电极检测钙诱导的mPTP开放。②Calcein-AM标记线粒体，共聚焦显微镜观察mPTP开放。
2.2 研究目标
1. 本研究通过观察青年与老龄大鼠IR 与IPC心肌多胺代谢的特点与变化规律以及衰老心肌的功能、代谢改变，拟阐明外源性多胺可通过恢复心肌细胞内多胺池重现老龄心脏IPC保护作用。
2.给予多胺合成抑制剂、自噬抑制剂及mPTP开放剂干预，观察外源性多胺对老龄IPC心肌细胞自噬、线粒体损伤及细胞凋亡的影响。在器官、细胞及分子水平上阐明外源性恢复老龄心肌IPC保护作用的机制。再通过调控自噬和调控mPTP开放干预，进一步证明多胺发挥作用依赖的信号级联。
3.在分离的心肌细胞与线粒体水平上观察外源性多胺对老龄IPC心肌线粒体通透转运孔（mPTP）开放的影响，拟证明mPTP是多胺在老龄IPC心肌作用的效应靶点。
2.3 拟解决的关键科学问题：
理论关键：
（1）老龄心肌对IPC刺激的敏感性减弱或丧失是否与老龄IPC心肌ODC/多胺通路激活钝化，多胺分解代谢增强，导致总多胺池减少有关?
（2）外源性多胺能否通过恢复心肌细胞内的多胺池重现老龄心脏IPC心肌保护作用? （3）最新报道，多胺能诱导多种细胞自噬。本研究中多胺能否诱导衰老的心肌细胞自噬？如果能，其调控的下游事件及作用的末端效应靶点是什么？这是否是其恢复老龄心肌IPC保护作用的机制？
以上问题的阐明，将能够验证我们提出的“多胺是介导老龄大鼠IPC心肌保护作用的信号分子，外源性多胺通过诱导细胞自噬进而启动下游事件恢复老龄心肌IPC保护作用”。观点。
技术关键：
（1）准确测定心肌组织内的多胺（腐胺、精脒、精胺）。
（2）多胺合成与分解代谢限速酶ODC和SSAT活性测定及蛋白质表达分析。
（3）细胞自噬的检测，包括形态学观察，自噬相关基因与蛋白的检测以及能否成功沉默自噬相关基因 (atg-5 siRNA)。
（4）心肌能量代谢、线粒体呼吸控制率变化以及线粒体mPTP开放的检测。
3. 拟采取的研究方案及可行性分析。
3.1研究方法和技术路线
（1）在器官水平上观察青年与老年大鼠IR 、IPC 心肌多胺代谢变化的特点与规律
应用离体灌流大鼠心脏，复制青年（3月龄）和老年（18月龄）大鼠心肌缺血/再
灌注(IR)与缺血预适应（IPC ）模型，观察青年与老龄大鼠IR 与IPC 心肌的多胺代谢变
化规律。
具体步骤：
① Langendorff 离体灌流大鼠心脏心肌IR 与缺血预适应IPC 模型的建立及分组
模型建立:
月龄分别为3个月（青年, 体重在200-250g ）与18个月（老年,体重在450-500g ）雄性Wistar 大
鼠，麻醉同时腹腔注射肝素。开胸取心脏置于冷灌流液中，主动脉逆行插管连接在Langendorff 离体
灌流装置上，以80mmH 2O 的压力KH 缓冲液灌流心脏，用95% O 2和5% CO 2 混合气体平衡灌流液。
实验分组（青年与老年大鼠均分为C, IR, IPC 组）：（n=8）
对照组（control, C ）：大鼠心脏用KH 液平衡灌注180min.
缺血/再灌注组（ischemia/reperfusion, IR ）：大鼠心脏先预灌平衡20min ，然后在无氧、无灌流
液的条件下，保持心脏温度恒定在37o C 停止灌流40min （缺血）
，之后再复灌120min （再灌）。 缺血预适应组（ischemic pre-conditioning, IPC ）：预灌注平衡20min 后再经历短暂的5min 缺血，
10min 再灌注，重复三次，为缺血预处理。之后心脏再经历40min 的缺血，120min 的再灌注。
②心肌多胺代谢的变化
心肌多胺含量的测定:采用苯甲酰氯柱前衍生法，反向-高效液相色谱测定心肌细胞内的多胺（RP-HPLC，Waters, 美国）。本方法是我们实验室通过对国外测定生物样品中多胺的方法加以改良，在国内率先建立的,文章发表在《中国病生杂志》2005；21（2）本人为第一作者。
心肌组织多胺合成代谢限速酶ODC及分解限速酶SSAT活性测定:用14C标记，液体闪烁计数仪（LS-6500，Bechman，美国）检测心肌细胞内ODC与SSAT的活性。本方法也是我们实验室对国外的测定方法加以优化后建立的。文章发表在《中国药理学通报》2005；21（5），本人为第一作者。
心肌组织ODC与SSAT蛋白质的表达（免疫印迹法）:取左心室组织，加入预冷的含PMSF（lmmol/L，pH7.4）的蛋白裂解液在液氮内研磨制成匀浆，12000rpm离心30min，提取胞浆总蛋白。取上清，BCA 法进行蛋白质定量。蛋白质免疫印迹法检测心肌ODC与SSAT蛋白质的表达。具体方法：取50μg 总蛋白样品于10 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转印至PVDF膜，用5 %脱脂牛奶封闭后，用抗 ODC 或SSAT抗体4 ℃孵育过夜。加碱性磷酸酶偶联的二抗，室温孵育40min，显色。β-actin作为一抗对照。光密度扫描半定量分析显影条带，目的条带和β-actin信号面积之比评定其蛋白水平。
（2）在器官水平上观察外源性多胺能否通过恢复细胞内多胺池重现老龄心肌IPC 保护作用
老龄大鼠多胺灌胃给药6周后复制离体灌流心脏IPC模型，与未给药的老龄IPC 心脏比较，观察外源性多胺对老龄心肌对IPC刺激敏感性降低或丧失的恢复能力以及对多胺池的恢复情况。再给予多胺处理的IPC心脏多胺合成抑制剂(DFMO)，观察DFMO是否取消了外源性多胺对老龄IPC心脏的干预作用。
技术路线:
具体步骤：
①离体灌流老龄大鼠心脏缺血/再灌注（IR）与缺血预适应（IPC）模型的建立及分组
模型建立:
体重在450-500g，18个月龄的雄性Wistar 大鼠与多胺灌胃6周（给药浓度参照【37】；精脒,2.5 mg/kg.d;精胺,25 mg/kg.d），2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，同时腹腔注射肝素抗凝。麻醉后开胸取心，主动脉逆行插管连接在Langendorff离体灌流装置上，复制模型，具体操作见前面。
实验分组：(n=8)
对照组（control, C）：老龄大鼠心脏用KH液平衡灌注180min.
缺血/再灌注组（ischemia/reperfusion, IR）老龄大鼠心脏先预灌注平衡20min，然后在无氧、无灌流液的条件下，保持心脏温度恒定在37o C，停止灌流40min（缺血），之后再复灌120min（再灌）。
缺血预适应组（ischemic pre-conditioning, IPC) ：老龄大鼠心脏先预灌注平衡20min，再经短暂的5min缺血10min再灌注,×3次预处理。之后心脏再经历40min的缺血，120min的再灌注。
外源性多胺+缺血预适应组 ( PAs-IPC) ：老龄大鼠多胺灌胃给药6周后，麻醉动物，迅速取心脏连接到离体心脏灌流装置上，复制心脏IPC模型（复制方法同IPC组）。（PAs：polyamines）外源性多胺+缺血预适应+多胺抑制剂组(PAs-IPC-DFMO）：实验操作同PAs-IPC组，只是在心脏预处理过程中给予多胺合成限速酶抑制剂difluoromethylornithine (DFMO, 2mmol/L）。
②心肌多胺代谢的变化(具体方法见前面第1部分 )
③心脏功能的评价
将一个乳胶球通过左心房插入左心室，通过调整球内水量，将左心室末端舒张压（LVEDP）调到4-8 mmHg，乳胶球的远端通过压力传感器与多导生理记录系统相连。实验开始后，持续记录各项心功能指标，包括心率（HB），左室末端舒张压（LVEDP），左室发展压（LVDP）以及±dp/dt。
接取灌流液，测定冠流量（CF, ml/min）。
④心肌损伤评价
心肌梗塞面积（infarct size）的测定（TTC染色方法）：心脏灌流结束后取下心脏，置于-20o C 冷冻2h，然后，沿从心尖到心底方向，将心脏切成2-3mm厚的切片，将心肌切片与1%TTC 37o C孵育20min，再将切片置于10%的甲醛溶液中固定过夜。数码相机拍照，计算机分析计算梗塞区的面积。
心肌坏死的观察：冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）、心肌组织MDA检测，比色法测定。
心肌超微结构观察：心脏灌流结束后，取下心脏，用双面刀片在左室游离壁处取材。心室肌切成1mm3的小块，用4o C戊二醛磷酸缓冲液固定液24小时，常规脱水、浸透、包埋、染色、制成50-70nm
的超薄切片,透射电镜下，观察心肌细胞超微结构。
心肌细胞凋亡检测（TUNEL 染色法）：取心室肌切成0.5cm 3
的小块，用4%多聚甲醛磷酸固定，常规脱水、浸蜡、包埋，制成厚度为10μm 的切片，光镜下观察细胞凋亡情况。正常心肌细胞核染成蓝色，凋亡的细胞核呈棕褐色，数不少于500个心肌细胞核，计算凋亡率。 （3）在器官上观察外源性多胺对老龄IPC 心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化应激及细胞凋亡的影响，探讨多胺的作用机制。
老龄大鼠多胺灌胃给药6周后取心脏复制IPC 模型，与未给药的老龄IPC 心脏比较,观察心肌细胞自噬、线粒体功能及细胞凋亡情况。再分别给予多胺处理的IPC 心脏多胺合成抑制剂（DFMO ）、细胞自噬抑制剂（3-MA ）及线粒体通透转换孔（mPTP ）开放剂（Atr ）干预，观察干预处理是否取消了外源性多胺在IPC 心肌的作用。
具体步骤：
① 离体灌流老龄大鼠心脏缺血/再灌注（IR ）与缺血预适应（IPC ）模型的建立及分组
模型建立:
18个月龄的未给予任何干预因素的老龄雄性Wistar 大鼠与多胺灌胃6周（处理方法同前）18个月龄雄性Wistar 大鼠，麻醉同时腹腔注射肝素。麻醉好后开胸取出心脏，主动脉逆行插管连接在Langendorff 离体灌流装置上，复制模型同前。
技术路线：
实验分组：（n=8）
对照组（control, C）：老龄大鼠心脏用KH液平衡灌注180min。
缺血/再灌注组（IR）：老龄大鼠心脏先预灌注平衡20min，然后在无氧、无灌流液的条件下保持心脏温度恒定在37o C，停止灌流40min（缺血），之后再复灌120min（再灌）。
缺血预适应组（IPC）：老龄大鼠心脏先预灌注平衡20min，然后再经历短暂的5min缺血，10min 再灌注，重复三次，为缺血预处理。之后心脏再经历40min的缺血，120min的再灌注。
外源性多胺+缺血预适应组（PAs-IPC）：老龄大鼠多胺灌胃6周后，取心脏连接到Langendorff 离体心脏灌流装置上，复制心脏IPC模型（方法同IPC组）。（PAs: polyamines）
药物干预各组的实验操作同PAs-IPC组，只是在心脏预处理过程中给予药物干预，干预试剂为：多胺合成抑制组（PAs-IPC-DFMO）：Difluoromethylornithine（DFM O, 2mmol/L）。
自噬抑制剂组（PAs-IPC-3-MA）3 - methyl adenine（3-MA, 2mmol/L）。
线粒体通透转运孔开放剂组（PAs-IPC-Atr） Atractyloside（ Atr, 5mmol/L）。
②心肌细胞自噬检测
透射电子显微镜观察自噬体：
心脏灌流结束后，取左心室肌切成1mm3的小块，戊二醛磷酸缓冲液固定，常规脱水、浸透、包埋、染色、制成超薄切片,透射电镜下观察。
自噬相关基因atg-5，Beclin-1表达水平检测（Real time-PCR方法）
参照Invitrogen公司的TRIzol试剂盒和说明书，提取各组心肌细胞的总RNA,使用Promega公司的反转录系统获得cDNA。使用Promega公司PCR反应试剂盒进行PCR。
atg-5，上游引物5’TTT GGC TTT GGT TGA AAT AAG 3’,下游引物5’TGT CAT TTT GCA ATC CCA TC 3’
Beclin-1，上游引物5’TCC ATC ACC CAC TCT GTG AG 3’,下游引物5’TTA TTG GCC AGA GCA TGG AG 3’
对照GAPD, 上游引物5’GAA GGT GAA GGT CGG AGT 3’, 下游引物5’ GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC 3’ PCR反应条件：95o C 2min; 94o C 30s，55 o C 30s，72 o C 1min, 35个循环；72 o C 10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，BioRad凝胶图像处理系统照相分析。
自噬体膜标志蛋白LC3, Beclin-1蛋白表达水平检测
免疫印迹法，具体操作方法同前。
③线粒体损伤评价
a: 线粒体功能评价
心肌线粒体的提取：取出心脏迅速剪碎，用线粒体分离介质Ⅰ去除血污，称重，匀浆，600 r/min
离心5 min，取上清液于10 000 r/min 离心10 min。沉淀用介质Ⅱ悬浮，10 000 r/min离心10 min，沉淀悬浮在0.5 ml介质Ⅱ中，制备成线粒体悬液备用。BCA法测定线粒体悬液蛋白质的浓度。操作皆在4℃以下进行。
线粒体呼吸酶复合体I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ的变化：分光光度计法测定心肌线粒体复合体活性，复合体I(NADH-泛醌还原酶)，复合体Ⅱ(琥珀酸—泛醌还原酶)，复合体Ⅲ(泛醌，细胞色素C还原酶)，复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶)。线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ的测定；依据Trounce等的方法【39】，测定混合液（10×buffer: 0.5mol/L Tri s·HCl pH8.1, 1%BSA, 10μmol/L抗霉素A, 3mmol/L KCN, 0.5mmol/L CoQ1）。线粒体终浓度为20μg/ml，DCPIP浓度2μmol/L-100μmol/L，200μmol/L NADH启动反应，37o C 600 nm波长处扫描2min。另以上述体系加入3μmol/L鱼藤酮作为测定空白。complexⅡ测定：线粒体蛋白稀释至0.5mg/ml,加入测定混合液（10×buffer: 0.5mol/L, pH7.8的磷酸缓冲液，20mmol/L EDTA 1% BSA, 10μmol/L抗霉素A, 3mmol/L KCN, 2mmol/L ATP, 0.5mmol/L CoQ1）。线粒体终浓度为20μg/ml，DCPIP浓度2μmol/L-100μmol/L, 10mmol/L琥珀酸启动反应，37o C 600 nm 波长处扫描2min。complexⅢ测定混合液（10×buffer: 1mol/L, pH7.8的磷酸缓冲液，3mmol/L氰化钾, 0.8% tween-20， 20mmol/L decylubiquinol）细胞色素C浓度范围5-80μmol/L。线粒体终浓度为20μg/ml启动反应，37o C 550 nm扫描 2min。ComlexⅣ测定混合液（50mmol/L, pH7.8的磷酸缓冲液，0.1% BSA, 0.2% tween-20）, 还原性细胞色素C 浓度范围5-80 μmol/L，线粒体启动反应 (终浓度为20μg/ml)，550 nm波长处检测，扫描2min。
线粒体呼吸控制率（RCR）变化：氧电极法RCR：RCR 能够反映线粒体膜的完整性和氧化磷酸化的偶联程度。在生物测氧仪反应槽中加入测定介质2～3ml稳定10min后，将最大相对氧浓度值设定为20，加入新鲜分离的心肌线粒体悬液20ul，记录一段时间基线后加入外源底物琥珀酸二钠（0.2M）20μl，出现IV 态呼吸；记录约两分钟后，加入ADP（50mM）8μl，出现III 态呼吸，待ADP 完全消耗后线粒体又恢复到IV态呼吸；加入ADP 时（III 态）的呼吸速率与ADP 耗竭后（IV 态）的呼吸速率的比值即为RCR。
能量代谢评价（ATP，ADP，AMP）：高效液相色谱（HPLC）法测定：色谱条件：Hypersil BDSC 色谱柱（250mm×4.0mm×5μm），流动相为215mmol/L KH2PO4, 2.3mmol/L TBAHS与3.5%乙腈，pH 为6.25。流速为0.7ml/min。紫外检测波长为210nm。具体为，心肌组织用预冷的0.42mol/L的高氯酸制成5%的匀浆，再加入1mol/L KOH中和，使pH在5.0-7.0范围内，超声波将线粒体膜打碎，能量物质释放到溶液中，3000rpm离心15min(4o C),上清液用0.2μm的微孔滤膜过滤，取10μl上HPCL 柱进行分析。
b: 心肌细胞氧化应激水平评价
脂质过氧化物产生：MDA检测（比色法测定）
抗氧化酶活性：超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）活性测定（比色法测定）。
线粒体氧化损伤：提取心肌线粒体（同前），测定线粒体DNA（mt DNA） 8-OH-dG含量（酶标仪方法进行定量测定）；提取心肌线粒体和细胞核，检测由线粒体DNA(mtDNA)编码的呼吸酶复合体I的组成成分ND6和核DNA编码的H19的表达，以ND6与H19的比率代表mtDNA氧化损伤情况（免疫印迹法）。
④心肌细胞凋亡分析
细胞凋亡检测：TUNEL染色法，检测细胞凋亡，具体方法，见前面；
凋亡蛋白蛋白质表达水平：促凋亡Cyt c, Bax, Caspase-9与抗凋亡Bcl-2，Bcl-xL蛋白质表达水平检测（免疫印迹法，同前）
（4）在细胞水平上观察外源性多胺恢复老龄心肌细胞IPC保护的能力及机制
应用D-半乳糖诱导分离培养的乳鼠心肌细胞衰老。应用模拟缺血/缺氧液复制IR与IPC心肌细胞模型。在外源性多胺处理的IPC心肌细胞模型上，再予多胺合成抑制剂（DFMO）、自噬抑制剂（3-MA）及mPTP开放剂(Atr)干预，观察外源性多胺对衰老的IPC 心肌细胞自噬、线粒体损伤及细胞凋亡影响。
技术路线：
具体步骤：
①D-半乳糖诱导分离培养的乳鼠心肌细胞衰老、衰老细胞鉴定及实验分组
心肌细胞衰老的诱导：出生3 d以内的大乳鼠，乙醇消毒后处死，取心尖部分放人DMEM液中剪碎，分3次进行消化，上清收集于大离心管中,260目尼龙网过滤，离心后弃上清收集下沉的细胞，接种在培养瓶内，于37℃恒温二氧化碳培养箱中孵育1-1.5 h进行差速贴壁以清除非心肌细胞，再加入5’-溴脱氧尿嘧啶以抑制非心肌细胞培养。24h后换液后，换液时加入10g/L D-半乳糖诱导细胞48h，然后换正常培养液继续培养7天，细胞衰老鉴定，建立衰老的心肌细胞膜型。
衰老心肌细胞的鉴定: 苏木精一伊红染色，光镜下观察细胞形态；β-半乳糖苷酶染色，普通光镜下观察细胞着色情况；MTT法测定D-半乳糖作用后心肌细胞存活率。
实验分组：（n=6）
对照组control, C）：诱导衰老的心肌细胞DMEM培养基正常培养，培养时间同实验组。
模拟缺血再灌注组（ischemia/reperfusion, IR）：心肌细胞诱导衰老后进行模拟缺血60min，再灌180min处理。（模拟缺血缺氧液为无血清、无糖培养基，pH=6.8, 置于缺氧罐中，通入95%氮气，5% 二氧化碳）模拟缺血预适应组（ischemic precoditioning, IPC）：心肌细胞诱导衰老后先经历三次10min缺血，10min的再灌注处理，之后进行模拟缺血60min再灌注180min处理。
外源性多胺给药组（polyamines-IPC, PAs-IPC）：心肌细胞进行模拟缺血预处理的三次复灌注过程中给予多胺, 多胺给药浓度为：spermine, 1μmol/L; spermindine 100μmol/L, 以下应用浓度相同。
抑制剂干预组：细胞处理方法同外源性多胺给药组，抑制剂在多胺给药前30 min加入。
多胺抑制剂组（PAs-IPC-DFMO）：Difluoromethylornithine（DFM O, 2mmol/L）
自噬抑制剂组 (PAs-IPC-3-MA）： 3-methyladenine (3-MA, 2mmol/L)。
线粒体通透转运孔开放剂组 (PAs-IPC-Atr）：Atractyloside (Atr, 5mmol/L)。
②心肌细胞自噬观察
a.透射电子显微镜观察双层膜的自噬体（同前）。
b.自噬体膜标志蛋白（LC3-GFP）转染细胞，检测自噬体。LC3是自噬体膜的成分之一，被认为是自噬检测的特异性标签。各组细胞处理好后，用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染试剂将构建好的pLC3-GFP重组质粒转染到心肌细胞，4h后荧光显微镜下观察LC3在核周的点状荧光分布。
c.丹(磺)酰戊二胺(MDC)荧光染色法，检测自噬体。MDC也是一种特异性的自噬体标记物，他可被细胞吸收并选择性的聚集与自噬体中，激光共聚焦显微镜下可见染上MDC荧光的自噬体。
d.自噬相关蛋白Beclin1, LC3 蛋白表达水平检测（免疫印迹方法,见前面）
③线粒体损伤的评价
心肌线粒体功能评价：（见前面）
氧化应激水平：a.培养液中LDH检测细胞存活率（比色法）。b.超氧化物阴离子Dihydroethidium （DHE）荧光探针检测细胞内ROS的水平。DHE被活细胞摄入后，可在细胞内的超氧化物阴离子作用下脱氢产生ethidium。Ethidium和RNA或DNA结合产生红色荧光, 可在荧光显微镜下进行见检测。
④心肌细胞凋亡
Anexin-V标记,流式细胞仪检测细胞凋亡。Hoechst33342染色，荧光显微镜检测细胞凋亡。促及抗凋亡蛋白Cyt c, Bax, Caspase-9与Bcl-2, Bcl-xL蛋白表达水平检测。(免疫印迹法，见前面)。
（5）在细胞水平上观察外源性多胺对衰老心肌细胞自噬、线粒体损伤及细胞凋亡的影响，通过调控自噬和调控mPTP开放，探讨多胺发挥作用依赖的信号级联应用D-半乳糖诱导分离培养的乳鼠心肌细胞衰老。在给予外源性多胺处理衰老的细胞之后，再分别给予①自噬诱导剂(rapamycin，rap)，②自噬抑制剂(3-methyl adenine, 3-MA)，③自噬相关基因atg-5 siRNA，④mPTP开放剂(atractyloside, Atr)及⑤mPTP抑制剂(cyclosporine A, Cys A)干预，观察多胺对衰老的心肌细胞自噬、线粒体损伤及细胞凋亡的影响。
技术路线：