蛋白质的研究方法与原理PPT课件

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四、电泳技术分离蛋白质
电泳（electrophoresis）是指带电粒子在电场 中向着与其所带电荷相反方向电极移动的现象。
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS– (十二烷基硫酸钠)是阴离子型去污剂 (Sodium dodecyl sulfate, SDS)
Q u= （迁移率）6πrη u 与 Q、 r有关
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（四）蛋白质结晶
蛋白质结晶即是溶液中的蛋白质由随机状态转变为有 规则排列状态的固体，常用语分析研究其结构。 蛋白质结晶是一个有序化过程，当蛋白质溶液达到过 饱和状态，能够形成一定大小的晶核，溶液中的分子 失去自由运动的能量，不断地结合到形成的晶核上， 长成适合于X线衍射分析的晶体。
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二、离心技术分离蛋白质
若蛋白质分子带有足够的电荷，在SDS-PAGE中进 行电泳，由于分子筛效应， u 仅取决于分子的大小。 因此 SDS一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其 分开。
对易变性的蛋白质有一定的保护作用， 适用范围十分广泛。
缺点：分辨能力差，纯化倍数低
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（1）盐的种类 对同一种Pr而言，价数愈高的盐离子，盐析能力 也愈强:
PO3-4＞SO42-＞C2O42-＞（CHOHCOO-）2＞ AC－＞CL－＞NO3-＞Br -＞I-＞CNS-
K+＞Rb+＞Na+＞Cs+＞Li+＞NH4+ 常用的中性盐有如硫酸盐、磷酸盐等。
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亲和层析法
原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一
分子可逆结合的特性。 如，酶的活性部位能和底物\抑制剂\辅助因子专
一性地结合,改变条件又能使这种结合解除. [酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间]。 这些被作用的对象物质称之为配基（ligand) 。
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19Βιβλιοθήκη 离子交换层析法*原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）
填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树 脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的 阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。
第十章 蛋白质的研究方法与原理
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第一节 概 述
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直接从生物组织中提纯蛋白——
蛋白质的分离纯化包括以下过程：
1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来； 2.将有关的蛋白质分级沉淀下来; （盐析法或有机溶剂法） 3.应用层析法或电泳法使它们各自分开； 4.蛋白质结晶； 5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。
离心技术是利用物体告 诉旋转时产生强大的离心 力，使置于旋转体中的悬 浮颗粒发生沉降或漂浮， 从而使某些颗粒达到浓缩 或与其它颗粒分离之目的。
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三、层析技术分离纯化蛋白质
层析技术（chromatography）又称色谱技术，是利 用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
最基本的特征： 固定相 流动相
各种物质得以分离的最基本原因：就在于它们在这 两个相之间具有不同的分配系数.两相作相对运动时， 这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分 配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最 大的分离效果。
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层析技术的种类
气相层析
按两相状态来分 液相层析
吸附层析 分配层析 离子交换层析 按层析机理来分 凝胶排阻层析 亲和层析 柱层析
按操作方式来分 薄层层析
纸层析 17
（一）凝胶过滤层析
又称分子筛或凝胶过滤（gel filtration）
原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分 子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔 径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流 出（全排出）。较小的分子进入能容纳它的孔穴，绕 道而行，在柱内保留时间就比较长。这样，较大的分 子被先洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而 达到相互分离的目的。
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制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态 1. 避免一切过激因素--如过酸或过碱，高温，
重金属等的影响。 2. 通常都在低温条件下操作。 3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
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第二节 蛋白质的分离与纯化技术
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一、蛋白质沉淀与结晶
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（一）盐析法
概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和 电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析 所需的盐浓度及PH不同，加入不同浓度的中性盐 可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。 优点：操作简便
了 中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。
（2）有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也 促使Pr变得不稳定而聚集析出.
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（三）选择性沉淀法
选择一定的条件使其它蛋白质变性沉淀而不影响目标 蛋白质的分离方法。例如，将提取液加热至一定温度 并维持一段时间，是某些不耐热的蛋白质变性沉淀等。 应用选择星辰殿，徐实现对系统中需除去的及欲提纯 的蛋白质的理化性质均有较全面的了解。
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硫酸铵（常用盐析剂）
优点：盐析能力较强 具有较高的溶解度 较低的溶解度温度系数 价格低廉 不产生副作用。
缺点：缓冲能力较差 PH难控制
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（2）PH和温度 S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度
除取决于Pr的种类，还受PH及温度影响: • PH=PI时，S。的数值极小 • S。随温度增加而减低。 盐析过程中，若增高温度，有助于Pr的析出。
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高效液相层析法（High Performance Liquid Chromatography ，HPLC）
又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以 液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性 的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相 泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后， 进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
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（3）蛋白质浓度 [Pr]较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开 始析出，盐析界限比较宽。 [Pr]较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析 界限变窄。
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（二）有机溶剂沉淀法
分辨力比盐析方法高，提纯效果好
1.基本原理
（1）在PI附近，Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加 有机溶剂，由于有机溶剂可使溶液电离常数减小，增强