时间分辨荧光免疫技术培训

放射性免疫分析法（RIA）


应用
放免自60年代问世以来对临床诊断 起了革命性的贡献，是一项较为成熟 的诊断技术。 夹心法、竞争法的标记原理为以后的 检测技术的发展奠定了基础。


缺点
放射性（125 I），对环境的污 染及对身体的危害，该方法已 经为重视环保的国家逐步取消。 （如整个欧洲仅尚存几个放免 试验室） 125 I 的半衰期短而导致其试剂 有效期短。 标记物125 I 的稳定性差，导致 试剂盒批间、批内的变异较大； 标准曲线有效期短，必须每次 定标，造成浪费。 操作繁琐，出报告时间长。 无法保存备用。
Prog Prolactin
0.08-120nmol/L
0.04-250ng/ml
无
0.5-150ng/ml
0.1-40ng/ml
0.3-200ng/ml
标准曲线稳定，试剂保质期时间长
Cps.10 3 2000 DELFIA hFSH
N=6
100
5
0.5 2 5 10 20 50 100 200 500 时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定， U/L 同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标 1

时间分辨荧光免疫原理图
（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）
时间分辨荧光免疫试剂 工作原理示意图
轻链
标 记 物
螯合剂
Eu
V
重链
标记物为具有独特荧光特性的稀土金属--镧系元素

镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：
铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te)


发光效率 重复检测 本底噪声 灵敏级数 标记物 标记位点 标准曲线 多标记 科研开发
95% 可无数次 零本底 10-18 原子 可达20个/抗体 稳定达一年以上 有，最多可达四标记 有
时间分辨荧光和电化学发光的比较



时间分辨荧光
电化学发光
标记物
四种原子: Eu, Sm, Te, Dy
时间分辨荧光技术
培 训
广州市源起生物科技有限公司
主要内容
时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。
TRF的标记物及特点。 为什么叫“时间分辨”? TRF在免疫分析方法学中的地位。 各种免疫方法学的比较。 临床应用
回顾标记免疫学发展
放射免疫 （精度：10-12mol/L ） 酶联免疫 （精度：10-9 mol/L ） 胶体金标记 （金标：10-15mol/L ） 化学发光 （精度：10-15mol/L ） 电化学发光 （精度：10-17mol/L ） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ） 生物芯片




酶免疫分析法（ELISA ）


应用
酶免的最大优势在于避免了 对环境和人体危害。 试剂有效期较长。 衍生技术：
荧光酶免疫分析 增强化学发光酶免疫技术

缺点
灵敏度、重复性不及放免，易造成 漏检和假阳性。




因酶的纯度和反应过程容易受 环境因素影响，导致稳定性不好。

曾经一度被认为是取代放免 的检测手段。

镧系元素荧光特点：
荧光寿命极长
镧系元素螯合物（60~900 us) <铕：714us>
普通荧光免疫中荧光团：1~100us 样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭。 Stokes位移大（大约290nm）
铕：发射光613nm、激发光340nm，
荧光素的Stokes位移为28nm 荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615± 5nm） 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍
时间分辨荧光免疫原理图
利用镧系元素荧光物 理特性，荧光激发后 在固定时间段检测特 异性荧光而在此时间
之前，非特异性荧光
已完全衰减为0
利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激 发荧光分辨开来，零本底的又一保障
发射光谱与激发
光谱间存在的巨
大Stokes位移。
可以通过干涉滤 光片将发射光谱 与激发光谱完全 分离。

缺点

非开放性试剂系统、不 能做科研。 试剂价格过高。


时间分辨荧光免疫的试剂种类






内分泌科检查 甲状腺系列： TSH，Ultra TSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TG 糖尿病系列： Insulin， C-Peptie 生长激素类： hGH 其他： Cortisol 妇产科检查 FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG 肿瘤科检查 AFP，CEA，PSA，hTG，β-2 Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSA EQM，CA-50，CA-125，CA-199，CA153*，CA-724*，CY-211* 遗传科检查 产前筛查： hAFP/ HCG ，PAPPA 新生儿筛查： Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OH Prog，PKU 核酸探针及基因杂交检测，多标记定量PCR检测。 肝炎系列 甲肝，乙肝，丙肝 血液科检测 贫血检查： Ferritin，Vit B12，Folic acid 白血病： 免疫细胞分型等 细胞学检查 细胞毒试验等多种检测项目，细胞质及组织化学分析等多种检测项目 酶类检测及细胞受体检测（包括MHC，HLA等多种检测） 科研工具 单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测
线性范围更宽 重复性更好 高稳定性，高精确度 试剂保质期至少一年 标准曲线保留时间长 同一批次只需两点定 标 同一试剂盒可同时测 多个项目
多标记
灵敏度更高，检测范围更广
以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书
试剂
DELFIA 0.1-1000IU/ml 0.1-500ng/ml 0.5-10000U/L 0.005-100μU/ml 0.05-256mU/ml
DELFIA技术为临床检测带来的先进性
技术 特点 检验先进性 零背景、高特异性 时间分辨 特异性荧光与非特异性荧光 光谱分辨 分离 发射荧光与激发荧光分离 解离-增 强 原子标记 荧光性大大提高 稳定的荧光螯合物 标记位点多，可达20个 对标记物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小 单，双，三，四标记
一种原子: 钌
无
多标记技术 有


做科研
试剂种类 剂 试剂价格
能(1000多种科研项目)
58种临床,24种科研,共82种 低
无
28种临床, 无科研试 高

泰莱—I时间分辨荧光免疫分析系统
泰莱—I时间分辨荧光免疫分析系统


高灵敏度 10-17mol/孔(Eu3+) 线形范围宽 10-13mol/孔—10-19mol/孔 快速测试 1秒/一个样品 测试灵活 可以测试任意1-96个孔，样品摆放位置不受限制 标本量灵活 随机配置泰莱—I全中文测试分析软件 界面简明友好，随意进行项目的选择和参数筛选
Immulite 0.2-300IU/ml 0.2-500ng/ml 5-5000U/L 0.002-75μU/ml 0.1-170mU/ml
ACS-180 1.0-1000IU/ml 0.5-100ng/ml 2-1000U/L 0.03-150μU/ml 0.3-200mU/ml
AFP CEA HCG TSH FSH
时间分辨荧光免疫---突出优点
零本底、灵敏度高
线性范围宽 试剂有效期长 标准曲线稳定性好 易于自动化
TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。
时间分辨荧光与化学发光方法学比较
时间分辨荧光

化学发光
1% 不可重复 干扰大 10-15 大分子化合物 1个/抗体 稳定 2 到 4周 无 无
化学发光免疫分析法（CLIA）


应用
单个样本检测速度快，适合 做急诊。 灵敏度较高。 自动化程度高。 分类：
以丫啶酯直接标记—ACS180


缺点
发光过程短，样品不能重复检 测。 本底较高，易受环境物质干扰。 仪器故障率较高。 试剂稳定性较差，需多次定标。 检测精度不高，在超微量分析 及早期诊断方面能力不足。 非开放性试剂；试剂价格高。
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系统 以HRP标记，鲁米诺为发光底 物—Amerlite系统 以AP为标记物，AMPPD为发 光底物—Immulite系统
电化学发光免疫分析法（ECL）


应用
80年代末期问世的新型化学 发光免疫分析方法。 基本原理：根据三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]和三丙胺在电场 触发下产生发光的化学发光 反应。 本底较ime-Resolved Fluorescence）
时间分辨荧光免疫分析 （TRFIA） 时间分辨免疫荧光分析（TRIFMA） 时间分辨荧光核酸探针分析 时间分辨荧光细胞活性分析 时间分辨荧光探针分析

时间分辨荧光技术原理 （TRF）
用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光 物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗 体、激素、核酸探针等物质； 当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光 谱的特点 （特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿 命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最 后产物的荧光强度。 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系 中分析物的浓度，达到定量分析的目的。