外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达和胞外分泌策略研究综述
提高大肠杆菌高密度发酵可溶性表达量研究
提高大肠杆菌高密度发酵可溶性表达量研究目的：提高外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。
方法：采用大肠杆菌K12菌株，含有表达某种抗体类蛋白的表达质粒，通过在发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的方式，检测不同发酵时间表达量变化情况，评估每种物质对于目的蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的影响。
结果：同时加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的发酵批次可溶性蛋白表达量最高。
结论：说明在大肠杆菌高密度发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸有助于提高目的蛋白的可溶性表达。
标签：大肠杆菌；高密度发酵；甲硫氨酸；亮氨酸；异亮氨酸；可溶性表达大肠杆菌是目前常用的蛋白发酵菌体，采用高密度发酵技术（High cell density cultivation，HCDC）不仅可以减少培养体积、提高目的蛋白产量，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高在市场上的竞争力[1]。
但外源蛋白在获得高水平表达的同时，容易形成包涵体，包涵体中的多肽链折叠错误，没有活性，必须通过复杂的复性过程才能获得功能正常的蛋白，但成功率低[2]，特别是含二硫键较多的包涵体蛋白，在复性过程中容易发生二硫键的错配，从而使蛋白质失去生物学活性。
蛋白的可溶性表达则可避免变、复性过程，明显简化后续纯化工艺，保证功能蛋白的功能。
因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。
目前针对于高密度发酵过程中蛋白可溶性表达的研究主要停留在对大肠杆菌宿主细胞[3]、比生长速率、诱导时机[4]、诱导温度[5]、培养基成分[6]、碳源种类[7]、表达载体启动子[8]、融合标签[9]等。
关于发酵过程中补入氨基酸对可溶性蛋白表达的影响，国内目前的相关研究报道偏少。
国外研究表明，在大肠杆菌表达蛋白期间，正亮氨酸残基的引入会导致正常合成的蛋白结构或功能改变[10]，引起可溶性蛋白表达量的降低。
在发酵过程中，补入甲硫氨酸，可以确保细胞获得过量的甲硫氨酸，从而减少了甲硫氨酰tRNA不正确的加载正亮氨酸的概率。
外源蛋白在大肠杆菌中的表达
外源蛋白在大肠杆菌中的表达大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然界中的细菌，也是一种常见的模式生物。
由于其简单易于培养、遗传学特性鲜明等特点，大肠杆菌在生物学和生物工程领域被广泛应用。
其中，外源蛋白的表达是一项重要的研究内容。
外源蛋白是指从外部来源引入到大肠杆菌中表达的蛋白质。
在生物医学、食品工业、农业等领域，外源蛋白的表达往往是研究和生产的重点。
通常情况下，外源蛋白的表达分为两种方式：一种是利用质粒载体表达，另一种是利用大肠杆菌本身的表达系统表达。
利用质粒载体表达是外源蛋白表达的常用方法之一。
质粒是一种环形DNA分子，可以在大肠杆菌中复制并表达目标蛋白。
通常情况下，质粒载体中包含了目标蛋白的基因序列，以及启动子、终止子、转录因子结合位点等调控元件，这些元件可以控制目标蛋白的表达水平和时机。
将质粒载体转化到大肠杆菌中后，使用适当的培养条件和诱导剂，就可以实现外源蛋白的表达。
除了利用质粒载体表达外，大肠杆菌本身的表达系统也可以用于外源蛋白的表达。
大肠杆菌中的表达系统包括转录、翻译和蛋白质后修饰等过程。
利用这些系统表达外源蛋白时，需要将目标蛋白的基因序列插入到大肠杆菌基因组中的适当位置，或者通过基因重组等技术将目标蛋白的基因序列插入到大肠杆菌染色体的表达区域。
通过适当的培养条件和诱导剂，就可以实现外源蛋白的表达。
外源蛋白的表达不仅仅是将目标蛋白表达出来，还需要对表达条件、表达效率、纯化方法等进行优化。
例如，选择适当的启动子和调控元件，可以调整目标蛋白的表达水平和时机；使用高效的纯化方法，可以提高目标蛋白的纯度和产量。
同时，还需要对表达过程中可能出现的问题进行分析和解决，例如蛋白质的折叠和结构问题、毒性问题等。
外源蛋白的表达是大肠杆菌研究和应用的重要领域之一。
通过对表达条件、表达效率、纯化方法等的优化和改进，可以实现外源蛋白的高效表达和高纯度纯化，为生物医学、食品工业、农业等领域的研究和生产提供有力支持。
应用硫氧还蛋白促进外源蛋白在大肠杆菌的可溶性表达
应用硫氧还蛋白促进外源蛋白在大肠杆菌的可溶性表达安乃莉;张智清;王嵩;刘红兵;曾革非;姚立红;陈爱君【期刊名称】《病毒学报》【年(卷),期】1999(15)2【摘要】为了观察硫氧还蛋白（ＴｒｘＡ）促进外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的作用，我们从质粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）上克隆了ｔｒｘＡ基因，构建了ＴｒｘＡ表达质粒ｐＴ－ＴｒｘＡ。
将该质粒与其它蛋白基因的表达质粒共同转化Ｅｃｏｌｉ并同时获得表达。
结果表明，共表达ＴｒｘＡ可以明显促进外源蛋白，如甲状旁腺激素相关蛋白（ＰＴＨｒＰ）、ＰＴＨｒＰ受体（ＰＴＨｒＰ－Ｒ）和血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的可溶性表达。
说明共表达ＴｒｘＡ有助于外源蛋白的正确折叠，防止包涵体的形成。
【总页数】6页(P130-135)【关键词】硫氧还蛋白;共表达;外源蛋白;大肠杆菌【作者】安乃莉;张智清;王嵩;刘红兵;曾革非;姚立红;陈爱君【作者单位】中国预防医学科学院病毒所病毒基因工程国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q936【相关文献】1.外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达和胞外分泌策略研究综述 [J], 陈阿娜;叶生梅;孟娜;刘艳2.硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主促进含半胱氨酸残基的重组蛋白可溶性表达 [J], 童芹;杨运桂;张惠堂;陈燕;杨胜利;龚毅3.外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的新策略 [J], 赵志虎;张用书;刘传暄;马清钧4.硫氧还蛋白促进人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中高效可溶表达 [J], WAN Aini;XU Dongsheng;CAI Yanfei;CHEN Yun;JIN Jian;LI Huazhong5.外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略 [J], 朱红裕;李强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达方法研究进展
Vol.53,No.07. 2019DOI：10.3969/j.issn.2095-1205.2019.07.23提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达方法研究进展张真汪燕马振刚（重庆市动物生物学重点实验室，重庆市媒介昆虫重点实验室，重庆师范大学重庆401331）摘要大肠杆菌表达系统与其他外源表达系统相比具有重组蛋白产量高、易操作、生长速度快和成本低等特点。
通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种既高效又经济的途径。
然而，外源蛋白在大肠杆菌中表达时往往处于还原性环境的胞质中，而在胞质中外源蛋白不易形成二硫键，出现外源蛋白无法正确折叠的现象，从而形成不可溶的包涵体。
文章在近年提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达研究的基础上，从选择适当的载体和宿主、外源蛋白与其他辅助蛋白共表达、降低蛋白合成速率、提高周质蛋白表达、融合标签表达、肽标签表达、替换蛋白质中的氨基酸、改变培养基的条件等方面进行了综述，为研究者根据外源蛋白自身特点，优化外源蛋白可溶性表达方法提供了参考。
关键词外源蛋白；可溶性表达；大肠杆菌；包涵体中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:2095-1205(2019)07-37-04 Advances in Improving the Soluble Expression of EscherichiaColi Recombinant ProteinZhang Zhen Wang Yan Ma Zhengang（Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, Chongqing Key Laboratory of Vector Insects, Chongqing Normal University,Chongqing 401331）Abstract：Compared with other exogenous expression systems, escherichia coli expression system has the characteristics of high yield, easy operation, fast growth rate and low cost of recombinant protein. It is an efficient and economical way to express recombinant protein through escherichia coli. However, when expressed in escherichia coli, exogenous proteins tend to be in the cytoplasm of the reductive environment, whereas in cytoplasm, exogenous proteins are not easy to form disulfide bonds, and foreign proteins cannot fold properly, thus forming insoluble inclusion bodies. On the basis of improving the soluble expression of escherichia coli recombinant protein, the article summarized from selecting the appropriate carrier and the host, exogenous proteins are co-expressed with other helper proteins, reducing the rate of protein synthesis, improving the periplasmic protein expression, expression of fusion tag expression, peptide tag expression, replacing amino acids in a protein, changing the condition of culture medium and other aspects, providing a reference for researchers to optimize the soluble expression of exogenous proteins according to their own characteristics.Key words：exogenous proteins; soluble expression; escherichia coli; inclusion body目前大部分蛋白质功能研究需要的是可以大量纯化并且可溶的蛋白质，但不管是天然提取还是使用化学合成纯的蛋白质都是非常困难的[1]，而DNA重组技术提供了一种经济的外源蛋白获取方式。
在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略
在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。
大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。
尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。
这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。
但知识的大量积累还是有助于为表达方面某些特定的困难提供一般的解决方法。
大肠杆菌作为表达系统的主要障碍包括：不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。
另一方面，许多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物学活性，因而也就可以用大肠杆菌来表达。
如何实现外源基因在原核细胞中的有效表达，自60年代以来，对影响外源基因在其表达体系中表达效率的各个因素作了大量实验研究，并有多篇归纳性综述发表[1，2，3]。
国内针对外源基因在原核细胞中高效表达的关键因素，构建了高效表达载体[4]，并在此基础上成功表达了一系列细胞因子的基因[5，6，7]。
我们在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行全面的总结，以期有助于我国在这方面的研究。
1.有效表达载体的构型构建表达质粒需要多种元件，需要仔细考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。
E.coli表达载体的基本结构如图1所示[8]。
启动子(以杂和的tac启动子为例)位于核糖体结合位点（RBS）上游10-100bp处，由调节基因（R）控制，调节基因可以是载体自身携带，也可以整合到宿主染色体上。
E.coli的启动子由位于转录起始位点上游约35bp的六核苷酸序列（-35区）和一短序列隔开的另一六核苷酸序列（-10区）组成[9,10,11]。
外源基因在大肠杆菌中的表达
PL 和 PR 表达系统
转录调控的机理
由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL 、 PR 启动子转录的
阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消失是相当困难的。
由于 PL 和 PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几 个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用 PL 或 PR 表达系统。
缺陷 在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其 中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。 在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃ 提高到 42℃ 需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效 果，对重组蛋白表达量有一定的影响。
T7 表达系统
大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一 体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。
T7 表达系统
T7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。
T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列。
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
PL 和 PR 表达系统存在的问题
这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi﹥5mmol/L 时抑制，Pi﹤1mmol/L 时激活)，具有较高的转录水平。
外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略
如何提高目的蛋白的可溶性表达在大肠杆菌中，当外源蛋白高水平表达的时候，极易形成包涵体，为蛋白纯化等下游工作带来很大的麻烦。
下面是一些可以参考的有助于提高目的蛋白可溶性表达的实验方案：1.降低蛋白合成的速度。
可以通过以下方法实现：a.降低培养温度b.使用弱启动子c.使用低拷贝数的质粒表达载体d.降低诱导物的浓度2.改变培养基a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子b.加入缓冲液保持pH稳定c.加入1%的葡萄糖，抑制lac启动子d.加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子e.加入乙醇，thiols and disulfides等？3.与分子伴侣或折叠酶共表达常用的分子伴侣有：GroES-GroEL，DnaK-DnaJ-GrpE，ClpB常用的折叠酶有：peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPI's)disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC)protein disulfide isomerase (PDI)4.分泌表达。
使目的蛋白分泌到周质空间周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成，而胞内则是还原性的。
周质空间有折叠酶DsbA和DsbC的存在，帮助蛋白正确折叠。
周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解。
可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。
5.使用特定的菌株AD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB).Origami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor).6.与可溶性partner融合表达7.表达目的蛋白的一个片段> 70 kDa的蛋白在大肠杆菌中是很难表达的。
8.体外去折叠，重新折叠外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略摘要：长期以来，大肠杆菌一直是表达外源蛋白的首选表达系统．但由于外源蛋白在表达过程中容易被宿主细胞蛋白酶降解或者形成包涵体，其应用受到了限制．本文综述了在大肠杆菌中表达可溶外源蛋白的策略和进展，以期提高具有生物活性的外源基因的表达水平．1 前言：大肠杆菌具有遗传性状了解透彻、生长快、培养经济、表达水平高、待选质粒和宿主多等特点，在基因工程技术领域成为首选的表达系统．但是外源蛋白往往在获得高水平表达的同时，容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵体．目前国内外对蛋白质体外复性研究较多，但其过程往往费时、费力，且不经济，因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景．2 宿主与载体的选择2．1宿主的选择2．1．1选择有利于外源蛋白可溶性表达的宿主外源蛋白在大肠杆菌细胞质或细胞周质中表达时，容易被宿主本身表达的蛋白酶降解．因此，选择蛋白酶缺失的宿主非常有利于外源蛋白的表达，尤其是外源可溶蛋白和分泌表达的蛋白．Ignatova等采用不同的大肠杆菌宿主表达青霉素酰化酶，优化培养基后，发现蛋白酶缺失的宿主BL21(DE3)表达该活性可溶蛋白优势明显．Schein等发现缺失Ion蛋白酶的大肠杆菌宿主能显著地提高RNases的可溶分泌表达水平．除此之外，由于大肠杆菌细胞质环境是还原性的，不利于形成二硫键，因此，如果能构建促进二硫键形成的宿主，也将有可能极大地提高可溶蛋白的表达水平2．1．2外源蛋白与其他辅助蛋白共表达在强启动子调控下，外源蛋白在大肠杆菌中的表达水平往往比较高，而宿主自身的折叠辅助蛋白(分子伴侣与折叠酶)显然无法满足新生肽段正确折叠的要求．因此，共表达分子伴侣和折叠酶就有可能为外源新生肽段提供充分的辅助折叠支持，进而增加可溶活性蛋白的表达量．目前用于共表达以增加外源蛋白可溶性的辅助蛋白有GroEL／ES 和Dn水一DnaJ-GrpE、引发因子(Trigger factor)、硫氧还蛋白(Thioredoxin)和折叠酶fFoldase)等．需要注意的是，应根据外源蛋白的特点有选择性地共表达分子伴侣和折叠酶．例如在大肠杆菌中共表达热激蛋白GroEL／ES能增加某些蛋白(0c 一1，6一岩藻糖基转移酶、浸麻芽孢杆菌环式糊精葡聚糖转移酶、谷氨酸消旋酶剐、过氧化物歧化酶、酪氨酸激酶、人胶原酶原)的可溶性，却对其他一些蛋白(人型干扰素受体2c亚基的胞外段、噬菌体P22结构蛋白、人酸性富含胱氨酸分泌型蛋白无增溶效果．又如GroEL／ES与人酪氨酸激酶Lck共表达并不能增加后者的可溶性，而硫氧还蛋白却能显著地促进该外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达．除此之外，温度也可能会对共表达折叠辅助蛋白的效果产生重要的影响．例如preS2一S，_B一半乳糖苷酶与DnaK和DnaJ分子伴侣共表达，能在30～42℃范围内提高可溶蛋白的表达水平，而共表达GroEL和GroES 分子伴侣却只能在30℃条件下取得比较好的效果．值得一提的是，如果将几种折叠辅助蛋白分子同时共表达，有可能获得比单独表达某种折叠辅助蛋白更好的效果．Jiro等5J将GroEI／ES，Trx或DsbBD与谷氨酸消旋酶同时共表达，活性谷氨酸消旋酶的产量上升了2．2～2．3倍．在某些情况下，共表达那些能增加蛋白可溶性和促进大肠杆菌生长的蛋白也能起到良好的效果．例如Kallio等在大肠杆菌中共表达透明颤菌血红蛋白，发现该蛋白对活性蛋白的表达有明显促进作用．2．2载体的选择2．2．1启动子的选择目前有许多启动子应用于外源蛋白的表达．选择启动子可溶性表达外源蛋白，需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性以及经济因素等各方面加以考虑．如果外源蛋白分泌表达，蛋白表达速率必须加以优化，以防止大肠杆菌的转运系统达到饱和状态．因此，需要选择的启动子的强度应尽量与宿主细胞的转运能力保持一致．如果所表达的外源蛋白对细胞的生长有毒害作用，应尽量选择高度可抑制性和诱导性启动子，以减少对宿主细胞的不利影响．另外，还需要从经济和启动子诱导的操作性角度选择合适的启动子．目前应用相当广泛的PET系统，调控紧密，能使克隆到T7启动子下游的外源目的基因在IPTG(或乳糖)诱导下大量表达．但外源蛋白的过量表达往往形成包涵体，高水平的mRNA 也容易导致核糖体的破坏和细胞死亡，而且T7RNA聚合酶可能导致质粒和外源基因表达的不稳定．专门用于外源蛋白低温诱导的温度敏感型启动子冷激蛋白CspA 能在适当低温条件下达到较高的可溶蛋白表达水平．Csp启动子比较适用于那些易形成包涵体或不稳定基因产物的外源蛋白的表达．除此之外，阿拉伯糖启动子、pH 启动子、渗透压启动子、溶氧启动子等也日益为人们所重视，并且有的已经成功应用于大规模生产过程．2．2．2构建融合蛋白通过增加连接体(Linker)而改变蛋白序列有可能改善蛋白折叠、提高蛋白的溶解性、增强抗蛋白酶降解性、增加蛋白产量以及在培养基中分泌表达．而对于那些外源小分子量蛋白或某些分子量较大蛋白的片段，只能考虑构建融合蛋白才能顺利表达．大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)与目的蛋白融合表达，除了易于分离和提高目的蛋白稳定性外，还常具有在细胞周质分泌表达的优点．Clement等将重组单链抗体(scFvs)~ C末端与MBP融合后在细胞质内表达，发现融合蛋白的可溶性和稳定性均比未融合蛋白有了显著的提高．Spangfort等将HIV人T淋巴细胞受体CD4与麦芽糖结合蛋白融合表达(LB培养基，30℃)，发现融合表达产物可溶，并被转运到细胞周质．多聚组氨酸(Polyhistidine)与外源蛋白融合后能通过固定离子亲合层析给外源蛋白的分离纯化带来极大便利，但组氨酸的数目与融合部位对融合蛋白的表达水平及其溶解性有显著影响．硫氧还蛋白(Thioredoxin)与许多外源蛋白融合后能促进外源蛋白的可溶性表达，这种效应在较低温度下尤为显著[2引．其他可供选择的融合蛋白还有钙调蛋白结合蛋白(Calmodulin—binding peptide)、DsbA和谷胱甘肽一S一转移酶(GST)及天然大肠杆菌蛋白NusA，GrpE，BFR等．需要注意的是，温度可能对融合蛋白可溶性表达的效果有重大影响．另外，以融合蛋白方式表达外源蛋白有三点需要慎重考虑：首先，融合表达会增加一个切除融合片断的程序，该程序往往需要昂贵的高特异性的因子，相应地增加了成本；其次，即使是较高特异性的因子也往往会对目的蛋白发生作用，造成目的蛋白损失和杂蛋白增多；最后，即使融合蛋白表达的水平较高，经过各种分离程序之后，目的蛋白的量可能非常有限．2．2. 3分泌表达由于大肠杆菌的细胞质是一个还原性环境，外源蛋白在细胞质内往往难以正确折叠．分泌表达外源蛋白能简化蛋白纯化工艺，除此之外，由于分泌表达后信号序列的切除，外源蛋白前端的甲硫氨酸残基不复存在，保证了外源蛋白N一端的纯正性．然而外源蛋白分泌表达是一个非常复杂的过程，常常会遇到诸如不完全的跨内膜转运、转运装置的容量不足以及蛋白降解等问题．许多因素，包括外源蛋白的大小、氨基酸组成及导肽的类型都会对蛋白的转运造成影响．为获得外源蛋白的高效分泌表达，应尽量优化翻译水平，使其与大肠杆菌的转运装置的容量保持一致．共分泌表达分子伴侣或向培养基中加入低分子量的添加剂，往往会提高外源蛋白在细胞周质内分泌表达的水平.2．2．4密码子的使用密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响．研究人员已经对蛋白表达过程中稀有密码子替换的效应进行了深入的研究，但并没有获得一致性的结论．稀有密码子存在对某些蛋白质的表达具有负面影响，这种负面效应可能缘于某些tRNA相对不足，或者是密码子一反密码子配对的能量差异．在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译．虽然在某些情况下，密码子的优化可以获得更高水平的蛋白表达，但研究人员发现，基因的表达水平并非总是受稀有密码子的限制，而且rRNA的丰度也未必与密码子的使用相关联．值得注意的是，在某些基因中使用稀有密码子能显著降低肽链的延伸速率，从而有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达口．然而，对于特定外源蛋白的表达，一个密码子优化的程序可能是有益的，因为经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性．3 培养条件与诱导方法的选择3．1降低培养温度最适合大肠杆菌生长的温度在37～39℃之间，在此温度下表达外源蛋白极易生成包涵体．低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例．但培养温度也有一个下限，一般为8～10℃，因为在此温度以下，大肠杆菌将停止生长，蛋白也基本上停止表达．定点突变可能会对表达可溶蛋白的温度选择有重要影响．Mainfroid等发现人丙糖磷酸异构酶37℃下能在大肠杆菌中可溶表达，而丙糖磷酸异构酶的两个突变体Metl4Gln和Arg98Gln 却在37℃下形成没有活性的包涵体，在28℃下才获得可溶表达．在某些情况下，不同的培养温度都能表达可溶性蛋白，但是降低培养温度具有3个优势：首先，低温下培养基中的氧气溶解性更高，高密度培养时，能有效防止菌体厌氧生长，防止对菌体生长和外源蛋白表达有抑制作用的乙酸的生成；其次，低温培养时，抗生素的半衰期更长，质粒稳定性也可能会相应增加；最后，降低培养温度能降低可溶蛋白降解速率，提高可溶蛋白的稳定性．降低培养温度能提高外源蛋白可溶性的原因目前还没有满意的解释．不少研究人员认为，低温能降低蛋白质合成的速率，改变多肽折叠的动力学，从而导致正确折叠的蛋白增加．但是，蛋白表达速率与蛋白可溶性之间并不存在必然的联系．Schein等通过改变SD 序列与起始密码子ATG之间的距离来改变Mx蛋白合成的速率，发现该蛋白在37℃都会形成包涵体，而底物不足导致蛋白合成速率下降时，并不能获得外源蛋白可溶性表达量的增加．低温培养更有利于可溶性蛋白表达的另一个原因可能是外源蛋白在低温下表达时，蛋白区室化效率更，也可能在较低温度下，与蛋白折叠和蛋白聚合相关的蛋白的表达更有利于菌体形成稳定的可溶性蛋白．3．2培养基的组成培养基的组成对可溶外源蛋白的表达有显著影响．由于复合培养基成分复杂，在发酵过程中很难准确分析哪些成分对菌体细胞生长和蛋白表达有重要影响，所以一般推荐使用合成培养基．但合成培养基往往又存在菌体生长较慢和菌体浓度较低的问题，因此研究人员为此做了许多卓有成效的工作．一般来讲，在表达外源蛋白时，要尽量避免由于营养物质缺乏导致的菌体生长抑制的情况发生．外源蛋白的表达显著地受葡萄糖浓度的影响，虽然葡萄糖比较适合作为菌体生长的碳源，但在诱导表达时期，需尽量保持低水平的葡萄糖．以甘油代替葡萄糖作为表达外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效应的有效途径之一．在诱导时期，流加营养物质也有可能显著提高可溶蛋白的表达量．在某些情况下，向培养基中添加蛋白抑制剂也能提高可溶蛋白量．Palva等在培养基中添加蛋白酶抑制剂，对生产来自枯草杆菌的干扰素非常有效．Slabaugh将核苷酸还原酶抑制剂羟基脲添加到培养基中，发现核苷酸还原酶亚基vvR1量明显上升．如果外源蛋白在细胞周质表达，向培养基中添加适当浓度的某些非代谢性糖类(比如蔗糖也可能有利于可溶蛋白的表达．当外源蛋白在细胞质表达时，非代谢性糖类由于细胞膜的阻碍不能扩散到细胞质中，但这些糖类的存在会增加培养基的渗透压，进而导致细胞质内渗透压防护剂(比如甘氨酰一三甲铵乙内酯)的积累，这种渗透压保护剂与周质中的非代谢性糖类一样，能抑制细胞质中外源蛋白的聚合，从而提高可溶蛋白的表达水平．外源蛋白二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程，向培养基中添加适量的金属离子，可能提高这些酶类的活性，因此也有可能增加可溶蛋白的表达量．某些外源蛋白的活性和稳定性与某些金属离子密切相关，因此向培养基中添加外源蛋白所需金属离子也可能提高蛋白的可溶性和稳定性．另外，良好的通气能有效降低培养基中对菌体表达蛋白有重要影响的CO2和乙酸的浓度，也有可能获得高产量的活性蛋白．在蛋白表达过程中，培养基的pH 值也会对可溶蛋白的表达产生重要影响，需要根据菌体和目的蛋白的特点选择合适的pH值．3．3诱导条件在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白时，诱导时机和诱导剂的用量必须严格控制．在摇瓶培养时，普遍认为在低菌体浓度下诱导比较合适，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白．然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达．工业上往往采用高菌浓度补料诱导制备大量可溶蛋白，比如纤维原细胞生长因子一皂角苷融合蛋白的生产就是采用补料方法达到A600=85的高菌浓度后，在30℃下用IPTG诱导表达，分离纯化后1 鲫单位可溶性丝毒素达到了2．2 mg／L．也可考虑在高菌浓度下低温诱导采用冷激启动子高效表达可溶性蛋白．诱导剂种类及其浓度都会对外源蛋白表达产生重要影响，应根据所采用的表达系统(比如启动子的强弱)和外源蛋白的特点优化选择在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平．Saraswat等以乳糖流加诱导的方式表达重组人白细胞介素一，发现乳糖流加诱导的可溶重组人白细胞介素一2的表达水平(9．3 g／L)显著高于一次性乳糖流加诱导的表达水平(5．4 g／L)．4 通过改变蛋白结构增加可溶性自从包涵体被发现以来，其形成原因一直是研究人员探讨的焦点，实现外源蛋白的可溶性表达也依赖于对该问题的解答．降低培养温度并不能促进所有外源蛋白的可溶性表达，人们也无法解释42℃时某些外源蛋白完全可溶的情况，而对这些蛋白进行定点突变却能在所有温度下获得可溶性表达．值得注意的是，虽然定点突变可能增加外源蛋白的可溶性，但不能简单地将这种效应归因于蛋白疏水性和某些特定氨基酸含量的改变．这种可溶蛋白的增加也可能是突变后外源蛋白对蛋白降解的稳定性的增加或者与分子伴侣相互作用增强的次级效应所致．Murby等在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒主要糖蛋白的101个氨基酸片段时，将该片断的若干个苯丙氨酸残基进行了突变，发现病毒糖蛋白片段的溶解性和对蛋白酶的稳定性有了显著的提高，而且突变后的蛋白片段与原蛋白片段具有相同的抗原性和二级结构．定点突变还可能改变温度对蛋白可溶性的效应．需要引起注意的是，虽然可以通过突变导致蛋白降解的位点来提高外源蛋白对蛋白酶的稳定性，但是这种突变可能会对蛋白活性造成极大影响．目前，研究人员已经开始根据己知蛋白的结构和活性特征，利用计算机有针对性地对蛋白突变进行设计，大大地提高了获得具有高活性和高稳定性蛋白的效率和可能．5 结论与展望外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达是一个系统工程，其中包含许多环节，环环相扣，任何一个环节的瓶颈都会对可溶蛋白的表达效率产生不良影响．因此，需要在研究过程中积累经验，并及时汲取相关领域研究的最新进展，找出制约可溶蛋白表达的关键因素，以期做到“对症下药”和“有的放矢”．在过去的几十年里，人们对蛋白质体内折叠过程、包涵体形成机理的研究日益深入，基因工程手段也日臻成熟，使大量表达外源活性蛋白成为可能，各种生物活性蛋白需求的迅猛增长也促进了研究方法和技术手段的进步．毫无疑问，随着蛋白质折叠调节机制、蛋白质体内复性机理等方面的探索和经验积累，在大肠杆菌中可溶性表达外源蛋白的技术将会越来越成熟，成本也将逐渐降低，并最终造福整个人类社会。
外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略
《生物工程进展》2001,V ol.21,N o.6专 论外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略 钟向阳 石歆莹 周宏灏(中南大学湘雅医学院基础与临床药理研究所,中国湖南 长沙 410078)摘要 外源基因在大肠杆菌中表达是对基因重组技术的成功应用。
外源基因在不同的大肠杆菌表达系统中表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置:胞质,胞质膜,胞周质,胞外膜和胞外培养基,五种表达定位方式各有其特点和用途。
关键词 大肠杆菌 外源蛋白 表达定位作者简介:钟向阳,男,博士。
石歆莹,女,博士生。
周宏灏,男,教授,博士生导师。
基因重组技术能从数量和质量上提供天然组织中难以得到的蛋白质等产物。
以大肠杆菌为宿主的体系是表达外源蛋白的首选体系,其遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、易于操作。
虽然人们开发出了多种真核表达体系,以克服大肠杆菌含内毒素、缺少翻译后修饰、高表达时易折叠错误等不足,但尚不能完全取代大肠杆菌表达体系。
大肠杆菌细胞学结构特点使表达的外源蛋白可能定位的五个位置是:胞质,胞质膜,胞周质,外膜和胞外培养基[1]。
1 表达的外源蛋白定位在胞内将外源DNA 或目的基因与表达载体构建成DNA 重组体,转化大肠杆菌后外源蛋白表达定位于胞内,是常见的表达方式。
11直接表达:即非融合蛋白表达。
将外源基因插到原核表达载体强启动子和有效S D 序列下游,以外源基因mRNA 的AUG 为起始翻译,表达产物位于胞内,氨基端和羧基端不含其他蛋白或多肽序列。
小分子蛋白较易表达,产物接近天然蛋白,但易被水解,不稳定。
当外源基因在大肠杆菌高效表达,特别是表达出大分子蛋白时,则易在胞内形成包涵体。
111 包涵体的形成及利用包涵体是由蛋白肽链错误折叠形成的不溶于水的非结晶性蛋白聚集体。
通常一级结构正确,但其立体结构有误;无生物学活性或活性很低,需变性、复性才可能得到活性蛋白。
包涵体的分离方法简单(差别离心、洗涤等),其形成可减轻外源蛋白对宿主的毒害,如果复性成本又较低,可考虑促进包涵体的生成以获取大量表达产物。
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外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达和胞外分泌策略研究综述摘要：采用大肠杆菌作为表达宿主进行蛋白质异源表达的研究逐渐增多，然而实验过程中存在 2 个突出问题：（1）可溶性表达量低;（2）胞外分泌能效差。
该文系统地综述了当前的国内外研究现状，内容涉及外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达策略及胞外分泌策略，并对实验中存在的问题和和研究趋势提出了见解。
部分策略已用于实验教学并取得了良好的教学效果。
关键词：大肠杆菌;可溶性表达;胞外分泌;研究趋势中图分类号R394.8 文献标识码 A 文章编号1007-7731（2015）13-25-03 Advances of Soluble and Extracellular Overexpression of Heterologous Proteins in Escherichia coliChen Ana et al.（School of Biochemical Engineering ，Anhui Polytechnic University ，Wuhu 241000 ，China）Abstract ：Heterologous proteins expression in E.coli has been gradually increased in recent years. However ，there are two outstanding issues during the experiment （1）low soluble expression level; （2）poor secretion efficiency. This paper systematically reviews the currentresearch status，whichrelates strategies of soluble expression，extracellular secretion ，experimental problems in E.coli ，and puts forward opinions of research trends. Some of the strategies have been used in experimental teaching and achieved good teaching results.Key words ： E.coli;Soluble expression;Extracellular secretion;Research trends采用野生型菌种发酵生产目标蛋白的效率较低，通过基因工程技术进行异源高效表达是降低生产成本的有效途径。
常用的宿主菌为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，也有在毕赤酵母中表达的报道。
与其他宿主菌相比，大肠杆菌具有 3 个显著优势：细胞生长快速、分子操作简单和能在廉价培养基中高密度培养，使其成为科研、生产中最常用的原核表达宿主[1] 。
但是我们并不回避外源基因在大肠杆菌中表达时存在的 2 个突出问题：（1）可溶性表达量低;（2）胞外分泌能效差[2] 。
近年来研究者尝试了多种策略提高可溶性表达量和分泌效率，研究主要集中在调控发酵过程参数，优化培养基等措施上，对外源蛋白自身改造的研究相对较少。
1 研究现状外源蛋白在大肠杆菌中的表达调节是一个包括诸多元素的复杂系统，并非每一种蛋白都能在大肠杆菌中高效表达，部分蛋白无法表达[3] 。
由于大肠杆菌分泌系统的组成元件复杂、调控精细以及固有的双层膜结构，因此大肠杆菌表达系统的分泌性能较差[4] 。
笔者对当前外源蛋白在大肠杆菌中过量可溶性表达策略和高效分泌策略概括如下。
内容涉及质粒改造、宿主菌改造、底物蛋白改造、发酵过程参数调控及培养基优化等方面。
1.1质粒和宿主的有效改造和组合通过对质粒元件的合理构建，可在转录水平和翻译水平上调节蛋白合成。
如在指导学生采用大肠杆菌表达人源化治疗性抗体片段时，对pAVEwayTM 质粒进行操纵子双回文结构改造和启动子替换，使得外源蛋白的表达量显著提升（数据还未发表）;Olins 等从T7 噬菌体基因前导序列中鉴定了― 9bp 的序列g10-L ，该序列能使多种基因的表达水平提高40〜340倍。
若将其置于合成SD序列的上游，按照B -半乳糖苷酶的活性与LacZ mRNA 的水平来估计，g10-L 序列能使LacZ 的翻译水平提高110 倍[5]。
大肠杆菌II 型分泌系统中蛋白跨外膜分泌主要依靠非特异性渗漏，效率较低，可通过构建外膜渗漏型突变株以提高蛋白胞外分泌水平。
如Gumpert 等构建了缺少细胞壁和周质空间的L-型菌株用于青霉素G酰基转移酶、葡萄球菌激酶和微小抗体的制备[6] 。
Ni 等构建了敲除外膜脂蛋白的突变株，使麦芽糖结合蛋白、木聚糖酶和纤维素酶的胞外分泌比例达到总表达量的90%以上[7] 。
早期的研究多集中在此领域，并且已有和将有许多优良的商业化质粒和宿主可供选用。
当前的研究普遍采用“试错法” ，即直接采用商业化的质粒和大肠杆菌变种，构建合适的表达系统。
1.2优化信号肽江南大学吴敬团队研究发现不同的翻译起始区氨基酸序列和pelB 信号肽切割位点的数量会影响外源蛋白翻译和折叠效率，继而影响跨膜分泌过程，通过增加信号肽切割位点数量和随机突变翻译起始区氨基酸序列，获得基质分泌能力显著提升的突变体[8] 。
亦有研究表明适当增加II 型分泌系统信号肽N 端带电区域的正电荷或疏水区域的疏水性有利于提高前体蛋白的分泌效率[9] ，但目前并无如何根据指定的目标蛋白选择合适的信号肽进行分泌表达的通用规则。
1.3融合表达和共表达分子伴侣多种融合蛋白，如谷胱甘肽S-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP ）以及硫氧还蛋白（Trx ）等均已被证实能成功地表达折叠正确、有生物活性的蛋白，能明显提高在大肠杆菌细胞质中的可溶性，减少包涵体的形成。
分子伴侣是细胞中一大类蛋白质，在细胞内帮助其他蛋白完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白结构执行功能时的组份。
采用分子伴侣在大肠杆菌中进行外源蛋白高效表达成为近年来的研究热点，如通过共表达镰状疟疾虫分子伴侣增强了抗疟疾药物靶标环化水解酶的表达量[10] 。
1.4 共表达或改造转运蛋白在大肠杆菌□型分泌系统中，外源蛋白通过Sec或Tat 途径进入周质空间，再通过约12〜16种蛋白质组成的外膜通道分泌至胞外。
然而，由于转运蛋白的天然表达量低，转运效率有限，使得外源蛋白在大肠杆菌中分泌效能低。
可通过共表达或改造参与跨膜转运的关键性转运蛋白或辅助蛋白以改善转运通路进而提高蛋白分泌水平[11] 。
如Miksch 等将大肠杆菌素释放基因与 B -葡聚糖酶共表达时，大肠杆菌的外膜通透性明显增加，使得大量原本定位在周质空间中的 B -葡聚糖酶释放至胞外培养基中[12]。
Sugamata等针对I型分泌系统转运蛋白HlyB 和HlyD 进行定向改造，获得了使枯草芽孢杆菌蛋白酶E胞外分泌量提高27倍的突变体[13]。
1.5 外源蛋白自身的改造一种简单的方式是优化蛋白编码基因密码子。
在实际应用中，可通过全基因合成优化密码子、稳定mRNA 结构[14] 。
另一种方式是通过蛋白质工程改造既定蛋白。
近年来采用蛋白质工程改造目标蛋白，提高其在大肠杆菌中的分泌效率方面取得了一定进展。
如杰能科公司2011 年将脱支芽孢杆菌普鲁兰酶N 端处104 个氨基酸截短后，发现截短体比全长蛋白具有更高的胞外分泌能力。
专利发明人推测这种现象可能与重组酶分子量的减小有关[15]。
最新的研究报道通过在蛋白质N 端添加连续的5个天冬氨酸，使得南极假丝酵母脂肪酶 B 在大肠杆菌中的胞外分泌量达到1.9g/L。
添加的5个天冬氨酸使脂肪酶B二聚体的四级结构发生翻转，新的二聚体结构可能形成某种结构信号肽与GSP (General secretion pathway)上的特定通道蛋白相互识别，促使目标蛋白分泌至胞外[1] 。
1.6 发酵过程参数控制和培养基优化该方式是一种简单的提高外源蛋白表达量和分泌量的常用策略，因过程和原理相对简单，使用较为普遍。
如陈文波等通过分阶段调控发酵过程温度，使得目标蛋白在大肠杆菌中的表达量和分泌量均有大幅提升[16] 。
通过添加表面活性剂、渗透剂、金属离子和甘氨酸等培养基添加剂能够提高细胞膜的通透性，有助于加强蛋白分泌。
如聂尧等通过在发酵后期再培养基中添加0.6%的甘氨酸，可使90%以上的目标蛋白分泌至胞外[17] 此外还可通过优化培养基的营养成分，调控细胞培养的温度、pH和溶氧等环境参数，获得有利于细胞生长和蛋白胞外分泌的发酵策略。
2 存在的问题和研究趋势综上所述，在提高大肠杆菌外源蛋白表达及分泌水平研究中，以往焦点主要集中在表达系统和工艺水平上，但是几乎所有成功案例都具有蛋白特异性。
尽管目前在强化大肠杆菌分泌重组蛋白的效能方面取得了一定的进展，但其普遍适用性和有效性并不乐观，重组蛋白在大肠杆菌中的高效胞外分泌型表达仍然是一个技术难点。
通过数据库对比研究发现，采用完全相同的表达系统和发酵工艺表达不同的外源蛋白时，表达量和分泌效率往往有数量级上的差距。
据此推测外源蛋白本身一级氨基酸序列至三级空间结构甚至四级结构也是影响表达水平的重要因素，通过蛋白质工程改造既定蛋白可能是实现高效表达和分泌有效途径。
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