菌藻共培养促进微藻生长的研究及其相互作用机制探索
菌藻共生系统在生猪养殖污水处理中的应用及其互作机制的研究进展
菌藻共生系统在生猪养殖污水处理中的应用及其互作机制的研究进展孙宏，李园成，王新，沈琦，姚晓红，吴逸飞，汤江武*（浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310021）摘 要：生猪养殖污水中污染物负荷高，处理难度大，对环境造成潜在风险。
菌藻共生系统是微藻与细菌的共生系统，目前已在国内外开展了广泛研究，可高效去除污水中的氮、磷等污染物，具有较好的开发应用前景。
本文就近年来菌藻共生系统对生猪养殖污水中氮、磷和重金属等的处理效果展开综述，深入介绍藻菌间在氮磷营养元素利用等方面的互作机制，并对可能影响处理生猪养殖污水效果的因素和相关光反应器装置进行分析汇总，为菌藻共生系统在生猪养殖污水处置中的应用提供科学参考。
关键词：菌藻共生系统；生猪养殖污水；互作机制；处理应用中图分类号：S828.4 文献标识码：A DOI编号：10.19556/j.0258-7033.20200323-03生猪养殖的规模化、集约化发展在满足猪肉消费的同时，也产生了大量养殖污水等废弃物，生猪养殖污水含有高浓度的氨氮、有机物和磷，若处置不合理将对环境造成严重危害。
以我国最常用的干清粪方式为例，养殖污水的化学需氧量（COD）、氨氮、总氮和总磷可分别达到5 664.17、732.5、1 100和564.67 mg/L[1]。
目前采用的以生化手段为主的处置方法能耗较大，仅提供曝气就占50%以上的污水处理运行成本[2]。
利用光合自养微藻处理养殖污水可实现污染物去除的同时积累生物质，从而实现氮、磷等资源的循环利用，是一种处理养殖污水的有效手段。
但该方法也存在耐受负荷低、大规模应用去除效率不高及下游微藻资源化利用成本高等问题[3]。
自然界中，微藻可与细菌共同形成菌藻共生系统存在。
近年来，国内外学者对微藻与细菌的互作机制开展了广泛研究，逐步明确了菌藻共生系统在协同污水净化处理中较单一微藻处理的优势[4-5]。
在此背景下，本文着重介绍了该系统在生猪养殖污水净化中的处理效果，并就其潜在机制及可能的影响因素进行综述。
认识有机硒
—12 —中国饲料添加剂2021年第3期（总第227期）认识有机硒王斐英1*张伟2廖小翠2刘鹏2（1.中国科学院成都有机化学研究所，四川成都610041；2.四川新一美生物科技有限公司，四川绵阳622651）1 前言硒位于化学元素周期表中第四周期VI A族,是一种非金属元素，由瑞典化学家Berzelius于1817年在硫酸厂的铅室底部的红色粉状物质中发现，并把它命名为Selene ，化学符号Se 。
直 到上世纪50年代的100多年间，硒一直被认为 是一种对人和动物毒性极强的化学元素。
但1957年Schwarz 和Foltz 提出了硒是酵母、肾和肝中发现的未知因子，并首次证明硒对动物具有营养作用。
从此人们将“硒”公认为是所有动物和人类所必需的营养元素。
随着研究人员对硒 相关领域研究的深入，科学家们于1973年研究发现硒是红细胞谷胱甘肽过氧化物酶（GSH- Px ） 的重要组成成分， 是人类和动物机体生长发育所必需的微量元素，在营养、代谢、繁殖、免疫 以及临床保健方面起着非常重要作用。
硒的化合物在自然界存在形式分为无机硒和有机硒两种。
无机硒一般指亚硒酸钠和硒酸 钠，从金属矿藏的副产品中获得。
有机硒则是硒通过生物转化与氨基酸结合而成,一般以硒代蛋 氨酸的形式存在。
过去相当长一段时间，在动物 饲料中硒主要以无机硒（亚硒酸钠）形式添加,但无机硒利用率低、毒性大， 对环境也存在不利影响。
有机硒一般以硒代蛋氨酸形式存在，依循蛋氨酸代谢途径代谢，参与蛋白的合成,容易在组织内储存、吸收;被动物吸收后可迅速的被利 用，有效改善体内血硒状况。
因此，有机硒的生产和应用研究逐渐成为热点。
近年来，随着国内畜牧业的迅速发展和饲料业的逐渐扩大，以及人们对高品质畜禽产品需求的日益提高,有机硒因其更高的生物利用率及低 毒性而被广为人知并成为畜牧养殖业优先选择使用,市场需求与日俱增。
从最初酵母硒的开始，经过近几十年来的科技进步和生产水平的提高，市面上涌现了一批新的有机硒饲料添加剂产品,如硒代蛋氨酸、硒代蛋氨酸羟基类似物、硒代蛋氨酸锌等。
水生环境中细菌与微藻的相互关系及其实际应用
第 ４卷第 １ 期
２ ０８年 ２月 ０
南 方 水 产
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摘要 ：概括 了细菌和微藻之 间的相互关 系及其 作用机 理 ，阐述 了细菌抑 制有害 微藻 、微 藻抑制 病原 细菌 、细菌 与微 藻协同净化水质 的研究进展 ，并针对水产养殖 的实 际 ，提 出菌一 藻关系研究及开发应 用的一些 思路 。
关键 词 ：细 菌 ；微 藻 ；相 互 关 系 中 图分 类 号 ：Ｓ １． ９７ １ 文 献标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１７ ２２ ６ ３— ２ ７一 （０ ８ １— ０ ６—０ ２０ ）０ ０ ７ ５
Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ： ｂａ ｔ ｒａ； ｍ ｉｒ ａｇ ｅ； ｉｔ ｒｅａｉ ｎ ｈｉ ｄｓ ｃｅ ｉ ｃｏｌａ ｎ ｅ ｒｌ ｔｏ ｓ ｐ
光合细菌处理微藻的原理
光合细菌处理微藻的原理光合细菌（phototrophic bacteria）是一类能够通过光合作用合成有机物质的微生物，它们能够利用光能将二氧化碳和无机物转化为有机物。
在自然界中，光合细菌被广泛分布于不同的环境中，包括土壤、水体、湿地和温泉等。
在这些环境中，光合细菌与微藻之间存在一种特殊的关系，称为光合共生（phototrophic symbiosis）。
光合细菌通过与微藻的共生关系，能够帮助微藻提供额外的光合产物，同时也获得微藻分泌的有利物质，从而实现共生互利的关系。
通过与光合细菌的共生，微藻能够获得以下几个方面的优势。
首先，光合细菌能够共同利用环境中的无机物质，包括二氧化碳、氮气、硫化氢等。
通过利用这些无机物质，光合细菌可以为微藻提供所需的营养物质，增强其生长和繁殖能力。
同时，光合细菌还能够通过合成一些有机物质，包括氨基酸、维生素和激素等，为微藻提供额外的营养支持。
其次，光合细菌能够帮助微藻克服环境中的光强度和温度等因素的限制。
在强光照射下，光合细菌能够吸收和利用多余的光能，从而减少微藻光合作用受到的伤害。
此外，光合细菌还能够利用其特殊的色素体系来适应不同的光强度和波长，提高光合细菌与微藻的光能利用效率。
同时，当环境温度较低时，光合细菌能够产生一些热稳定蛋白质，帮助微藻维持正常的生理功能。
另外，光合细菌还能够帮助微藻降解和利用环境中的有毒物质。
在一些富营养化或污染的水域中，光合细菌能够利用微藻排出的氧气和有机酸等代谢产物，降解水体中的无机氮和磷等有害物质。
这些有害物质在一定浓度下可以抑制微藻的生长和光合作用，通过与光合细菌的共生，微藻能够更好地适应这种环境，增强其抗逆性和适应性。
光合细菌处理微藻的原理可以总结为：通过与光合细菌的共生关系，微藻能够获得额外的营养物质和支持，提高光合效率和生长能力；同时，光合细菌能够帮助微藻克服环境中的光强度和温度等因素的限制，提高其适应性和生存能力；此外，光合细菌还能够降解和利用环境中的有毒物质，保护微藻免受有害物质的损害。
污水处理中菌藻共生系统的应用研究
污水处理中菌藻共生系统的应用研究发布时间：2021-06-03T09:45:22.447Z 来源：《基层建设》2020年第36期作者：周建强[导读] 摘要：随着我国当前科技水平的不断提高，在当前污水处理工作中，融入了新型的工作方案和技术模式，从而提高污水处理的效果。
中电环保股份有限公司南京 211100摘要：随着我国当前科技水平的不断提高，在当前污水处理工作中，融入了新型的工作方案和技术模式，从而提高污水处理的效果。
比如在当前时代下菌藻共生系统得到广泛性的利用，不仅可以满足污水处理的需求，还有助于加快污水处理的速度，满足当前污水处理的标准，本文论述了污水处理工作中菌藻共生系统的特点和主要的运用流程，从而给实际工作起到重要的支撑作用。
关键词：污水处理；菌藻共生系统；系统应用在利用菌藻共生系统进行污水处理工作中需要完善基础设施，并且还要根据这一地区城市污水的特点采取有效的应对方案，加强技术和设备的投入力度，并且做好水体指标的全方位观察以及测评，做好经验的总结以及分析工作，从而使得菌藻共生系统能够在污水处理中发挥其应有的价值和效果，为污水处理工作提供重要的基础。
一、菌藻之间的相互关系（一）互利共生关系为了使菌藻共生系统能够在污水处理中发挥其应有的价值和效果，在实际实施时需要了解菌藻之间的相互关系，从而为后续污水处理工作提供重要的方向。
通过细菌和微藻的互利共生关系，能够实现代谢功能的有效性协调，起到重要的互补作用，主要表现的是对氧气和代谢产物的释放功能上。
微藻通过光合作用利用氧气作为耗氧菌群，呼吸降解污染物的电子受体来去除其中的污染物，同时细菌的呼吸功能的产生的二氧化碳也可以为微藻提供有效的光合作用。
在新陈代谢方面，在富营养的状态下，微藻可以通过光合作用吸收氮磷等化合物合成自身的物质，同时向环境中释放一些有机物，微藻细胞的分解属于中碱性有机碳的重要来源，细菌能够利用氧气分解味道所产生的分泌物，产生分解产物，反过来被微藻吸收，利用细菌和微藻在增殖过程中会向环境周边释放一些酶物质，比如磷酸酶和脂肪酶等等。
微藻培养过程的营养优化与控制研究
微藻培养过程的营养优化与控制研究一、本文概述随着全球能源危机和环境污染问题的日益严重，寻找可持续、环保的能源替代方案已成为科学研究的重要课题。
微藻作为一种高效的光合作用生物，其在生物能源、环保治理、食品添加剂等领域的应用潜力逐渐受到人们的关注。
微藻培养过程中的营养优化与控制，对于提高微藻生长速率、增加生物质产量、优化生物质品质等方面具有至关重要的作用。
本文旨在探讨微藻培养过程中的营养优化与控制策略，以期为提高微藻培养效率、推动微藻产业的可持续发展提供理论支持和实践指导。
本文将对微藻培养的营养需求进行深入分析，包括碳源、氮源、磷源等基本营养元素的种类、作用机制及适宜浓度范围。
在此基础上，将探讨不同营养元素之间的相互作用及其对微藻生长的影响，为制定科学的营养优化方案提供理论依据。
本文将重点研究微藻培养过程中的营养控制策略。
通过调整培养基组成、优化光照条件、控制培养温度等手段，实现对微藻生长环境的精准调控。
还将探讨营养胁迫、营养元素循环利用等技术在微藻培养中的应用，以期进一步提高微藻生物质的产量和品质。
本文将对微藻培养的营养优化与控制研究进行展望，分析当前研究存在的问题和挑战，并提出未来的研究方向和建议。
通过不断优化和完善微藻培养的营养策略，我们有望为应对全球能源危机和环境污染问题提供新的解决方案，实现人类社会的可持续发展。
二、微藻培养的营养需求微藻是一类光合作用微生物，它们通过吸收光能、水和无机物质（如二氧化碳、无机盐等）进行生长和繁殖。
因此，微藻培养过程中的营养需求主要围绕这些无机物质展开。
碳源是微藻生长的关键要素。
微藻主要利用二氧化碳作为碳源进行光合作用，但在封闭或光照受限的培养系统中，可能需要补充有机碳源以满足其生长需求。
常见的有机碳源包括葡萄糖、乙酸钠等。
氮源是微藻生长的另一个重要营养因素。
氮是微藻细胞组成中的关键元素，对微藻的生长和代谢具有重要影响。
常用的氮源包括硝酸盐、铵盐等。
不同的微藻种类和生长阶段对氮源的需求和利用效率可能有所不同，因此需要根据具体情况进行优化。
隐秘小环藻藻际细菌分离鉴定及其对藻细胞生长的影响
第54卷 第4期 2024年4月中国海洋大学学报P E R I O D I C A L O F O C E A N U N I V E R S I T Y O F C H I N A54(4):027~037A pr .,2024隐秘小环藻藻际细菌分离鉴定及其对藻细胞生长的影响❋刘 雨1,张 裕1,李 赟1,朱葆华1,潘克厚1,2❋❋(1.海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学),山东青岛266003;2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室,山东青岛266237)摘 要: 为了解隐秘小环藻(C y c l o t e l l a c r y pt i c a )共生细菌对其生长的影响,本文运用稀释梯度涂布法分离纯化藻液中的细菌,检测了藻菌共培养液中的溶解有机碳(D i s s o l v e d o r g a n i c c a r b o n ,D O C )㊁溶解无机碳(D i s s o l v e d i n o r ga n i c c a rb o n ,D I C )及胞外聚合物(E x t r ac e l l u l a r p o l ym e r i c s u b s t a n c e s ,E P S )含量的变化,比较了分离菌株对微藻生物量和脂质的影响,初步探究了藻菌之间的相互作用模式㊂研究显示,从隐秘小环藻藻液共分离纯化8株可培养细菌,通过比对菌株的部分16Sr D N A 序列,完成了其分类学鉴定㊂其中,菌株C -1和C -7为隐秘小环藻的优势促生菌,分别将藻细胞密度提高了27.1%和23.9%㊂与菌株C -1共培养的隐秘小环藻,脂质含量高达43.53%,脂质产率为16.69m g㊃L -1㊃d -1,比无菌纯培养对照组的脂质产率提高了37.37%㊂碳交换研究结果显示,共培养7d 后,2个促生菌株构建的共培养体系中D O C 含量显著低于无菌纯培养对照组;D I C 含量显著高于无菌纯培养对照组㊂与无菌纯培养对照组相比,藻菌共培养导致培养上清液中E P S 的多糖和蛋白含量显著降低,而细胞结合态E P S 的多糖含量在前4d 高于对照组,之后显著降低,但细胞结合态E P S的蛋白含量始终高于对照组㊂本研究构建了隐秘小环藻与细菌的共生体系,探究了藻菌之间的互作效应,可为隐秘小环藻的规模化生产提供参考㊂关键词: 隐秘小环藻;溶解有机碳;溶解无机碳;胞外聚合物;生长;脂质含量;藻际细菌中图法分类号: S 968.41 文献标志码: A 文章编号: 1672-5174(2024)04-027-11D O I : 10.16441/j.c n k i .h d x b .20220468引用格式: 刘雨,张裕,李赟,等.隐秘小环藻藻际细菌分离鉴定及其对藻细胞生长的影响[J ].中国海洋大学学报(自然科学版),2024,54(4):27-37.L i u Y u ,Z h a n g Y u ,L i Y u n ,e t a l .I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f p h y c o s p h e r e b a c t e r i a o f C y c l o t e l l a c r y pt i c a a n d t h e i r i n f l u -e n c e s o n m i c r o a l g a l c e l l g r o w t h [J ].P e r i o d i c a l o f O c e a n U n i v e r s i t y of C h i n a ,2024,54(4):27-37. ❋ 基金项目:国家自然科学基金项目(41976118)资助S u p p o r t e d b yt h e N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a (41976118)收稿日期:2022-11-16;修订日期:2023-03-19作者简介:刘 雨(1998 ),女,硕士生,主要从事微藻生理生态研究㊂E -m a i l :y u yu 125225@163.c o m ❋❋ 通信作者:潘克厚(1963 ),男,博士,教授,博士生导师,主要研究方向为藻类生物学与生物工程㊁海洋生态学㊂E -m a i l :q d k h pa n @126.c o m 藻际细菌与微藻之间存在着复杂的相互作用[1-4],许多研究表明,大多数相互作用基于溶解有机物的微生物降解与转化[5-6]㊂某些细菌可以吸收利用微藻释放到周围水体中的溶解有机碳(D i s s o l v e d o r ga n i c c a r -b o n ,D O C ),或附着在死亡细胞碎屑上代谢颗粒有机碳维持自身的生长[7-8],同时,提供维生素㊁氨基酸及植物激素等促进微藻的生长,这些细菌被称为微藻的藻际促生菌[9]㊂例如,细菌R u e g e r i a p o m e r o yi 可利用假微型海链藻产生的D O C 和硫代谢物进行繁殖,同时合成维生素B 12促进假微型海链藻的生长[10-11]㊂普通小球藻释放的D O C 被细菌降解利用,细菌大量繁殖,代谢活动产生的D I C 含量升高,增强了微藻光合作用的无机碳供应,从而促进了微藻的生长[5]㊂A z o s pi r i l l u m b r a s i l e n s e 促进C h l o r e l l a s o r o k i n i a n a 叶绿素含量的同时,也提高了微藻的脂质含量和脂肪酸种类[12]㊂W a n g等[13]从栅藻(S c e n e d e s m u s o b l i qu u s )藻液中分离纯化出一株促生菌,可将微藻生物量提高24.8%㊂玫瑰杆菌类群可利用多列拟菱形藻(P s e u d o -n i t z s c h i a m u l t i -s e r i e s )分泌的色氨酸合成吲哚-3-乙酸,从而促进藻细胞的分裂,调节藻细胞生长周期[14-15]㊂作为溶解有机物的一部分,E P S 在微藻和细菌共生的细胞通讯中起关键作用[16],其浓度的增加可能有利于菌藻共培养系统的稳定[17]㊂B r e n n e r 等[18]证明了硅藻E P S 多糖可作为其藻际细菌的底物,且不同的细菌菌株可利用E P S 多糖的不同部分㊂目前,菌藻共培养研究主要集中在废水处理[19-20],关于有益藻菌共生体系在微藻规模化养殖中的应用还相对较少㊂系统了解微藻与细菌之间的关系,对构建高效的藻菌共培养体系具有重要的意义㊂隐秘小环藻(C y c l o t e l l a c r y pt i c a )作为一种广盐性中国海洋大学学报2024年海洋硅藻,其油脂含量可达总生物量的40%,甘油三酯含量占总脂含量的55%左右,是一种良好的脂质生产者[21-23]㊂另外,隐秘小环藻具有纳米级到微米级的多孔结构,具有很好的止血㊁药物缓释能力,已有研究表明隐秘小环藻具有非常广阔的综合利用潜力㊂无菌化处理前后隐秘小环藻的生长结果显示,无菌化处理后,隐秘小环藻的生物量比无菌化处理前降低16%左右[24],说明隐秘小环藻的培养液中可能存在促进该藻株生长的菌株㊂为筛选隐秘小环藻藻际促生菌,本文首先运用传统的微生物分离培养方法,分离纯化隐秘小环藻藻际细菌,并完成分类学鉴定㊂其次,比较了分离菌株对隐秘小环藻生长和脂质含量的影响㊂最后,分析了2株促生菌的藻菌共培养体系中溶解有机碳,溶解无机碳(D i s s o l v e d i n o r g a n i c c a r b o n,D I C)及胞外聚合物浓度的变化,阐明藻菌可能的互作模式㊂1材料和方法1.1藻际细菌分离与鉴定本实验所用的隐秘小环藻(C y c l o t e l l a c r y p t i c a)由中国海洋大学应用微藻生物学实验室提供(编号L A M B147),保存于f/2培养基[25]中㊂将隐秘小环藻培养物浓度稀释为1/106~1/104,取100μL稀释液均匀涂布于Z o B e l l2216E固体培养基[26]中,在37ħ培养箱中培养一周,挑取不同形态特征的单菌落,多次划线纯化至无杂菌污染,获得纯培养细菌㊂反复冻融法提取细菌D N A:挑取单菌落于1.5m L 离心管中,加入50μL无菌水,涡旋混匀,先后置于液氮和100ħ水浴锅中反复冻融3次(10m i n/次),于4ħ下12000r/m i n离心10m i n,取上清㊂16S r D N A P C R扩增的引物为细菌通用引物:27F (5'-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3')和1492R(5'-T A C G G T T A C C T T G T T A C G A C T T-3')㊂P C R产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,通过凝胶提取试剂盒(B e c k m a n C o u l t e r G e n o m i c s,D a n v e r s,M A,U S A)纯化,由上海生工生物公司进行测序㊂将测序获得的16S r D N A序列分别与E z B i o C l o u d s e r v e r数据库的标准菌株比对,完成分类学鉴定㊂使用M E G A11软件中的N e i g h b o r-j i o n i g(N J)法构建系统发育树㊂1.2藻菌共培养体系的建立1.2.1无菌藻株及培养条件使用抗生素处理获得无菌隐秘小环藻[24]㊂将指数生长期的隐秘小环藻接种于新鲜无菌的f/2培养基中,添加600μg/m L硫酸庆大霉素㊁800μg/m L硫酸卡那霉素和800μg/m L硫酸链霉素联合处理3d;离心洗涤后重新接种于新鲜f/2培养基,培养3d;再次离心洗涤,接种于新鲜f/2培养基,追加25μg/m L盐酸环丙沙星处理3d㊂将除菌后的隐秘小环藻转入不含抗生素的f/2培养基中,传代5次(各代培养7d)后获得无菌藻株㊂采用荧光染色观察法检验其无菌性:取100μL无菌藻液,加入0.1μL S Y B R G r e e n I核酸染料染色20m i n,在荧光显微镜下未观察到被染色的细菌㊂无菌隐秘小环藻培养基为f/2培养基㊂培养条件:温度22ħ,光强40μm o l㊃m-2㊃s-1,光暗周期12hʒ12h的光照培养箱中培养㊂离心(3000r/m i n,5m i n)收集指数生长期的无菌藻株,洗涤后重悬于300m L f/2培养基,调节初始O D750=0.1(藻细胞密度约为2.0ˑ105c e l l s/m L)㊂1.2.2细菌对微藻生长的影响细菌培养基为Z o-B e l l2216E液体培养基㊂将8株分离菌分别按2%(体积比)接种量接种于Z o B e l l2216E液体培养基中,在37ħ和200r/m i n下培养12h,O D600均达到0.6~ 1.0(指数期)㊂将菌液8000r/m i n离心10m i n,f/2培养基洗涤并重悬细菌细胞,调节菌悬液O D600=1.0(细菌密度约为1ˑ108C F U/m L)㊂取9m L菌悬液接种到上述无菌小环藻培养物中,使初始菌藻细胞比为15ʒ1㊂每个处理组设置3个平行㊂共培养实验条件:温度22ħ㊁光照强度40μm o l㊃m-2㊃s-1㊁光暗周期12hʒ12h,连续培养8d㊂使用血球计数板每两天统计微藻细胞数,并绘制生长曲线㊂培养结束时采用干质量法测定微藻的生物量㊂将孔径为0.45μm的混合纤维滤膜置于60ħ烘箱中烘干至恒重W1,取10m L混匀的藻液,3000 r/m i n离心5m i n,向沉淀中加入10m L f/2培养基,将藻细胞重悬后进行抽滤,再次将滤膜烘干至恒重记为W2,并计算总生物质浓度(D r y w e i g h t,D W,单位g/L):C D W=(W1-W2)/V㊂每两天取1m L共培养液,用无菌水稀释1ˑ105倍,取100μL稀释液进行Z o B e l l2216E琼脂涂板,平板置于37ħ恒温培养箱中培养3d,然后统计菌落数,计算共培养体系中的细菌密度㊂1.3脂质含量与脂肪酸组成测定脂质的提取采用氯仿ʒ甲醇提取法,含量测定基于质量法[27]㊂按上述培养条件连续培养8d后,收集藻细胞,冷冻干燥后取15m g(m0),加入3m L提取缓冲液(氯仿ʒ甲醇=2ʒ1),室温涡旋15m i n,震荡摇晃10h,离心(8000r/m i n,10m i n)取上清后,再次向沉淀中加入3m L提取缓冲液,重复上述步骤1次㊂将两次上清液合并,加入1/5体积0.9%N a C l溶液,涡旋5m i n后静置分层㊂吸取氯仿层,通过0.22μm滤器过滤到玻璃管(m1)中,55ħ水浴加速氯仿挥发,再放入烘干箱中烘干,称重为m2,总脂含量=(m2-m1)/ m0ˑ100%㊂824期刘雨,等:隐秘小环藻藻际细菌分离鉴定及其对藻细胞生长的影响参照N i u[28]等描述的方法提取脂肪酸,使用气相色谱法分析其组成㊂气相色谱仪的条件设置:载气为N2和H2,流速分别为40和25m L/m i n;进样口温度250ħ;内部程序升温至150ħ维持1m i n,再以15ħ/m i n升高至250ħ保留10m i n㊂数据处理采用面积归一化法㊂1.4溶解有机碳、溶解无机碳及胞外聚合物浓度测定每2d检测共培养体系中胞外聚合物的蛋白质与多糖浓度变化㊂取2m L共培养液,在4ħ下8000r/m i n 离心10m i n,上清液通过0.45μm滤膜过滤,收集上清部分的胞外聚合物;将沉淀重悬于2m L三蒸水中,并在60ħ下震荡水浴30m i n,再次离心后通过0.45μm 滤膜收集细胞结合部分的胞外聚合物[15]㊂使用牛血清白蛋白作为标准品,通过B C A蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝科技有限公司,北京)测定蛋白质浓度,以葡萄糖为标准品,通过苯酚-硫酸法测定多糖浓度㊂在培养的第4天和第7天,通过总有机碳分析仪检测共培养体系中的溶解有机碳和溶解无机碳含量[29]㊂1.5数据处理三组平行的实验数据均用于结果分析,计算平均值及标准差M e a nʃS E,使用O r i g i n软件进行数据整理并作图,采用S P S S软件对数据进行单因素方差分析(A N O V A),并进行多重比较(L S D,D u n c a n),显著性水平为p<0.05㊂2结果与分析2.1藻际细菌的分离鉴定经Z o B e l l2216E平板涂布划线,从隐秘小环藻藻际中分离纯化8株可培养细菌,菌落特征如表1所示㊂8株菌株的菌落均为光滑㊁湿润的圆形,但菌落大小㊁颜色明显不同㊂依据菌落特征,分别将分离菌株标记为C-1㊁C-2㊁C-3㊁C-4㊁C-5㊁C-6㊁C-7和C-8㊂表1分离菌株菌落的表观特征T a b l e1 A p p a r e n t c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e i s o l a t e d s t r a i n c o l o n i e s菌种B a c t e r i a l s t r a i n s大小M e a s u r e m e n t/m m形态M o r p h o l o g i c a l颜色C o l o r s透明度T r a n s p a r e n c y光泽质地G l o s s y t e x t u r eC-11.0圆形金黄色不透明光滑湿润C-20.5圆形灰黄色不透明光滑湿润C-30.5圆形瓷白色不透明光滑湿润C-41.0圆形乳黄色不透明光滑湿润C-51.0圆形橙色半透明光滑湿润C-60.2圆形青黄色不透明光滑湿润C-72.0圆形乳白色不透明光滑湿润C-80.5圆形橘黄色半透明光滑湿润运用P C R方法,本文获得了8株细菌的16S r D N A 部分序列,与E z B i o C l o u d s e r v e r数据库的标准菌株比对,利用N e i g h b o r-j i o n i g(N J)法构建系统发育树,结果如图1所示㊂菌株C-1和C-7分别属于α变形菌门的赤细菌属(E r y t h r o b a c t e r s p.)和海杆菌属(M a r i n i b a c-t e r i u m s p.);菌株C-4属于γ变形菌门的盐单胞菌属(H a l o m o n a s s p.);菌株C-2㊁C-3和C-8分布于厚壁菌门两个不同的科,菌株C-2与C-3均为葡萄球菌属(S t a p h y l o c o c c u s s p.),菌株C-8属于芽孢杆菌属(B a-c i l l u s s p.);菌株C-5为拟杆菌门中的鼠尾菌属(M u r i-c a u d a s p.),菌株C-6属于放线菌门的纤维单胞菌属(C e l l u l o m o n a s s p.)㊂2.2共培养体系中微藻与细菌的生长情况无菌纯培养时,小环藻从初始接种的2.0ˑ105c e l l s/m L 增长至第4天进入平台期,细胞数维持在(4.8ʃ0.1)ˑ105c e l l s/m L,藻细胞密度增加了1倍以上(见图2)㊂菌株C-2与C-3分别与小环藻构建的菌藻体系中,培养的8d时间内,藻细胞密度虽均有增长,但总是低于无菌纯培养对照组㊂实验结束时,两个藻菌共培养体系的藻细胞数分别比无菌纯培养对照组降低了(6.4ʃ0.5)%和(10.1ʃ1.5)%㊂而其他6株藻菌构建的共培养体系,与对照组相比,小环藻的细胞数目均显著性增加,说明这6株分离菌均对小环藻的生长有促进作用㊂其中,菌株C-1和C-7的促进效果最好,培养至第8天,微藻细胞数分别为(6.2ʃ0.2)ˑ105和(6.0ʃ0.5)ˑ105c e l l s/m L,分别比对照组提高了(27.1ʃ1.6)%和(23.9ʃ3.9)%㊂菌株C-4㊁C-5㊁C-6和C-8共培养体系的藻细胞密度分别比对照组提高了(13.5ʃ0.7)%㊁(5.3ʃ0.9)%㊁(15.1ʃ1.4)%和(8.7ʃ0.8)%(见图2和图3)㊂92中国海洋大学学报2024年图1基于16S r D N A部分序列构建的8株细菌(C-1 C-8)的系统发育树F i g.1P h y l o g e n e t i c t r e e o f e i g h t s t r a i n s o f b a c t e r i a(C-1 C-8)b a s e d o n p a r t i a l16S r D N A s e q u e n c e s伴随着微藻的生长,菌株C-1㊁C-2㊁C-4和C-7均能在共培养体系中稳定生长,在培养第4~8天,菌细胞数目保持相对稳定,菌落数分别为7.35ˑ107㊁4.87ˑ107㊁3.57ˑ107和4.0ˑ107C F U/m L(见图4)㊂而菌株C-3在共培养的第1和第2天迅速繁殖,之后菌落数在4ˑ107C F U/m L左右剧烈波动㊂菌株C-6在共培养前4d快速生长,至第4天菌落数为5.5ˑ107C F U/m L,但在第6天后迅速死亡,第8天菌落数仅为3.2ˑ107C F U/m L㊂菌株C-5在培养前2d有所生长,随后菌落数下降至初始接种量水平㊂菌株C-8在共培养过程中始终生长缓慢,培养第8天,菌落数仅为1.95ˑ107C F U/m L㊂综合上述细菌促生长效果与其自身在共培养体系中的生长情况,菌株C-1㊁C-4与C-7可能是隐秘小环藻的促生菌㊂2.3隐秘小环藻脂质含量与脂肪酸组成分别与菌株C-1㊁C-4和C-7共培养8d,所有实验组小环藻均生长至平台期,其最终干质量含量分别为0.31㊁0.26和0.29g/L(见表2),比无菌纯培养分别提高了29.17%㊁8.33%和20.83%㊂与菌株C-1共培养,034期刘 雨,等:隐秘小环藻藻际细菌分离鉴定及其对藻细胞生长的影响(C o -C -1:无菌隐秘小环藻与菌株C -1共培养;C o -C -2:无菌隐秘小环藻与菌株C -2共培养;C o -C -3:无菌隐秘小环藻与菌株C -3共培养;C o -C -4:无菌隐秘小环藻与菌株C -4共培养;C o -C -5:无菌隐秘小环藻与菌株C -5共培养;C o -C -6:无菌隐秘小环藻与菌株C -6共培养;C o -C -7:无菌隐秘小环藻与菌株C -7共培养;C o -C -8:无菌隐秘小环藻与菌株C -8共培养㊂C o -C -1:A x e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h s t r a i n C -1;C o -C -2:A x e n i c C .c r y p t i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h s t r a i n C -2;C o -C -3:A x e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h s t r a i n C -3;C o -C -4:A x e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h s t r a i n C -4;C o -C -5:A x e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h s t r a i n C -5;C o -C -6:A x e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h s t r a i n C -6;C o -C -7:A x e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h s t r a i n C -7;C o -C -8:A x e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h s t r a i n C -8.)图2 隐秘小环藻与细菌共培养的生长曲线F i g .2G r o w t h c u r v e o f C .c r y pt i c a i n t h e c o -c u l t u r e w i t h t h e i s o l a t e d s t r a i ns图3 隐秘小环藻与细菌共培养第8天细菌促进/抑制小环藻生长的百分比F i g .3 P e r c e n t a g e o f gr o w t h p r o m o t i o n /i n h i b i t i o n b y t h e b a c t e r i a i n 8t hd a y o f C .c r y pt i c a c o -c u l t u r e w i t h t h e i s o l a t e d b a c t e r i a l s t r a i ns图4 共培养体系中细菌的菌落数量F i g .4 C o l o n y nu m b e r s o f t h e i s o l a t e d b a c t e r i a l s t r a i n s i n t h e c o -c u l t u r e s ys t e m 表2 与菌株共培养下隐秘小环藻的干质量和脂质产率T a b l e 2 D r y w e i g h t a n d l i p i d p r o d u c t i v i t i e s o f C .c r y pt i c a c o -c u l t u r e d i n c o -c u l t u r e w i t h d i f f e r e n t s t r a i n s o f b a c t e r i a组别①干质量②/(g㊃L -1)脂质含量(干质量)③/%脂质产率④/(m g㊃L -1㊃d -1)对照组⑤0.24ʃ0.03a 39.96ʃ1.45a 12.15ʃ1.44a C o -C -10.31ʃ0.02c43.53ʃ1.66b 16.69ʃ0.83b C o -C -40.26ʃ0.01a b 39.71ʃ1.31a 12.91ʃ0.50a C o -C -70.29ʃ0.03b c40.83ʃ1.56a15.14ʃ1.64b注:数值以平均值ʃ标准差(n =3)表示,同一列数据上标不同字母代表差异显著(P <0.05)㊂C o -C -1:无菌隐秘小环藻与C -1共培养组;C o -C -4:无菌隐秘小环藻与C -4共培养组;C o -C -7:无菌隐秘小环藻与C -7共培养组㊂V a l u e s a r e m e a n s ʃS D (n =3).V a l u e s w i t h i n t h e s a m e c o l u m nw i t h d i f f e r e n t l e t t e r s a r e s i g n i f i c a n t l y di f f e r e n t (P <0.05).C o -C -1:G r o u p o f a x e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h C -1;C o -C -4:G r o u p o f a x -e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h C -4;C o -C -7:G r o u p o f a x e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h C -7.①G r o u p s ;②D r y w e i g h t ;③L i p i d c o n -t e n t (d r y w e i g h t );④L i p i d p r o d u c t i v i t i e s ;⑤C o n t r o l g r o u p.获得最高的脂质含量(43.53%)和脂质产率(16.69m g㊃L -1㊃d -1),分别比无菌纯培养提高了8.93%和37.37%(P <0.05)㊂菌株C -4与C -7并未显著改变小环藻的脂质含量(P >0.05),但由于C -7显著提高了小环藻的终生物量(0.29g㊃L -1),因此脂质产率比无菌纯培养提高了24.61%㊂气相色谱(G a s c h r o m a t o g r a p h y)分析(见图5)显示,隐秘小环藻的主要脂肪酸种类为C 16ʒ0㊁C 16ʒ1㊁C 17ʒ1和C 20ʒ5n -3(E P A ),这些脂肪酸占总脂肪酸的76%左右㊂隐秘小环藻中单不饱和脂肪酸(M o -n o u n s a t u r a t e d f a t t y ac id )含量最高,占总脂肪酸的13中 国 海 洋 大 学 学 报2024年43.16%ʃ2.70%,其次为饱和脂肪酸(S a t u r a t e d f a t t y a c i d ),占总脂肪酸的36.03%ʃ1.92%,而多不饱和脂肪酸(P o l y u n s a t u r a t e d f a t t y ac id )仅为20.66%ʃ2.34%㊂菌株C -1㊁C -4㊁C -7并未显著改变小环藻饱和脂肪酸㊁单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸的比例(P >0.05),但棕榈油酸甲酯含量为(26.38%ʃ1.20%)~(26.73%ʃ1.38%),显著低于无菌纯培养的29.95%ʃ1.76%(P <0.05)㊂与菌株C -7共培养的藻细胞中十七烷酸甲酯和E P A 含量为14.07%ʃ0.75%和14.77%ʃ0.84%,分别比无菌纯培养提高了6%和7.8%㊂与菌株C -1共培养的藻细胞中十七酸甲酯含量为9.66%ʃ0.05%,比无菌纯培养提高了7.5%㊂说明细菌对小环藻的脂肪酸组成虽有影响,但影响不显著㊂((a )不同种类脂肪酸的占比;(b )饱和脂肪酸㊁单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸的占比㊂数据为三次重复的平均值㊂(a )P e r c e n t a ge of d i f f e r e n t t y p e s o f f a t t y a c i d s ;(b )P e r c e n t ag e o f S F A ㊁M U F A a n d P U F A .D a t a a r e m e a n v a l u e s o f th r e e r e pe t i t i o n s .)图5 与细菌共培养8天后隐秘小环藻的脂肪酸组成F i g .5 F a t t y a c i d p r o f i l e o f C .c r y pt i c a a f t e r 8d a y s o f c o -c u l t u r e w i t h b a c t e r i a 2.4溶解有机碳和溶解无机碳浓度隐秘小环藻与菌株C -1和C -7共培养体系中溶解有机碳(D O C )与溶解无机碳(D I C )含量变化如图6所示,随着培养时间的延长,无菌纯培养对照组和2个藻菌共培养体系的D O C 和D I C 浓度均呈现出增高趋势,但共培养体系中的D O C 始终低于无菌纯培养对照组,((a )D O C 含量的变化;(b )D I C 含量的变化㊂C o -C -1:无菌隐秘小环藻与C -1共培养组;C o -C -7:无菌隐秘小环藻与C -7共培养组㊂(a )C h a n ge s i n D O C c o n t e n t ;(b )C h a n g e s i n D I C c o n t e n t .C o -C -1:G r o u p of a x e n i c C .c r y p t i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h C -1;C o -C -7:G r o u p o f a x e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h C -7.)图6 隐秘小环藻细菌共培养体系中D O C 和D I C 含量的变化F i g .6 C h a n g e s o f D O C a n d D I C c o n t e n t i n c o -c u l t u r e s y s t e m o f C .c r y pt i c a w i t h b a c t e r i a 234期刘 雨,等:隐秘小环藻藻际细菌分离鉴定及其对藻细胞生长的影响D I C 始终高于无菌纯培养对照组㊂培养第4天,菌株C -1共培养体系的D O C 浓度为(50.3ʃ2.7)m g/L ,显著低于对照组的(67.3ʃ8.5)m g/L ;而菌株C -7共培养体系的D O C 含量与对照组无显著性差异(P >0.05)㊂但在培养第7天,菌株C -1㊁C -7共培养体系的D O C 含量分别为(86.2ʃ12.2)m g /L 和(108.9ʃ7.8)m g/L ,分别比对照降低了28.4%和9.6%(P <0.05)㊂2个藻菌共培养体系中的D I C 含量在第4天均与对照组无显著差异(P >0.05),到第7天C -1共培养体系中D I C 含量为106m g/L ,比对照显著提高了20%(P <0.05),C -7共培养体系中D I C 含量为(98.9ʃ12.2)m g/L ,仅比对照显著提高了12%(P >0.05)㊂2.5胞外聚合物浓度的变化隐秘小环藻与菌株C -1和C -7构建的藻菌共培养液中多糖与蛋白浓度的变化如图7所示㊂培养前4d,2个藻菌共培养液的上清胞外聚合物(S o l u b l e -e x t r a -c e l l u l a r p o l ym e r i c s u b s t a n c e s ,S L -E P S )的多糖和蛋白浓度与无菌纯培养之间无显著差异(P >0.05),但在第4天后,共培养液中S L -E P S 的浓度较无菌纯培养显著降低㊂其中,与菌株C -1共培养第6天S L -E P S 多糖和蛋白浓度分别为(6.4ʃ0.5)m g /L 和(5.0ʃ0.4)m g/L ,分别比无菌纯培养对照组降低了27.3%和66.4%(P<((a )S L -E P S 多糖含量的变化;(b )B -E P S 多糖含量的变化;(c )S L -E P S 蛋白含量的变化;(d )B -E P S 蛋白含量的变化㊂C o -C -1:无菌隐秘小环藻与C -1共培养组;C o -C -7:无菌隐秘小环藻与C -7共培养组㊂(a )C h a n g e s i n p o l y s a c c h a r i d e c o n c e n t r a t i o n o f S L -E P S ;(b )C h a n g e s i n p o l ys a c c h a r i d e c o n -c e n t r a t i o n o f B -E P S ;(c )C h a n g e s i n p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f S L -E P S ;(d )C h a n g e s i n p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f B -E P S .C o -C -1:G r o u p o f a x e n i c C .c r y p-t i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h C -1;C o -C -7:G r o u p o f a x e n i c C .c r y pt i c a c o -c u l t i v a t i o n w i t h C -7.)图7 隐秘小环藻细菌共培养胞外聚合物浓度的变化F i g .7 C h a n g e s i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r s i n C o -c u l t u r e o f C .c r y pt i c a a n d b a c t e r i a 33中国海洋大学学报2024年0.05)㊂与菌株C-7共培养第6天,S L-E P S多糖和蛋白浓度分别为(7.6ʃ1.0)m g/L和(9.3ʃ1.0) m g/L,分别比无菌纯培养对照组降低了13.6%和37.6%(P<0.05)(见图7(a)㊁图7(c))㊂菌株C-1和C-7藻菌共培养液的结合胞外聚合物(B o u n d-e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r i c s u b s t a n c e s,B-E P S)的多糖浓度在第2天分别为(5.4ʃ0.6)m g/L和(5.9ʃ1.1)m g/L,分别比对照提高了54.3%和68.6%;共培养至第4天,菌株C-1和C-7藻菌共培养的多糖浓度分别升至(6.7ʃ0.4)m g/L和(7.4ʃ0.9)m g/L㊂但随后共培养体系的B-E P S多糖浓度均显著低于对照;至培养第8天时,菌株C-1㊁C-7共培养体系的B-E P S多糖分别为(12.9ʃ0.6)m g/L和(12.1ʃ2.1)m g/L,分别比对照组的(16.4ʃ1.9)m g/L降低了21.3%和26.2%(见图7(b));而共培养体系的B-E P S蛋白浓度在整个培养过程中始终高于无菌纯培养对照组,在培养第4天,菌株C-1㊁C-7共培养体系的B-E P S蛋白含量分别为(18.1ʃ3.6)m g/L和(18.8ʃ2.4)m g/L,与对照组差别最大,分别比对照组提高了54.7%和60.7%(见图7(d))㊂3讨论微藻在自然界或规模化养殖过程中,其藻际微环境中存在着丰富的细菌群落[20]㊂已有的研究显示,无菌培养条件下,微藻在自营养条件下的生长速度普遍非常缓慢[30]㊂同样,本研究中无菌培养的隐秘小环藻,其生物量比原始藻株降低了16%[24]㊂微藻的培养液中可能存着在促进该藻株生长的细菌㊂本研究从隐秘小环藻藻液中分离鉴定8株细菌,分别与无菌隐秘小环藻共培养,结果显示,菌株C-1㊁C-4㊁C-7和C-6对隐秘小环藻的生长具有明显的促进作用㊂且菌株C-1㊁C-4和C-7均能在藻液中随着隐秘小环藻的生长而稳定增殖,培养第8天实验结束时,细菌数目达到初始接种量的8~12倍㊂C h o等[5]发现小球藻藻际中存在4株细菌可显著增加藻细胞数量(>100%),且其中2株细菌在藻菌共培养后期迅速生长㊂周真真等[31]研究发现,6株藻际分离细菌均能促进微藻的生长,但只有2株细菌能够在藻菌共培养体系中稳定繁殖,且只有这2种藻菌体系能够保持相对稳定㊂本研究中菌株C-6在共培养初期快速繁殖,在培养第8天时死亡㊂因此,菌株C-6可能无法与隐秘小环藻维持长期稳定的共生关系㊂虽然菌株C-5和C-8也促进了小环藻的生长(<10%),但这2株菌在藻液中始终增殖缓慢,这可能是由于隐秘小环藻分泌了限制细菌生长的化合物或细菌对隐秘小环藻胞外有机物的利用能力较弱导致的[32]㊂同时,本研究发现菌株C-2和C-3属于S t a p h y l o c o c c u s s p.,均抑制了小环藻的生长㊂某些细菌可能与微藻竞争营养物质,产生抑制微藻生长的代谢产物,或分泌杀藻物质导致藻细胞溶解[33]㊂一个成功的藻菌共生系统应该对该系统中所有的微生物都有益㊂因此,本研究分离的菌株C-1和C-7是隐秘小环藻理想的促生菌株,可与小环藻构建藻菌共培养体系㊂研究表明,与促生菌共培养不仅可以提高微藻生物量,还可能有利于脂质的积累[34-37]㊂本研究中,与菌株C-1共培养,可同时提高隐秘小环藻的生物量和脂质含量,最终提高了隐秘小环藻的脂质产率㊂菌株C-7可提高隐秘小环藻的生物量,但并未显著改变小环藻的脂质含量㊂C r o f t等发现,H a l o m o n a s s p.可吸收利用藻类分泌的D O C,产生维生素B12促进微藻生长[38]㊂A m i n等[39]发现M a r i n i b a c t e r i u m s p.释放弧菌铁蛋白螯合F e3+供微藻利用,同时微藻产生D O C支持细菌生长㊂本研究结果显示,藻菌共培养体系中的D O C浓度始终低于无菌纯培养对照组㊂D I C浓度始终高于无菌纯培养对照组㊂这说明藻菌之间的碳交换可能发挥了重要作用[9]㊂微藻释放的D O C被细菌降解利用,同时,由于藻类向细菌提供了固定碳,细菌大量繁殖,代谢活动产生的D I C含量升高,增强了微藻光合作用的无机碳供应,从而促进了微藻的生长㊂胞外聚合物(E P S)在藻际环境中具有重要的生态功能,可影响藻菌共生关系的建立以及调节藻际微生物群落组成等[40-42]㊂藻际环境中的E P S可分为上清E P S和细胞结合态E P S,这两部分E P S均主要由多糖和蛋白组成㊂本研究中,与无菌纯培养对照组相比,藻菌共培养体系中上清多糖与上清蛋白的浓度均有所降低,表明细菌可能利用这部分E P S作为碳与能量的来源,降低了上清E P S的积累速率㊂B r u c k n e r等[43]研究发现,拟杆菌-32可大幅降低上清多糖含量并增加结合多糖水平,上清多糖的减少可能是由于细菌的直接消耗,或通过减少上清多糖,而优先形成结合多糖来增加细菌在藻细胞上的附着,以此加强两者之间的相互作用㊂本研究中,菌株C-1和C-7共培养体系的结合蛋白浓度显著高于对照组,尤其是在培养第4天达18.1~ 18.8m g/L,比对照组提高了60%左右,而结合多糖的含量在培养前期高于对照组,第4天后较对照组有所降低㊂这说明在共培养前期,藻类可能通过分泌的较高水平的结合多糖吸引细菌在藻细胞表面附着[44],培养后期通过降低结合多糖的含量,增加结合蛋白浓度,增强细菌与微藻之间的紧密连接[45],以促进二者之间的相互作用,维持共生系统的稳定性㊂4结语本研究从隐秘小环藻藻液中分离纯化出8株可培434期刘雨,等:隐秘小环藻藻际细菌分离鉴定及其对藻细胞生长的影响养细菌,经16S r D N A序列比对分析,8株可培养细菌分别是E r y t h r o b a c t e r s p.(C-1)㊁S t a p h y l o c o c c u s s p. (C-2和C-3)㊁H a l o m o n a s s p.(C-4)㊁M u r i c a u d a s p. (C-5)㊁C e l l u l o m o n a s s p.(C-6)㊁M a r i n i b a c t e r i u m s p. (C-7)和B a c i l l u s s p.(C-8),其中菌株C-1和C-7为促生菌㊂这2株促生菌分别与隐秘小环藻构建藻菌共培养体系,均可显著提高微藻的生物量和脂质产率㊂菌株C-1和C-7可吸收利用隐秘小环藻分泌的D O C,同时释放D I C㊂同时,细菌对共培养体系中不同种类的E P S影响不同,这反映出隐秘小环藻与细菌之间的相互作用关系㊂本研究结果为探究藻菌互作和微藻的规模化养殖提供了一条新策略㊂参考文献:[1]S h a r i f a h E N,E g u c h i M.T h e P h y t o p l a n k t o n N a n n o c h l o r o p s i s o c-u l a t a e n h a n c e s t h e a b i l i t y o f R o s e o b a c t e r c l a d e b a c t e r i a t o i n h i b i t t h e g r o w t h o f f i s h p a t h o g e n V i b r i o a n g u i l l a r u m[J].P L o S O n e, 2013,6(10):e26756.[2] K u o R C,L i n S.E c t o b i o t i c a n d e n d o b i o t i c b a c t e r i a a s s o c i a t e d w i t hE u t r e p t i e l l a s p.i s o l a t e d f r o m L o n g I s l a n d S o u n d[J].P r o t i s t,2013,164(1):60-74.[3] K a z a m i a E,C z e s n i c k H,N g u y e n T,e t a l.M u t u a l i s t i c i n t e r a c t i o n sb e t w e e n v i t a m i n B12-d e p e n d e n t a l g a e a n d h e t e r o t r o p h ic b a c t e r i a e x-h i b i t 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菌与藻或蓝细胞共生ppt课件
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3．互惠共生
• 在两种以上不同生物联合中各方不同程度地从中受益。 真菌与其他生物体的共生情况有以下几种。
（1）虫菌共生
• 主要有这些菌类：与食木甲虫共生真菌；与食木黄蜂共 生真菌；与蚁类共生真菌；与介壳虫共生真菌和与其他 昆虫营内共生的真菌。
（2）菌根共生 • 可分为外生菌根和内生菌根。 （3）菌与藻或蓝细胞共生
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一、地衣共生生理学
（一）共生的基本概念 共生是两个不同有机体的密切的生物学的联合。
1．相克共生（寄生）：是一方受益，另一方受害
的共生联合，即一般所理解的寄生。 • 地衣学家Schwendener曾指出在地衣中真菌寄生物
征服了藻类，而且描述了菌藻共生的条件。但是 地衣菌体长期的稳定性，说明两者并非简单的相 克共生。把培养的真菌与非其共生藻相结合，则 藻几乎总是被寄生和破坏。
• 当共生藻以静孢子繁殖并被共生菌丝所分开时，前地衣 体便开始逐渐增大，并形成假皮层。藻细胞在假皮层排 列成层，这便是初生地衣体阶段。
• 接着便是髓层、下皮层以及假根的出现。在进行营养生 长之后，地衣的子实体便开始形成。
地衣为多年生菌物，它的生长速度却是相当的缓慢。
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• 地衣菌藻共生这一生态系统中的生产者是藻类 或蓝细菌，消费者是真菌，其内部能量流动导 致形成稳定的营养结构及其与环境之间的物质 交换。
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四、地衣的营养
（一）地衣的营养生理 1．碳素营养 2．氮素营养 3．水分关系 4．矿质元素
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（二）地衣的生理研究探讨
1．光合作用 （1）光合作用的速率
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利用CAZyme数据库对PR1的多糖水解酶进行进一步分析,发现其 具有完整的木聚糖,琼脂,几丁质,淀粉,甘露聚糖降解酶系。使 用KEGG数据库对PR1的木聚糖代谢途径进行分析绘制,并通过转 录组验证了PR1有关木聚糖的代谢通路。
2)以木聚糖为碳源,研究了PR1与小球藻、莱茵衣藻、斜生栅藻 和杜氏盐藻的共培养效果。发现培养9天后,4株微藻的生物量在 共培养时为无外加碳源纯培养时的1.9-3倍;小球藻、莱茵衣藻、 斜生栅藻共培养与在葡萄糖中纯培养相比,其生物量相当,而中 性油脂含量提高20%-75%;杜氏盐藻共培养与在葡萄糖中纯培养 相比,其生物量提高60%。
本课题构建了纤维弧菌Cellvibrio pealriver PR1与微藻的共 培养体系,将半纤维素的降解利用与促进小球藻的生长相结合。 利用比较转录组学、比较代谢组学等手段对共培养促进藻细胞 生长的机理进行探讨,并对共培养体系产藻细胞及产油脂进行了 优化。
本研究内容包含如下几个方面:1)对细菌PR1进行生理生化、分 子生物学鉴定,确定该菌属于纤维弧菌属。对该菌进行全基因组 测序,发现PR1基因组大小为4.4Mbp,基因数目为3730个。
共培养条件下,4株微藻淀粉的积累量均得到显著提升。以半纤 维素为碳源时,菌藻共培养体系也可以达到促进微藻生长的效果, 其促进效果与木聚糖为碳源时的共培养效果相当。
3)利用比较转录组学和比较代谢组学对共培养促进小球藻生长 机制进行了研究。基于基因差异表达及差异基因代谢通路的分 析,推测共培养促进小球藻生长的主要原因是PR1为小球藻的生 长提供了有机碳源;除此之外,还发现共培养可以通过为小球藻 提供无机碳源CO2、促进小球藻叶酸的合成,促进小球藻DNA、氨 基酸、叶绿素的合成、通过降低其抗光氧化压力而减少类胡萝 卜素的消耗等方式促进小球藻生长。
4)通过Plackett-Burman因子筛选、显著因子单因素实验和响应 面中心组合设计对共培养体系进行了优化。优化后叶绿素含量 (11.94 mg/L)相比优化前(5.63 mg/L)提高112%,比小球藻在BG11纯培养(2.53 mg/L)提高372%。
对共培养产油脂体系进行优化,N限制时,200mg/L NaNO3时小球 藻油脂积累量最大,达到192.63mg/L,相比于小球藻在BG-11Xylan中共培养(87.23 mg/L)提高120.82%,相比于小球藻在BG11中纯培养(49.54 mg/L)提高288.83%。P限制时,8mg/L K2HPO4 时小球藻油脂积累量最大,达到116.23mg/L,相比于小球藻在BG11-Xylan中共培养(81.00 mg/L)提高43.49%,相比于小球藻在 BG-11中纯培养(48.46mg/L)提高139.85%。
菌藻共培养促进微藻生长的研究及其 相互作用机制探索
随着化石能源Biblioteka 日渐枯竭,寻求一种新型可再生能源已是大势所 趋。微藻由于其生长快、油脂含量高、适应性强等优点,成为生 产生物柴油最有潜力的物种。
微藻除了可以生产生物柴油外,还可以生产藻多糖、藻蛋白、不 饱和脂肪酸等高附加值的产品,有着广阔的应用前景。目前制约 微藻工业化应用的主要原因是生产成本太高,而降低成本一个有 效的手段就是提高微藻的生长速度。