巴西橡胶树树皮环氧树脂组织切片及染色技术
巴西橡胶树HbCytb561的克隆及表达分析
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热 带作 物 学 报 ２ ０ １ ５ ，３ ６ （ １ １ ） ：１ ９ ６ ５ — １ ９ ７ ０
巴西橡胶树HbRALF34的克隆及表达分析
湖南农业大学学报(自然科学版) 2017, 43(6):597–603. DOI:10.13331/ki.jhau.2017.06.004 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) 投稿网址：巴西橡胶树 HbRALF34 的克隆及表达分析聂智毅，黎瑜，康桂娟，蔡海滨，曾日中*(中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 儋州 571737)摘 要：依据橡胶树胶乳转录组数据，利用 RT–PCR 技术鉴定了一个快速碱化因子(rapid alkalinization factor,RALF)家族基因 cDNA 序列。
该 cDNA 长度为 767 bp，开放阅读框长度为 411 bp，编码 136 个氨基酸。
序列比 对显示该 RALF 基因与 AtRALF34 有较高相似性， 因而命名为 HbRALF34。
以热研 7–33–97 无性系橡胶树为材料， 采用实时荧光定量 PCR 对不同组织及乙烯、茉莉酸、伤害、过氧化氢、高盐、低温、干旱等处理下 HbRALF34 的表达模式进行分析。
结果表明：HbRALF34 在橡胶树叶片、花、树皮以及胶乳中均有表达，其中胶乳中表达 量最高；与健康橡胶树相比，HbRALF34 在死皮橡胶树胶乳及树皮中的表达量显著上调；乙烯、茉莉酸、过氧 化氢及伤害处理能诱导该基因表达，而低温、干旱及高盐处理则抑制该基因表达，表明 HbRALF34 可能参与橡 胶树的信号传导、产排胶调控以及胁迫响应。
关键 词：巴西橡胶树；HbRALF34；快速碱化因子；基因克隆；表达分析 文献标志码：A 文章编号：1007−1032(2017)06−0597−07中图分类号：S794.1Cloning and expression analysis of HbRALF34 from Hevea brasiliensisNIE Zhiyi, LI Yu, KANG Guijuan, CAI Haibin, ZENG Rizhong* (Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture, Danzhou, Hainan 571737, China) Abstract: Based on the latex transcriptome date, a cDNA sequence of rapid alkalinization factor (RALF) family gene was identified by RT–PCR. The cDNA is 767 bp in size with a 411 bp open reading frame and encodes 136 amino acids. BLASTX searches of GenBank showed that the deduced amino acid sequences of RALF gene was similar to AtRALF34，thus was named as HbRALF34. Expression profiles of HbRALF34 in different tissues of Hevea brasiliensis clone Reyan 7–33–97 and in response to ethylene (ET), jasmonic acid (JA), wounding, hydrogen peroxide (H2O2), high salt, low temperature and drought were assayed via real–time quantitative PCR (RT–qPCR). The results suggested that HbRALF34 was ubiquitously expressed in the leaves, flowers, barks and latex of rubber tree, and its highest expression was in latex. Compared with healthy rubber tree, the expression level of HbRALF34 was increased in latex and bark of tapping panel dryness rubber tree. Moreover, the expression of HbRALF34 was induced by ET, JA, H2O2 and wounding treatments, but was inhibited by high salt stress, low temperature and drought treatments. All these results suggest that HbRALF34 is likely involved in signal transduction, regulating rubber biosynthesis and latex flow, as well as responding to stress in Hevea brasiliensis. Keywords: Hevea brasiliensis; HbRALF34; rapid alkalinization factor; gene cloning; expression analysis巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)是 一种重要的热带经济林木，其树皮乳管中的胶乳是天然橡胶的重要商业来源。
巴西橡胶树产胶能力的生理生化基础的研究的开题报告
巴西橡胶树产胶能力的生理生化基础的研究的开题报告一、研究背景巴西橡胶树，又称为橡胶树，即墨西哥橡树，是热带橡胶树种中的一种。
它是一种寿命长、高产胶乳及蓬勃生长的植物，是全球最重要的天然橡胶产地之一，也是制造天然橡胶的主要来源。
然而，巴西橡胶树的产胶能力与环境条件、橡胶树生理生化特征等因素相关，但相关研究还相对较少。
因此，通过对巴西橡胶树产胶能力的生理生化基础的研究，可以为提高其橡胶产量、优化其种植管理等提供科学依据。
二、研究内容本研究旨在探究巴西橡胶树产胶能力的生理生化基础，具体研究内容包括：1. 巴西橡胶树的生理生化特征分析，包括橡胶树根系、叶片、茎皮的组织结构、生理指标（如光合作用速率、呼吸作用速率、蒸腾速率等）的测定等。
2. 巴西橡胶树在不同生育阶段的橡胶乳生产能力的测定及分析，包括橡胶乳的比重、干胶含量、橡胶乳中胶原蛋白含量等。
3. 巴西橡胶树产胶能力与环境因素的相关性分析，包括温度、湿度、降雨量等因素对橡胶树产胶能力的影响。
三、研究意义巴西橡胶树的产胶能力对天然橡胶的生产和质量至关重要。
而对橡胶树产胶能力的生理生化基础的深入研究，不仅可以为提高其产胶能力提供科学依据，还可以为制定更加科学的巴西橡胶树种植管理措施提供依据，加快巴西橡胶树的产胶技术创新和推广，促进巴西橡胶树产业的可持续发展。
四、研究方法1. 样本采集：在选取的巴西橡胶树种植区域内，采集不同树龄、不同生长阶段的巴西橡胶树样本。
2. 样品处理：对采集的巴西橡胶树样品进行处理和计量，包括橡胶树各部分组织结构的切片制备、生理指标测定等。
3. 数据统计与分析：对研究得到的生理生化参数等数据进行分析和统计，探究其对巴西橡胶树产胶能力的影响，分析其与环境因素的相关性。
五、研究进度安排阶段一：文献调研与综述阶段二：巴西橡胶树样本采集和处理阶段三：生理生化参数测定及数据分析阶段四：分析巴西橡胶树产胶能力与环境因素的相关性阶段五：论文撰写、提交和答辩六、预期成果本研究预期将揭示和确定巴西橡胶树产胶能力的生理生化基础，并对其与环境因素之间的相互关系进行探究。
一种优化的橡胶树木质部石蜡切片制作方法
一种优化的橡胶树木质部石蜡切片制作方法作者：蔡海滨涂敏等来源：《热带农业科学》2015年第06期摘要针对常规石蜡切片方法无法制得橡胶树木质部切片的问题，优化了橡胶树木质部切片制作方法并进行了验证评估。
以3龄和30龄的橡胶树木材为材料，经FAA固定、乙醇预处理后，增加了以冰醋酸软化木质部这一步骤，用正丁醇取代二甲苯进行组织透明，其余步骤参考常规方法。
结果表明，优化的石蜡切片方法可制作出完整、高质量的木质部切片，其木纤维的长度、宽度与硝酸离析所得到的木纤维一致度高，为橡胶树成龄木材的解剖学研究提供了方法。
关键词橡胶树；木质部；石蜡切片；木纤维分类号 S794.1An Improved Method for Paraffin Section Preparation of Hevea XylemCAI Haibin TU Min HU YanshiCHENG Han AN Zewei HUA Yuwei HUANG Huasun（Rubber Research Institute /Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree /State Center for Rubber Tree Breeding， CATAS， Danzhou， Hainan 571737）Abstract In this paper， we improved and evaluated paraffin section method of Hevea xylem compared to the conventional method. 3-year-old and 30-year-old rubber tree woods were collected，fixed in FAA， pretreated by ethanol， softened by acetic acid and transparentized by n-butanol replacing xylene. The remaining steps referenced conventional method. The result indicated that the improved method could produce complete， high quality paraffin section of Hevea xylem. The length and width of wood fiber by paraffin section had high consistency with those obtained by nitrate segregation， which provided a method for the study of mature Hevea wood anatomy.Keywords Hevea brasiliensis ； xylem ； paraffin section ； wood fiber中国位于太平洋西岸，海南和广东等沿海地区橡胶生产经常遭受台风的严重危害[1]。
一种提取橡胶树树皮组织全蛋白的方法
一种提取橡胶树树皮组织全蛋白的方法本发明属于植物生物化学领域，涉及一种从橡胶树树皮组织中提取蛋白质样品的方法。
特点是：采用改进的三氯醋酸（ＴＣＡ）－丙酮沉淀法（先抽提后沉淀）结合双乙法提取植物树皮组织中的全蛋白，不仅可以提高样品的得率，还可以有效去除酚和色素等杂质。
本发明可以为与树皮有关的研究提供高质量的蛋白质样品。
一种提取橡胶树树皮组织全蛋白的方法一种高效提取橡胶树树皮组织中总蛋白的方法，包括树皮样品采集和预处理、蛋白质提取和定量，其特征是：１）树皮样品的采集和预处理选择待采集样品的植株，用锋利的小刀刮去采集部位的树皮周皮，然后将树皮分割为若干小块，划割深度到木质部；用刀片撬起树皮，并用锡箔纸包住，做好标记，然后迅速冰浴或者置液氮中，带回实验室，用刀将树皮切成薄片，－７０－８０℃保存备用；２）蛋白质提取采用改进的三氯醋酸－丙酮沉淀法结合双乙法提取植物树皮组织中的总蛋白；具体操作流程为：（１）将干净研钵、包含１０％ＴＣＡ的丙酮溶液Ａ以及丙酮置于－２０℃预冷；（２）称取一定量的样品置于液氮中冷却；（３）用液氮荡洗研钵１－２次，然后将样品置入研钵中，加入样品的质量的０．５％－２％ＰＶＰＰ，然后加液氮研磨树皮样品１０－３０ｍｉｎ，至细粉末状，将粉末盛装于离心管；（４）按１∶１０－２０（ｗ／ｖ）的比例向粉末中加入蛋白抽提液１，ｗ是重量，单位为克、ｖ是体积，单位是毫升，蛋白抽提液１ｐＨ＝８．５、配方为：４－７Ｍ尿素，０．５－２Ｍ试剂Ａ，０．５－２％ＣＨＡＰＳ，０．５－２％两性电解质载体（ｐＨ３．５－９．５），４０ｍＭＴｒｉｓ，％均为质量百分比，Ｍ为摩尔，ｍＭ为毫摩尔；然后加入ＰＭＳＦ和ＥＤＴＡ，ＰＭＳＦ和ＥＤＴＡ的终浓度均为１－２ｍＭ，涡旋混匀，冰浴５－１０ｍｉｎ；（５）加入ＤＴＴ至终浓度为１０ｍＭ，超声５ｍｉｎ，室温放置１ｈ或者３７℃孵育１ｈ，其间不断混匀样品，以充分溶解蛋白；（６）４－１０℃，３０，０００－４０，０００ｇ离心１０－３０ｍｉｎ，收集上清液；（７）向上清液中加入相当于５－１０倍体积（ｗ／Ｖ）的溶液Ａ，再加入ＰＭＳＦ和ＥＤＴＡ，ＰＭＳＦ和ＥＤＴＡ的终浓度均为１－２ｍＭ，涡旋混匀，冰浴５ｍｉｎ；加ＤＴＴ至终浓度１０ｍＭ，超声１ｍｉｎ，于－２０℃下静置２－１５ｈ后，４－１０℃、３０，０００－４０，０００ｇ离心１０－３０ｍｉｎ，弃上清得到沉淀Ａ；（８）沉淀Ａ用冰浴丙酮重悬浮，冰浴丙酮体积是沉淀Ａ的５－１０倍，再加入ＰＭＳＦ和ＥＤＴＡ，ＰＭＳＦ和ＥＤＴＡ的终浓度均为１－２１０ｍＭ，摇匀，于－２０℃下静置０．５－２ｈ后，４－１０℃、３０，０００－４０，０００ｇ离心１０－３０ｍｉｎ，弃上清得到沉淀Ｂ；（９）重复步骤８一至两次，得到沉淀Ｃ；（１０）取出沉淀Ｃ真空干燥或置超净工作台风干５－１０ｍｉｎ，以除尽有机溶剂；所得干粉末置－７０－－８０℃保存备用或接下一步；（１１）按１∶１０－２０（ｗ／ｖ）的比例向干粉末中加蛋白抽提液２，蛋白抽提液２ｐＨ＝８．５、配方：７－９Ｍ尿素，０．５－４％ＣＨＡＰＳ，０．５－２％两性电解质载体、ｐＨ３．５－９．５，４０ｍＭＴｒｉｓ，然后加入ＰＭＳＦ和ＥＤＴＡ至终浓度为１－２ｍＭ，涡旋混匀，冰浴５－１０ｍｉｎ；加ＤＴＴ至终浓度１０ｍＭ，超声１－５ｍｉｎ，室温放置１－２ｈ或者３７℃孵育１－２ｈ，其间不断混匀样品，以充分溶解蛋白，４－１０℃、３０，０００ｇ－４０，０００ｇ离心１０－３０ｍｉｎ，上清为蛋白溶液Ａ；（１２）向蛋白溶液Ａ中加入ＴＣＡ粉末至终浓度为１２％，充分摇匀使ＴＣＡ溶解，４－１０℃放置３０ｍｉｎ－２ｈ；（１３）４℃、３０，０００－４０，０００ｇ离心１０－３０ｍｉｎ，得到沉淀Ｄ，取沉淀Ｄ用４℃预冷的１０－２０倍体积样品的乙醇∶乙醚（１∶１）重悬，于－２０℃下静置０．５－２ｈ；（１４）４℃、３０，０００－４０，０００ｇ离心１０－３０ｍｉｎ，弃上清；得到沉淀Ｅ，取出沉淀Ｅ真空干燥或置超净工作台风干５－１０ｍｉｎ，以除尽有机溶剂；（１５）按１∶５－２０（ｗ／ｖ）的比例，向干粉末中加入蛋白抽提液２，然后加入ＰＭＳＦ和ＥＤＴＡ至加ＤＴＴ至终浓度１０ｍＭ，超声２－５ｍｉｎ，然后４－１０℃、３０，０００－４０，０００ｇ离心１０－３０ｍｉｎ，上清即为所需的蛋白溶液Ｂ；（１６）蛋白溶液Ｂ用１．５ｍＬｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管分装，－７０－－８０℃保存备用；３）蛋白质定量采用Ｂｉｏ－ｒａｄ公司的蛋白质定量试剂盒对所获得的样品进行定量。
一种快速高效适于橡胶树叶片AFLP分析的DNA提取方法
一种快速高效适于橡胶树叶片AFLP分析的DNA提取方法钟淦彬;李维国;郑学项;李海林;颜园园;易晓洁;陈祖兴【摘要】以近200个巴西橡胶树种质材料(品种及无性系)幼嫩叶片为材料,采用改良的CTAB法对其基因组总DNA的提取进行了研究.结果表明,该方法提取的DNA 溶液无色透明,OD260/OD280的比值均为1.8～2.0,1%琼脂糖凝胶电泳为清晰的一条带,无降解现象,RNA去除干净,能被限制性内切酶完全消化;其AFLP分析(引物EcoRI-TA/MseI-CTT)条带清晰,多态性好,说明此方法提取的巴西橡胶树幼嫩叶片基因组总DNA较适于AFLP分析.【期刊名称】《热带农业科学》【年(卷),期】2010(030)005【总页数】5页(P1-5)【关键词】巴西橡胶树;AFLP分析;DNA提取【作者】钟淦彬;李维国;郑学项;李海林;颜园园;易晓洁;陈祖兴【作者单位】中国热带农业科学院橡胶研究所,海南儋州,571737;海南大学农学院,海南儋州,571737;中国热带农业科学院橡胶研究所,海南儋州,571737;中国热带农业科学院橡胶研究所,海南儋州,571737;海南大学农学院,海南儋州,571737;中国热带农业科学院橡胶研究所,海南儋州,571737;海南大学农学院,海南儋州,571737;中国热带农业科学院橡胶研究所,海南儋州,571737;海南大学农学院,海南儋州,571737;中国热带农业科学院橡胶研究所,海南儋州,571737;海南大学环境与植物保护学院,海南儋州,571737;中国热带农业科学院橡胶研究所,海南儋州,571737;海南大学农学院,海南儋州,571737【正文语种】中文【中图分类】S794.1;Q781AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)技术由于具有不受环境条件影响、所得带纹丰富、多态性检出率高、灵敏度高、可靠性和重复性好等优点而被认为是最有效的分子标记方法，近年来在植物的品种鉴别及分类、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等方面得到了广泛的应用[1～5]。
巴西橡胶树树皮厚壁组织结构和发育研究
巴西橡胶树树皮厚壁组织结构和发育研究史敏晶;李言;王冬冬;田维敏【摘要】植物中的厚壁组织对植株起着重要的支持和保护作用,但目前对橡胶树树皮中该组织的研究较少.以无性系RY7-33-97不同发育阶段的萌条以及无性系PB86、PR107、RY8-79定植7年的树干树皮为材料,利用光学显微技术对树皮中厚壁组织的结构和发育进行较为系统的研究.结果表明,幼嫩萌条的树皮中仅有纤维组织,根据其所在位置可分为皮层纤维和初生韧皮纤维.皮层纤维数量较少,分散分布在皮层中;而初生韧皮纤维常由2～3层纤维细胞形成完整的纤维带围绕在初生韧皮部外侧.成龄大树树皮中仅观察到短石细胞,常成团分布,这些石细胞由薄壁细胞通过同心环的方式木质化加厚细胞壁发育形成.石细胞的内腔中常积累红褐色物质和结晶体,有的石细胞外包有晶鞘.在PB86、PR107、RY8-79三个无性系中,石细胞在树皮中的分布和石细胞壁的厚度具有明显的品系特征.最早出现的石细胞列到砂皮外层这一范围内,石细胞团排列最紧密的是PR107,面积比例为28.9％;其次是PB86,为27.4％;RY8-79中的石细胞团少而稀疏,仅12％,极显著低于PR107和PB86.在PR107中,石细胞壁的厚度最大,约为14 μm;PB86和RY8-79则分别为9和7.8 μm,可见,石细胞壁的厚度PR107极显著高于PB86和RY8-79.这些石细胞的特征可能与不同品系树皮的抗压、抗风能力、割胶难易程度相关,对橡胶树树皮厚壁组织尤其是石细胞的研究将为橡胶树选育种中副性状的选择提供依据.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2016(037)002【总页数】6页(P311-316)【关键词】橡胶树;厚壁组织;纤维;石细胞;发育【作者】史敏晶;李言;王冬冬;田维敏【作者单位】中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室海南儋州 571737;中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室海南儋州 571737;中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室海南儋州 571737;中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室海南儋州 571737【正文语种】中文【中图分类】S794.1Abstract The sclerenchyma in plants has supporting and protecting functions, it is, however, still not well known in the bark of rubber tree. In the present study, the structure and development of sclerenchyma in trunk bark of 7-year-old rubber tree clone PB86, PR107 and RY8-79 as well as in the bark of epicormic shoots of rubber tree clone RY7-33-97 at the different developmental stages was observe by using optical microscopy. In the bark of epicormic shoots, only the fiber, a kind of sclerenchyma, was observed. It could be recognized as cortical fiber and primary phloem fiber according to its distribution. The cortical fiber sparsely dispersed in cortex,while primary phloem fiber located outside the primary phloem, in a ring form of 2-3 fiber layers. By contrast, only the brachysclereid was present in the trunk bark of 7-year-old rubber tree clones. The stone cells existed generally in a cluster form and developed from parenchyma cells after the cell wall of the parenchyma cells lignified and thickened in a manner of concentric ring. The stone cells usually contained bronzing materials or crystals in the cavity. Some of stone cells were enclosed with a crystal sheath. The distribution and cell wall thickness of stone cells were clone-specific. Within the area from the innermost stone cell line to the outer layer of the sandy skin, the ratio of stone cells to the area was 28.9% in PR107, 27.4% in PB86, 12% in RY8-79. The thickness of stone cell wall was about 14 μm in PR107, 9 μm in PB86 and 7.8 μm in RY8-79. The difference in the density and cell wall thickness of stone cells may be related to the difference in the capacity of anti-pressure and anti-wind and bark hardness among the three clones. Knowledge about the sclerenchyma, especially the stone cells in the trunk bark of rubber tree will contribute to the selection of related accessory characters in Hevea breeding.Key words Rubber tree; Sclerenchyma; Fiber; Stone cell; Developmentdoi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.016巴西橡胶树是天然橡胶的最主要来源，而橡胶树中的乳管细胞作为合成和贮存橡胶的重要组织，一直是橡胶树树皮组织研究的重点。
生物技术在巴西橡胶树遗传改良中的应用综述
（ ｂ ｅ ｅ ａｃ ｎｔｕｅＣ ｉｅ ａ ｅ ｙｏ ｒｐｃｌＡｇ ｉ ｌ ｒ Ｓ ｉ ｃｓＤ ｎｈ ｕＨａｎ ｎ ５ １０ ） Ｒｕｂｒ ｓ ｒ Ｉｓ ｔｔ，ｈｎｓＡｃｄ ｍ ｆＴｏ ｉ ｒ ｕ ｕｅ ｃ ｎｅ， ａ ｚｏ ｉａ ７７ ０ Ｒ ｅ ｈ ｉ ｅ ａ ｃｔ ｅ
．
Ｋｅ ｒ ｓ：Ｈ ｅ ｅ ｒ ｉｉ ｎｓｓ； ｏ ｅ ｈｎ ｌ ｇ ｉ ｉｒ ｕ ｔ ｅ； ｅ ｔｃ ｅ ｉ ｅ ｉ ｙ ｗｏ ｄ ｖ ａ ｂ ａｓ ｌｅ ｉ ｂｉｎｇ ｎｅ ｒｎｇ： ｅ ｔｃ ｍ ｐｒ ｖ — ｇ ｎｅ ｉ ｉ ｏ ｅ
ｎ ｔ ｄ ｃ ｏ ｅ ｏ ｇ ｎ ｏ ｔ ｅＦａ ｌ ｐ ｏ ｂ ａ ｅ ｅ Ｈｏ ｖ ｒ ｈ ｅ ｅ ｏ ｙ ｏ ｓ ｎ ｔ ｒ ｌ ｎｇ ｂ ｅ ｄ ｎ ａ ｅ ｒ ｐ ｂ ｌ ｎ ｉ ｇ ｔ ｈ ｍｉ Ｅｕ ｈ ｒ ｉｃ ａ ． ｙ ｗｅ ｅ ，ｔ ｅ ｈ ｔ ｒ ｚ ｇ ｕ ａ ｕ ｅ ｏ ｒ ｅ ｉ ｇ ， ｔｍｅ ｏ ｒ ｅ ｎ ｈ ｒ ｌ ｎ ｅ ｅ ｉ ｄ ｒ ｑ ｉｅ ｏ ｖ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ ａ ｕ ｅ ｔ ａ ｔ ｒ ｔ ｏ ｇ ｌ ｉ ｔｏ ｓ ｉ ｆｔ ｅ ｓ ａ ｄ ｔ ｅ ｐ ｏ ｏ ｇ ｄ ｐ ｒｏ ｅ ｕ ｒ ｄ ｆ ｒ ｅ ａ ｕ ｔｏ ｆｍ ｔ ｒ ｒ ｉ ａ ｅ ｓ ｒ ｎ ｉ ｔ ｉ ｎ ｓ ｍ ａ
中 图 分 类 号 ：７ ４ １ ￥ ９ ．
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作者简介 ： 徐静 文（ １ ９ ９ ２一） ， 女， 海南大学农学 院生物技术系 ２ ０ １ １ 级本科生． 通信作者 ：黄惜 ， 男， 研究员． Ｅ － ｍ ａ ｉ ｌ ： ｘ ｉ ｈ ｕ ａ ｎ ｇ ＠ｈ ａ ｉ ｎ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｅ ｎ
巴西 橡胶 树 树 皮 环 氧树 脂 组 织切 片 及 染 色技 术
徐静文 ， 廉 文君 ， 曹玉鑫 ， 夏 志辉 ， 黄 惜
（ 海南省热带生物资源可持续利用重点实验室／ 海南大学 农学院 ， 海南 海 口 ５ ７ ０ ２ ２ ８ ）
摘
要 ：介绍 以环 氧树脂为包埋介质 ， 不需要碘 溴染 色、 用 于光学显微镜 的巴西橡胶树半 薄切片技 术 ， 详 述
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材料
１ ． ２ 方法
２年生热 研 ７— ３ ３—９ ７巴西 橡胶树 萌条 树皮 。 采 用 戊 二醛 一锇 酸双 重 固定 法 固定 组 织 ， 因锇 酸较 难 渗 入 组 织块 内
１ ． ２ ． １ 树 皮组 织材料 固定及 脱水
部 的细胞 中 ， 故 将材料 切成 约 ５ ｍｍ× ５ ｍ ｍ ×１ ｍｍ的薄 片 。用 刀 片将树 皮 切下 来 ， 先用 ＝ ２ ％ 的戊 二醛
Ｅ ｐ ｏ ｎ ８ １ ２和 国产 ６ ０ ０环氧树 脂 做 包埋 剂对 植 物 细 胞 学 和 组 织 学 的研 究 ， 克 服 了石 蜡 包 埋 切 片 技 术 的 缺
点 Ｊ 。在此基础上 ， 笔者改进环氧树脂包埋切片技术 ， 并将其应用 于巴西橡胶树在光学显微镜下的乳管
观察 ， 采用不 同染 料进行 染 色实验 对 比 ， 取得 了 良好 的效果 。
片技术的改进和扩展。
关键词 ：巴西橡胶树 ； 环氧树脂 ； 组织切片 ； 染色
中图分类号 ：Ｑ ２ ４ ６ 文献标 志码 ：Ａ
巴西 橡胶 树 的乳 管是 天然橡 胶合 成和贮 存 的组织 ， 是 决定 橡 胶产 量最 重要 的结 构 。橡 胶 树乳 管 列 数
受遗传和环境双重因素影响。利用光学显微镜观察乳管 的方法通常是碘溴染色结合石蜡包埋 的植物组
固定、 脱水 、 渗透、 包埋 、 聚合 、 切片 、 染色及封片各程序 。利用 ３种不 同的染料 能充分 区分 橡胶乳管 细胞 、 木
质部 、 形成层 、 导管 、 次生韧皮射线 、 初生韧皮纤维 、 皮层和表皮等 ， 还能观察 到许 多在 石蜡 切片上不容易 区分 的细胞及其 内部结构 ， 如树皮表皮细胞下富含的丹宁细胞和叶绿体等。该 技术是对 巴西橡胶树石蜡 包埋切
过夜 固定 。 ＝ ２ ％的戊二醛 固定后 用 ０ ． ２ ｍ ｏ ｌ ・ Ｌ～ｐ Ｈ ７ ． ２ Ｐ Ｂ Ｓ Ｂ ｕ ｆ ｆ ｅ ｒ 冲洗 ３次 ， 每次 １ ５ ｍ ｉ ｎ ； 然后用 ＝１ ％
的锇酸 固定 ２ ｈ ， 锇酸处理后样 品变黑 。固定液均用 ０ ． ２ ｍ ｏ ｌ ・ Ｌ ～Ｐ Ｂ Ｓ Ｂ ｕ ｆ ｆ ｅ ｒ ｐ Ｈ ７ ． ２配制 。采用 乙醇为脱 水
织 切片 法 。郝 秉 中等在 １ ９ ８ ２年 首次利 用 该 方法 发 现采 胶 能 够促 进乳 管 分 化 ¨ Ｊ 。他 们还 证 明 ， 在 机 械 损 伤但 并不 排胶 的条件 下 ， 也能诱 导乳 管分 化 Ｊ 。２ ０ ０ ０年 ， 郝 秉 中和吴 继林 发 现 外施 茉 莉 酸或 茉 莉酸 生 物 合 成 的前 体亚 麻酸 可 以诱 导 形成 层 分 化 形 成 正 常 的次 生乳 管 列 ， 而外 施 其 他 激 素 ， 如细胞分裂素、 生 长 素、 脱落 酸 、 乙烯 和水杨 酸等都 不能诱 导乳 管分 化 ， 证 明茉 莉 酸可 能是 橡 胶树 体 内调 控乳 管 分化 的重 要 信 号 分子 ＿ ３ Ｊ 。另外 ， 机 械伤 害可 以诱 导乳 管 分 化 和茉莉 酸 生 物合 成 抑 制剂 的阻 断 ， 表 明机 械 伤 害 的作 用 是 通 过它 在橡胶 树体 内诱 导形 成茉莉 酸 的结 果 。这 一 发 现对 于 天然 橡 胶生 产 和 发 展橡 胶 树 化 学调 控 技 术 提供 了理论 根据 。 。碘 溴染 色 和 石 蜡 包 埋 的 植 物组 织 切 片 法 程 序 繁 复 ， 耗 时 较 长 。陈 永 哲 等 人 使 用
第 ５卷 第 ２期
２ ｏＦ ＴＲｏＰ Ｉ ＣＡＬ ＢＩ ｏＬ０ＧＹ
Ｖｏ １ ． ５ Ｎｏ ． ２
Ｊ ｕ ｎ ． ２ ０１ ４
文 章编 号 ： １ ６ ７ ４—７ ０ ５ ４ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ２— ０ １ ６ ２— ０ ４
剂， 在室温下经体积分数为 ３ ０ ％， ５ ０ ％， ７ ０ ％， ８ ０ ％， ９ ５ ％， １ ０ ０ ％（ ２ 次） 的乙醇逐级脱水 ， 每次 １ ５ ｍ ｉ ｎ 。
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ４— ０ ２—１ ５
基金项 目：国家 自然科学基金项 目（ ３ １ ０ ６ ０ １ ０ ７ ， ３ １ ２ ６ ０ １ ７ ０ ） ； 教育部高等学校博 士学科点专项 科研基金博 导类项
第 ２期
徐静文等 ： 巴西橡胶树树皮环氧树脂组织切 片及染 色技术
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１ ． ２ ． ２ 渗 透和 包埋
采用 Ｅ ｐ ｏ ｎ ８ １ ２环 氧 树 脂 包 埋 剂 为 渗 透 包 埋 剂 。将 Ａ液 （ Ｅ ｐ ｏ ｎ ８ １ ２ １ ０ ｍ Ｌ ） 和 Ｂ液
［ Ｅ ｐ ｏ ｎ ８ １ ２ １ ０ ｍＬ＋ Ｄ Ｄ Ｓ Ａ（ 十二 烯基 丁二 酸酐 ）１ ６ ｍ Ｌ ＋ ＭＮ Ａ（ 甲基 丙 烯 腈 ）８ ． ９ ｍ Ｌ ］ 按 ｖ Ａ 液： 涟＝１ ： ４