第7章RNAtranscription
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分子生物学 第7章 RNA复制与逆转录ppt课件
精选ppt课件2021
19
tRNA
R U5 PB
gag
R′ U′5
R U5 PB
gag
R′ U′5
PB
gag
负链 DNA
An
pol
env
U3 R
以 tRNA 为引物开始合成 cDNA 负链
pol
env
U3 R An
RNase H 降解模板 R 和 U5
An
pol
env
U3 R
负链 DNA3′端与模板 R 区配对（第一次跳跃）
精选ppt课件2021
11
7.2.1 RNA复制酶类
由病毒自己编码的RNA复制酶主要是依赖RNA的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）。
RNA复制酶功能与特性： ⑴ 以“–RNA”为模板合成“+RNA”活性高，而以“+RNA” 为模板合成“–RNA”活性低； ⑵ 合成RNA链方向为5′→3′； ⑶ 能将互补的双链RNA分开； ⑷ 缺少核酸酶活性，校正功能低，差错率高； ⑸ 多数分布在细胞质中，少数在细胞核中； ⑹ 酶活性具有可调控性，复制时，RdRP抑制外壳蛋白表达， 而成熟期，外壳蛋白抑制RdRP活性。
这类病毒包括滤泡性口腔炎病毒、流感病毒、
副流感病毒、莴苣坏死黄化病毒、麻疹病毒、狂犬病毒
等。
脱壳
病毒
RdRP
加工
亲代 –RNA
+RNA ① RdRP
子代
mRNA ② 翻译
–RNA
GpppN GpppN
帽子 mRNA
③ 翻译
子代病毒颗粒 组装
RNA 复制酶 病毒外壳蛋白 致病蛋白
生物化学：第七章 核酸的生物合成
第七章核酸的生物合成（一）DNA的生物合成1. DNA的生物合成：指以亲代DNA的两条链为模板，以4种脱氧核苷三磷酸为底物，在DNA 聚合酶催化下进行的脱氧核苷酸聚合反应。
基因（顺反子）:泛指被转录的一个DNA片段。
在某些情况下，基因常用来指编码一个功能蛋白或DNA分子的DNA片段。
2.复制 (Replication)：以亲代DNA分子的双链为模板，按照碱基配对的原则，合成出与亲代DNA分子相同的双链DNA的过程。
3.转录(Transcription)：以DNA分子中一条链的部分片段为模板，按照碱基配对原则，合成出一条与模板DNA链互补的RNA分子的过程。
4.翻译(Translation)：把mRNA上的遗传信息按照遗传密码转换成蛋白质中特定的氨基酸序列的过程。
5.半保留复制：双链DNA 的复制方式，其中亲代链分离，每一子代DNA 分子由一条亲代链和一条新合成的链组成。
基因组中能独立进行复制的单位叫复制子。
6．DNA聚合酶反应的特点：以四种脱氧核苷三磷酸为底物；反应需要接受模板的指导；反应要有引物3’-OH的存在；需Mg2+激活；DNA链的生长方向为5’→3’；产物与模板的性质相同。
7. DNA聚合酶：DNA聚合酶I主要负责RNA引物的切除和校对；DNA聚合酶II主要负责修复；DNA聚合酶III主要负责复制。
8.DNA复制体：蛋白质和酶合理、精巧地分布在复制叉上，既可解离聚合，又彼此协调，形成一个高效、高精度复制的完整实体复合物。
包括解螺旋酶、单链结合蛋白(SSB)、拓扑异构酶、引发体、连接酶等。
9.复制叉：复制DNA 分子的Y 形区域,在此区域发生链的分离及新链的合成。
10.原核生物DNA的复制复制的启动：原核生物的DNA上一般只有一个复制原点，真核生物则有多个复制原点，可以同时启动复制过程。
DNA链的延伸：DNA链的延伸按5'→3'方向。
一条链延伸的方向与复制叉前进的方向一致，它的合成能连续进行，称为先导链；另一条链延伸的方向与复制叉前进的方向相反，这条新链的合成是不连续的，而且总晚于先导链，所以称为后随链。
7章原核生物基因表达调控部分课件
4、cAMP-CRP是一个不同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的 功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。
（一）CAP的正调控
（二）协调调节
--CAP的正调控与Lac负调控的共同调节
（二）协调调节 --CAP的正调控与Lac负调控的共同调节
（二）协调调节
--CAP的正调控与Lac负调控的共同调节
β-半乳糖苷酶：透过酶：乙酰基转移酶= 1 ：0.5 ：0.2 Lac基因产物的量在翻译水平上受到调控： （1）lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而 终止蛋白质链的翻译； （2）在 lac mRNA分子内部，A基因比Z基因更容易受内 切酶作用发生降解。
2.色氨酸操纵子与负控阻遏系统
三、转录后水平上的调控（post-transcriptional regulation)
mRNA加工成熟水平上的调控（differential processing of RNA
transcript）
四、翻译水平上的调控（differential translation of mRNA )
在个体生长的全过程，某种基因产物在个体中按不同组织 空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性。基因表达伴 随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器 官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性 (cell or tissue specificity)。
第二节 原核基因表达调控机制
正控诱导系统
正控阻遏系统
2、负转录调控
调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录
的作用。根据其作用特征又可分为负控诱导系统和负控阻遏系统。
负控诱导系统
负控阻遏系统
第三节 乳糖操纵子(lac operon)
（一）CAP的正调控
（二）协调调节
--CAP的正调控与Lac负调控的共同调节
（二）协调调节 --CAP的正调控与Lac负调控的共同调节
（二）协调调节
--CAP的正调控与Lac负调控的共同调节
β-半乳糖苷酶：透过酶：乙酰基转移酶= 1 ：0.5 ：0.2 Lac基因产物的量在翻译水平上受到调控： （1）lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而 终止蛋白质链的翻译； （2）在 lac mRNA分子内部，A基因比Z基因更容易受内 切酶作用发生降解。
2.色氨酸操纵子与负控阻遏系统
三、转录后水平上的调控（post-transcriptional regulation)
mRNA加工成熟水平上的调控（differential processing of RNA
transcript）
四、翻译水平上的调控（differential translation of mRNA )
在个体生长的全过程，某种基因产物在个体中按不同组织 空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性。基因表达伴 随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器 官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性 (cell or tissue specificity)。
第二节 原核基因表达调控机制
正控诱导系统
正控阻遏系统
2、负转录调控
调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录
的作用。根据其作用特征又可分为负控诱导系统和负控阻遏系统。
负控诱导系统
负控阻遏系统
第三节 乳糖操纵子(lac operon)
第7章 RNA的生物合成
原核生物 RNA 聚合酶的特征
Ø 不同种细菌中核心酶大小比较恒定，因子变化 较大。
Ø 不同的因子识别不同的启动子，而使不同的基 因得以表达；
Ø 细菌中的三种RNA由同一种RNA聚合酶转录。 Ø 噬菌体RNA聚合酶为单一多肽链，比较简单。
原核生物 RNA 聚合酶的抑制剂
Ø 可以被 利福霉素（rifamycin）抑制； Ø 利福霉素是从 链霉菌（streptomyces） 中分离得
1、转录起点
上游
下游
• RNA链上掺入的第一个核苷酸通常是嘌呤： ATP or GTP；因此新生RNA的5’端通常为 pppA or pppG；
2、转录起始
• 1980年以前，普遍认为转录起始是指第一 个磷酸二酯键的形成；
• 后来发现实际情况要复杂得多：起始阶段包 括RNA聚合酶对DNA模板特定位置的识别、 结合，DNA双链的局部解螺旋，以及最初几 个磷酸二酯键的形成。
真核生物RNA聚合酶的结构特征
Ø 结构更复杂，多亚基； Ø 三种RNA pol结构上有相似之处：都含有2
个大亚基及其它小亚基； Ø 有类似α、β、β’ 、ω的亚基，并且有明显
的进化渊源； Ø 没有类似σ的亚基； Ø 有些亚基是三种酶共有的；
酵母RNA 聚合酶 II的亚基组成
亚基
大小(kD) 功能
启动子结构的确定
Ø 遗传学方法 碱基序列突变 同源性比对
Ø 生物化学方法 DNase I footprinting (足迹法) EMSA (electrophoretic mobility shift assay)
DNA酶足迹法
硫酸二甲酯（DMS）足迹法
EMSA
原核生物的启动子结构
David Pribnow分析了E.coli和噬菌体的多个启动子：
第七章 RNA转录
转录特点
• 1）基因的转录是局部转录, 基因的转录是局部转录, • 2）RNA的合成（基因转录)是不对称转录 RNA的合成 基因转录) 的合成（
• 转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链 转录的不对称性： RNA的合成中，DNA的二条链 的合成中 中仅有一条链可作为转录的模板， 中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不 对称性。 对称性。
大肠杆菌中部分启动子上的一致顺序
启动子结构
• -35区：RNA聚合酶识别位点，该序列提供了RNA 35区 RNA聚合酶识别位点 该序列提供了RNA 聚合酶识别位点， 聚合酶识别的信号。 聚合酶识别的信号。 • -10区：RNA聚合酶牢固结合位点，此处AT含量多， 10区 RNA聚合酶牢固结合位点 此处AT含量多， 聚合酶牢固结合位点， AT含量多 有助于DNA局部双链解开。 DNA局部双链解开 有助于DNA局部双链解开。
模板链与非模板链
3．转录酶。 转录酶。 原核细胞的酶分布在胞液，转录在胞液中进行， 原核细胞的酶分布在胞液，转录在胞液中进行，真核细 胞的酶存在于胞核，反应在胞核中进行，转录完后， 胞的酶存在于胞核，反应在胞核中进行，转录完后，再 进入胞液。 进入胞液。
反应式： 反应式： n1ATP DNA指导的 指导的RNA聚合酶 指导的 聚合酶 n2GTP RNA前体 前体 n3CTP DNA、 Mg2+、Mn + 、 n4UTP (n1+n2+n3+n4）PPi •
终止子结构
不依赖Rho因子的转录终止 不依赖Rho因子的转录终止
（五）RNA的转录过程 RNA的转录过程
RNA的转录过程 以大肠杆菌为例） RNA的转录过程：（以大肠杆菌为例）
• • • • 起始位点的识别 转录起始(Initiation) 转录起始(Initiation) 链的延伸(Elongation) 链的延伸(Elongation) 转录终止(Termination) 转录终止(Termination)
第7章 PartⅠ RNA的转录
1.3 细菌的转录过程
1.3 细菌的转录过程 1. 转录的起始
2. RNA链的延伸
3. 转录的终止
1.3.1 转录的起始
1.封闭型转录起始复合物的形成：首先由σ因子辨认启动子 的–35区(识别位点)，全酶与该区结合，形成疏松的复合物， 此时DNA双链未解开，因而称为封闭型转录起始复合物，
2.开放型转录起始复合物的形成：继而RNA聚合酶移向–10 区及转录起始点，在–20区处DNA发生局部解链，形成12～ 17bp的单链区，RNA聚合酶与DNA结合更紧密，形成开放 型转录起始复合物。 3.起始延伸复合物的形成：以单链的模板链为模板，RNA 聚合酶上的起始位点和延伸位点被相应的NTP占据，聚合 酶的β亚基催化第一个磷酸二酯键的生成，σ亚基从全酶解 离，形成DNA-RNA聚合酶（核心酶）结合在一起的起始延 伸复合物 。
第7章 RNA的转录与转录后加 工
PartⅠ RNA的转录
复制
转录
RNA复制
RNA
反转录 翻译
DNA
蛋白质
中心法则
除了某些RNA病毒之外，所有RNA分 子都来自于DNA。基因组DNA通过 一个被称为转录的过程把贮存在双链 DNA分子中的遗传信息转换到与模板 DNA链相互补的RNA单链上。
在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为 模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传 信息传递给RNA的过程称为转录。
1.3.2. RNA链的延伸
1.σ因子解离：原核生物RNA聚合酶催化转录起始，即核苷酸链中的第一个 磷酸二酯键形成后，σ因子从全酶中解离出来，核心酶就能沿DNA分子移 动。 2. 5’→ 3’：转录起始复合物中，核苷酸之间第一个磷酸二酯键的形成是由 第一个核苷酸的3’-OH与第二个核苷酸的5’-磷酸之间脱水而成。第一个核 苷酸常为G，来自GTP的5’-三磷酸仍保留，第二个核苷酸的3’-OH仍然游 离形成5’pppGpN-OH3’。在聚合酶沿模板链的3’→5’移动时，可按模板链 碱基序列的指引，相应NTP上的α -磷酸可与延长新链的3’-OH相继形成磷 酸二酯键，其β 、γ 磷酸基脱落生成焦磷酸后迅速水解，释放的能量进一 步推动转录，使新合成的RNA链沿着5’→ 3’方向逐步延长。
第七章：RNA转录后加工
SR蛋白因它们的C端结构域有一个富含Ser（S）和Arg（R） 的区域而得名。SR蛋白结合到外显子中外显子剪接增强子 （exonic splicing enhancer, ESE）。与ESE位点结合的SR 蛋白将U2AF蛋白引导到3’剪接位点，并将U1 snRNP引导到5’ 剪接位点，这是剪接过程的一个关键步骤，该步骤决定着哪些 位点将被连接起来。
CPSF和CstF结合位置处于切割与多聚腺苷酸化位点两侧，它 们为切割因子、Poly A聚合酶以及Poly A结合蛋白的组装提供 了平台。一旦聚腺苷酸化复合体组装完成，由切割因子I和切 割因子II构成的内切核酸酶对RNA进行切割， 切割位点就位于 5’-CA-3’二核苷酸的后面。Poly A聚合酶（Poly A polymerase） 在新生的3’末端添加多聚A尾巴。Poly A结合蛋白与多聚A尾 巴结合。
（3）作为进出细胞核的识别标记 凡由RNA聚合酶II转录的 RNA均在5’端加帽，包括snRNA，这是RNA分子进出细胞核 的识别标记。U6 snRNA 由RNA聚合酶III转录，其5’端保留3 个磷酸基团，无帽子结构，因而不能输出细胞核。 （4）提高mRNA的剪接效率 5’帽结合蛋白涉及第一个内含子 剪接复合物的形成，直接影响mRNA的剪接效率。
哺乳动物肌钙蛋白T基因初级转录产物具有5个外显子。该 pre-mRNA可以通过两种途径进行剪接，产生两种不同的 mRNA。一种mRNA含有外显子1、2、3和外显子5，编码 α肌钙蛋白T，另一种mRNA含有外显子1、2、4和外显子5， 编码β肌钙蛋白T。
SV40病毒的T抗原基因初级转录产物通过选择性剪接，产生两
7－甲基鸟嘌呤结构称为0型帽子（type 0 cap）， 是酵母中最常见的形式。在高等真核生物中5’端还 会发生更多的修饰。在转录产物的第一个核苷酸核 糖的2’－OH被甲基化，形成I型帽子。脊椎动物转 录产物的第二个核苷酸核糖的2’－OH也被甲基化， 则形成II型帽子。
RNA转录(Transcription)
复制与转录的比较： 复制与转录的比较： 相同： 要有模板， 新链延伸方向5’ 相同：①要有模板， ②新链延伸方向 ’ 3’， ’
③碱基的加入严格遵循碱基配对原则。 碱基的加入严格遵循碱基配对原则。 相异： 复制需要引物，转录不需引物。 相异：①复制需要引物，转录不需引物。 ②转录时，模板DNA的信息全保留 转录时，模板 的信息全保留 复制时模板信息是半保留。 复制时模板信息是半保留。 聚合酶只有5’ ③转录时，RNA聚合酶只有 ’ 转录时， 聚合酶只有 聚合作用， 聚合作用，无5’ ’ 外切活性。 外切活性。 3’及3’ ’ ’ 3’ ’ 5’ ’
图ห้องสมุดไป่ตู้转录过程
三、启动子和转录因子 启动子（ 聚合酶识别、 启动子（promoter）：RNA聚合酶识别、结合并 ） 聚合酶识别 开始转录所必需的一段DNA序列。 序列。 开始转录所必需的一段 序列 转录因子： 聚合酶在进行转录时， 转录因子：RNA聚合酶在进行转录时，常需要一 聚合酶在进行转录时 些辅助因子（蛋白质）参与作用， 些辅助因子（蛋白质）参与作用，此类蛋白质 称为转录因子。 称为转录因子。 足迹法和DNA测序法确定启动子的序列结构。 测序法确定启动子的序列结构。 足迹法和 测序法确定启动子的序列结构 （图）
图：足迹法和DNA测序法确定启动子的序列结构 足迹法和 测序法确定启动子的序列结构
1. 原核启动子结构与功能 分析比较上百种启动子序列， 分析比较上百种启动子序列，发现不同的启动 子都存在保导的共同序列，包括 子都存在保导的共同序列，包括RNA聚合酶识别 聚合酶识别 位点和结合位点。 位点和结合位点。 （1）-10序列（Pribnow框） 序列（ ） 序列 框 在转录起点上游约-10处 有一个 在转录起点上游约 处，有一个6bp的保守序 的保守序 列TATAAT，称Pribnow框。此段序列出现在 ， 框 -4到-13bp之间，每个位点的保守性在 到 之间， 之间 每个位点的保守性在45%-100%。 。
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• 生活方式多变的物种体内σ的种类多。 • 大肠杆菌利用不同的σ适应环境的变化。 • σ和真核细胞中的基因特异转录因子的功
能有些类似。
σ 因子不同区段结合启动子不同区域
区段4 识别 -35 element 区段2 识别 -10 element 区段3 识别–10 element上游延伸段
σ因子能促进RNA聚合酶与启动子的结合
➢新生RNA链与模板链形成只有几个碱基的杂交 双链。
影响新生链延伸速度的因素
① RNApol的来源 如E.coli的RNApol转录T7 的速度为17nt/s， 而其它细菌的聚合酶为12~19nt/s左右； ②模板链的特殊序列 新生链延伸速度并非恒定，虽然RNApol对 DNA模板上的4种碱基都等效渗入，但当遇到 模板特殊序列时，转录速度会下降到<0.1 nt/s， 这种序列称为暂停信号。暂停状态的模板链 大多富集G-C或反向重复，后者能使产物形 成茎环，阻止了RNA-DNA杂合链的部分结构， 影响聚合酶前移。
录产物因为有潜在碱基配对的
序列特点，形成发夹结构，导
致聚合酶暂停延伸，使ρ因子 追上了转录泡（ρ因子牵制住 酶，转录即终止）
ρ因子解旋活性使转录产物RNA 从DNA模板释放。
➢抗终止作用
【通读】个别终止子作用可被特异因子阻止， 使酶越过终止子继续转录，称通读 (read
through)。
引起抗终止作用的蛋白称抗终止因子(antitermination-factor)。
➢从转录起始到延伸的结构变化
1. RNA的5’端脱离模板链 2. RNAP 释放因子，与模板结合较为松弛。 3. RNAP沿着模板以类似于蠕虫屈伸向前运动的方式。 35nt 收缩 28nt 突然前伸 35nt
➢转录泡：转录位点13个碱基对的解链区域， 一个动态、短暂的解链结构。
➢转录过程需要拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ。
7.1.2 原核和真核生物转录差异
RNA聚合酶的差异 转录产物的差异 真核生物转录产物的加工 原核生物转录产物mRNA为单顺反子，真核生物的
mRNA大多是单顺反子。
7.2 启动子的结构与功能
7.2.1 原核生物启动子结构
启动子指DNA分子上被RNA聚合酶所识别 并结合形成转录起始复合物的区域。
原核启动子的其他组成部分和功能 rrnB P1基因启动子结构
E.coli 细胞含有7个编码rRNA的基因，当快速生长需 要大量rRNA时，这7个基因在细胞内自身可完成大 量的转录。
驱动这些基因转录的启动子显然很强大，原因是启 动子上游元件在发挥作用。
➢核心启动子上游– 40~ –60处有一个UP元件，它能被 RNApolα亚基CTD识别，仅在RNApol存在情况下就 能将rrnB Pl基因的转录效率提高30倍，因此认为UP 元件也是一个启动子元件。
即α2ββ’σω。
β’
图 12-5 E.coli RNA 聚合酶的亚基组成
与酶复合体组装相关
RNAP 的蟹钳“Crab claw”构象
a a
w
b’
活性中心裂缝
b
RNA聚合酶全酶的功能
识别并结合DNA链上的启动子 能沿DNA链蠕动并解开DNA双螺旋，转录后使双
螺旋恢复
能同时与局部链分离的DNA及转录产物RNA链结 合
DNA解旋十分重要；3）使RNA pol定向转录。
-35序列又称Sextama box
保守序列： T82T84G78A65C54A45 功能: RNA pol 识别位点
-35和-10序列间距离保持稳定，范围在15-20bp,
是RNApol结构的要求，有利与酶的结合。17bp时转 录效率最高。
ρ因子是RNA聚合酶辅因子 ，有ATPase活性，
每个ρ结合12bp，其六聚体结合72bp。亚基 有RNA结合结构域和ATPase结构域。
ρ因子怎样终止转录反应？ 【追赶模型】
ρ因子先结合于终止子上游新生
RNA链5‘端ρ装载位点。然后，
利用ATPase活性供能，沿 RNA链向转录泡方向前移，其 运动速度比聚合酶沿DNA模板 运动快。当到达终止子区，转
➢转录过程的终止——依赖Rho因子的终止子
倒向重复→茎环结构; 但是没有共同序列，不富含G-C对，没有 一连串的Ts.终止效率与茎环结构的稳定性相关。
Rho 为一个环状, 六聚体蛋白，具有ATPase活性和RNA-DNA 解螺旋酶活性
ρ因子依赖型终止子结构中，茎环结构稳定 性和终止效率的关系
茎环结构越稳定；终止效率越高.
7）转录起点定位 转录起始由DNA分子上的启动子 (Promoter,P)控制。
P一般靠近转录起点（即DNA实际转录RNA 的第一个碱基），这个位点核苷酸编号“+1” 从转录起点沿聚合酶方向称下游，
nt 编号依次为+2 ,+3......，而相反方向为 上游， nt 编号依次为-1,-2……。
一般DNA的序列从左向右书写，用编码链的 序列代表基因，因为它与RNA链序列相同。
第7章 RNA转录
7.1 RNA 转录概述
7.1.1 转录的一般特点
转录的选择性 转录有特点起点和终点，即转录单位 RNA pol 不对称转录 启动子 底物 NTPs 延伸方向5’-3’
【几个概念】 1) 转录不对称 【用枯草杆菌中的SP8噬 菌体为材料实验证明】
2) 模板链 作为模板的DNA单链称模板链或反义链 （antisense strand）（DNA极性与RNA相反）
是控制转录起始的序列，决定基因转录的 起始位点和表达强度等。
原核启动子的发现和证实
Footprinting(足迹) technique验证核心启动子
RNA聚合酶（没有NTP) DNaseⅠ 消化
分离
+
测序
原核生物基因核心启动子
-10区为Pribnow box
保守序列：T80A95T45A60A50T96 功能: 1) RNA pol紧密结合位点;2) -10区序列对于
➢rrnB Pl基因启动子还与–60与–150之间的3个Fis位点 有关，是转录激活蛋白Fis的结合位点。
➢这些位点本身不与RNA聚合酶结合，是非典型启动 子元件，而属于增强子的转录激活DNA元件。
7.3 细菌的RNA聚合酶
7.3.1 RNA 聚合酶概述
RNA聚合酶系统为一种动态的功能性装置， 其结构组成及催化活性在转录过程中始终 处于变化之中
5）复合转录单位： 所转录的RNA经剪接能形成几种成熟的mRNA，得到 不同翻译产物的mRNA区段，或几种不同的RNA, 如 rRNA和tRNA来自同一条RNA前体。 6）转录效率： 转录单位时间内所合成的RNA分子中nt数目 例：T7的转录效率为100-200nt/秒；
原核生物平均20-25nt/秒； 真核细胞45-100nt/秒； ➢ 可见转录效率差异较大。
σ亚基能识别并引导RNApol稳定结合到启动子上， 能使核心酶对特异序列的亲和力加强，对非特异序 列的亲和力降低。
全酶的核心酶不能区分DNA启动子和一般序列，核 心酶与DNA的结合常数约为109(mol/L)-1，停留的半 衰期约60 min，但当σ因子与核心酶结合后，与 DNA一般序列的结合常数下降为105，半衰期小于 1s，而与DNA启动子序列的结合常数达到1012，半 衰期为数小时，二者的结合常数相差约107。
③预警子的干扰
离体实验发现， ppGpp（预警子）影响转录 延伸速度，但与底物NTP的渗入之间无竞争 现象，说明底物NTP与ppGpp在酶分子上结 合部位不同。
大肠杆菌nusA蛋白也有调节延伸速度的功能 。
转录过程的终止
概念
提供停止信号的DNA序列称终止子 （terminator）
种类
两种类型： ① 内在终止子——强终止子 ② 依赖ρ因子的终止子——弱终止子
按DNA链的模板序列选择正确的底物，以正确方 向合成
识别转录终止信号
能与转录因子相互作用以调节转录速度
在转录阻遏情况下，能自身调整恢复和维持RNA 合成
7.3.3 σ因子
σ 因子的种类
• σ70是大肠杆菌细胞中最丰富的一类σ因子， 参与大肠杆菌大多数基因的转录。
• 在不同细菌细胞中， σ的种类变化很大， 从只有一种到60几种。
晚早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止因子，它 能使晚期基因得到表达。
转录起始位点附近序列影响转录起始效率。
原核生物启动子的突变效应
强启动子和弱启动子：区别在于和启动
子序列与标准启动子序列同源性程度的大 小。
上升突变与下降突变：如突变后序列偏
离标准序列，启动子效率下降，为下降突 变，反之突变后启动子序列更接近标准序 列，启动子效率增强，为上升突变。 下将突变通常是A:T碱基对突变为G:C碱基 对，使稳定性增强；也有A:T变为T:A，改 变碱基堆积力，或改变RNA聚合酶的结合 能力。
识别转录起点在内 的23bp的启动子结构 高活性，不受调控，常用于原核细胞基因
是体外表达系统
7.3.7 原核生物RNA的转录过程
➢起始
1.封闭复合物 2.开放复合物 3.启动子清空
1.全酶与模板DNA接触，生成非专一不稳定的复合 物在模板上移动；
2.起始识别：全酶先与－35序列结合，产生封闭的 酶-启动子二元复合物；
抗终止作用机制
抗终止作用主要见于某些噬菌体的时序控制。
早期基因与后期基因之间以终止子隔开，抗终止实 验：发现它能贯通后期基因的表达，即后期基因的 表达是RNA链的延续。
λ噬菌体前早期基因产物N蛋白是一种抗终止因子。 它与RNApol作用使其在终止子处发生通读(read through)，表达晚早期基因。
即σ因子减少全酶与非启动子序列的非特异性结合 而增加与启动子序列的特异性结合。
能有些类似。
σ 因子不同区段结合启动子不同区域
区段4 识别 -35 element 区段2 识别 -10 element 区段3 识别–10 element上游延伸段
σ因子能促进RNA聚合酶与启动子的结合
➢新生RNA链与模板链形成只有几个碱基的杂交 双链。
影响新生链延伸速度的因素
① RNApol的来源 如E.coli的RNApol转录T7 的速度为17nt/s， 而其它细菌的聚合酶为12~19nt/s左右； ②模板链的特殊序列 新生链延伸速度并非恒定，虽然RNApol对 DNA模板上的4种碱基都等效渗入，但当遇到 模板特殊序列时，转录速度会下降到<0.1 nt/s， 这种序列称为暂停信号。暂停状态的模板链 大多富集G-C或反向重复，后者能使产物形 成茎环，阻止了RNA-DNA杂合链的部分结构， 影响聚合酶前移。
录产物因为有潜在碱基配对的
序列特点，形成发夹结构，导
致聚合酶暂停延伸，使ρ因子 追上了转录泡（ρ因子牵制住 酶，转录即终止）
ρ因子解旋活性使转录产物RNA 从DNA模板释放。
➢抗终止作用
【通读】个别终止子作用可被特异因子阻止， 使酶越过终止子继续转录，称通读 (read
through)。
引起抗终止作用的蛋白称抗终止因子(antitermination-factor)。
➢从转录起始到延伸的结构变化
1. RNA的5’端脱离模板链 2. RNAP 释放因子，与模板结合较为松弛。 3. RNAP沿着模板以类似于蠕虫屈伸向前运动的方式。 35nt 收缩 28nt 突然前伸 35nt
➢转录泡：转录位点13个碱基对的解链区域， 一个动态、短暂的解链结构。
➢转录过程需要拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ。
7.1.2 原核和真核生物转录差异
RNA聚合酶的差异 转录产物的差异 真核生物转录产物的加工 原核生物转录产物mRNA为单顺反子，真核生物的
mRNA大多是单顺反子。
7.2 启动子的结构与功能
7.2.1 原核生物启动子结构
启动子指DNA分子上被RNA聚合酶所识别 并结合形成转录起始复合物的区域。
原核启动子的其他组成部分和功能 rrnB P1基因启动子结构
E.coli 细胞含有7个编码rRNA的基因，当快速生长需 要大量rRNA时，这7个基因在细胞内自身可完成大 量的转录。
驱动这些基因转录的启动子显然很强大，原因是启 动子上游元件在发挥作用。
➢核心启动子上游– 40~ –60处有一个UP元件，它能被 RNApolα亚基CTD识别，仅在RNApol存在情况下就 能将rrnB Pl基因的转录效率提高30倍，因此认为UP 元件也是一个启动子元件。
即α2ββ’σω。
β’
图 12-5 E.coli RNA 聚合酶的亚基组成
与酶复合体组装相关
RNAP 的蟹钳“Crab claw”构象
a a
w
b’
活性中心裂缝
b
RNA聚合酶全酶的功能
识别并结合DNA链上的启动子 能沿DNA链蠕动并解开DNA双螺旋，转录后使双
螺旋恢复
能同时与局部链分离的DNA及转录产物RNA链结 合
DNA解旋十分重要；3）使RNA pol定向转录。
-35序列又称Sextama box
保守序列： T82T84G78A65C54A45 功能: RNA pol 识别位点
-35和-10序列间距离保持稳定，范围在15-20bp,
是RNApol结构的要求，有利与酶的结合。17bp时转 录效率最高。
ρ因子是RNA聚合酶辅因子 ，有ATPase活性，
每个ρ结合12bp，其六聚体结合72bp。亚基 有RNA结合结构域和ATPase结构域。
ρ因子怎样终止转录反应？ 【追赶模型】
ρ因子先结合于终止子上游新生
RNA链5‘端ρ装载位点。然后，
利用ATPase活性供能，沿 RNA链向转录泡方向前移，其 运动速度比聚合酶沿DNA模板 运动快。当到达终止子区，转
➢转录过程的终止——依赖Rho因子的终止子
倒向重复→茎环结构; 但是没有共同序列，不富含G-C对，没有 一连串的Ts.终止效率与茎环结构的稳定性相关。
Rho 为一个环状, 六聚体蛋白，具有ATPase活性和RNA-DNA 解螺旋酶活性
ρ因子依赖型终止子结构中，茎环结构稳定 性和终止效率的关系
茎环结构越稳定；终止效率越高.
7）转录起点定位 转录起始由DNA分子上的启动子 (Promoter,P)控制。
P一般靠近转录起点（即DNA实际转录RNA 的第一个碱基），这个位点核苷酸编号“+1” 从转录起点沿聚合酶方向称下游，
nt 编号依次为+2 ,+3......，而相反方向为 上游， nt 编号依次为-1,-2……。
一般DNA的序列从左向右书写，用编码链的 序列代表基因，因为它与RNA链序列相同。
第7章 RNA转录
7.1 RNA 转录概述
7.1.1 转录的一般特点
转录的选择性 转录有特点起点和终点，即转录单位 RNA pol 不对称转录 启动子 底物 NTPs 延伸方向5’-3’
【几个概念】 1) 转录不对称 【用枯草杆菌中的SP8噬 菌体为材料实验证明】
2) 模板链 作为模板的DNA单链称模板链或反义链 （antisense strand）（DNA极性与RNA相反）
是控制转录起始的序列，决定基因转录的 起始位点和表达强度等。
原核启动子的发现和证实
Footprinting(足迹) technique验证核心启动子
RNA聚合酶（没有NTP) DNaseⅠ 消化
分离
+
测序
原核生物基因核心启动子
-10区为Pribnow box
保守序列：T80A95T45A60A50T96 功能: 1) RNA pol紧密结合位点;2) -10区序列对于
➢rrnB Pl基因启动子还与–60与–150之间的3个Fis位点 有关，是转录激活蛋白Fis的结合位点。
➢这些位点本身不与RNA聚合酶结合，是非典型启动 子元件，而属于增强子的转录激活DNA元件。
7.3 细菌的RNA聚合酶
7.3.1 RNA 聚合酶概述
RNA聚合酶系统为一种动态的功能性装置， 其结构组成及催化活性在转录过程中始终 处于变化之中
5）复合转录单位： 所转录的RNA经剪接能形成几种成熟的mRNA，得到 不同翻译产物的mRNA区段，或几种不同的RNA, 如 rRNA和tRNA来自同一条RNA前体。 6）转录效率： 转录单位时间内所合成的RNA分子中nt数目 例：T7的转录效率为100-200nt/秒；
原核生物平均20-25nt/秒； 真核细胞45-100nt/秒； ➢ 可见转录效率差异较大。
σ亚基能识别并引导RNApol稳定结合到启动子上， 能使核心酶对特异序列的亲和力加强，对非特异序 列的亲和力降低。
全酶的核心酶不能区分DNA启动子和一般序列，核 心酶与DNA的结合常数约为109(mol/L)-1，停留的半 衰期约60 min，但当σ因子与核心酶结合后，与 DNA一般序列的结合常数下降为105，半衰期小于 1s，而与DNA启动子序列的结合常数达到1012，半 衰期为数小时，二者的结合常数相差约107。
③预警子的干扰
离体实验发现， ppGpp（预警子）影响转录 延伸速度，但与底物NTP的渗入之间无竞争 现象，说明底物NTP与ppGpp在酶分子上结 合部位不同。
大肠杆菌nusA蛋白也有调节延伸速度的功能 。
转录过程的终止
概念
提供停止信号的DNA序列称终止子 （terminator）
种类
两种类型： ① 内在终止子——强终止子 ② 依赖ρ因子的终止子——弱终止子
按DNA链的模板序列选择正确的底物，以正确方 向合成
识别转录终止信号
能与转录因子相互作用以调节转录速度
在转录阻遏情况下，能自身调整恢复和维持RNA 合成
7.3.3 σ因子
σ 因子的种类
• σ70是大肠杆菌细胞中最丰富的一类σ因子， 参与大肠杆菌大多数基因的转录。
• 在不同细菌细胞中， σ的种类变化很大， 从只有一种到60几种。
晚早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止因子，它 能使晚期基因得到表达。
转录起始位点附近序列影响转录起始效率。
原核生物启动子的突变效应
强启动子和弱启动子：区别在于和启动
子序列与标准启动子序列同源性程度的大 小。
上升突变与下降突变：如突变后序列偏
离标准序列，启动子效率下降，为下降突 变，反之突变后启动子序列更接近标准序 列，启动子效率增强，为上升突变。 下将突变通常是A:T碱基对突变为G:C碱基 对，使稳定性增强；也有A:T变为T:A，改 变碱基堆积力，或改变RNA聚合酶的结合 能力。
识别转录起点在内 的23bp的启动子结构 高活性，不受调控，常用于原核细胞基因
是体外表达系统
7.3.7 原核生物RNA的转录过程
➢起始
1.封闭复合物 2.开放复合物 3.启动子清空
1.全酶与模板DNA接触，生成非专一不稳定的复合 物在模板上移动；
2.起始识别：全酶先与－35序列结合，产生封闭的 酶-启动子二元复合物；
抗终止作用机制
抗终止作用主要见于某些噬菌体的时序控制。
早期基因与后期基因之间以终止子隔开，抗终止实 验：发现它能贯通后期基因的表达，即后期基因的 表达是RNA链的延续。
λ噬菌体前早期基因产物N蛋白是一种抗终止因子。 它与RNApol作用使其在终止子处发生通读(read through)，表达晚早期基因。
即σ因子减少全酶与非启动子序列的非特异性结合 而增加与启动子序列的特异性结合。