RT-PCR的具体步骤
RT-PCR的具体步骤
加1mlTRIzol
↓
组织：匀浆(彻底，分几次打，是匀浆时产生的热量能散出，后转至EP管)
细胞：用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
4℃，离心12000g，15分钟
↓
转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中
(第二步：PCR反应：总体积20μl，如果50μl体系，相应加倍)
试剂浓度体积终浓度
Taq Buffer 10× 2μl 1×
MgCl2 25mM 1.2μl 1.5mM
dNTP 10mM 0.2μl
上游引物10pmol/μl 0.4μl
下游引物10pmol/μl 0.4μl
cDNA模板1μl
DEPC水14.7μl
3.RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年。
4.弃上清的操作，我们一般将EP管倒置在平铺于桌面的卷纸上，吸干。
5.最后一步弃酒精，将RNA溶于DEPC水的操作，我们的做法是：先按4的步骤吸干酒精，其实这样还是不彻底的，再将EP管小离心后用20μl小枪头(DEPC处理过的)吸出多余的酒精。最后用200μl中枪头(DEPC处理过的)吸11.5μl(20μl体系，如果是40μl体系则加倍)的DEPC水至EP管中，吹打助溶，然后转移至200μl的EP管(这些EP管中可以事先加好Oligo(dT)15，以节省枪头)中。
五．琼脂糖凝胶配制
1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼
RT-PCR的具体步骤
RT-PCR的具体步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常见的分子生物学技术，用于检测RNA分子。
在本文中，我们将介绍RT-PCR的具体步骤，以便您更加全面地了解这种技术。
1.总RNA提取首先需要从细胞中提取RNA。
这可以通过商用试剂盒或手工方法实现。
如果使用试剂盒，则遵循其说明书中的步骤。
如果手工提取RNA，则需要使用三个基本试剂：细胞裂解缓冲液、氯仿和异丙醇。
步骤如下：•将细胞收集在管中，加入裂解缓冲液。
•冷冻-解冻样品3次，使细胞壁破裂并释放RNA。
•加入氯仿并混合。
•离心样品，使沉淀分离出来。
•将上层溶液转移到另一个管中，加入异丙醇。
•冷藏或冷冻，然后离心。
•去除上层液体，并在无水酒精中对RNA进行洗涤和沉淀。
2.反转录在提取出RNA后，需要将其转录为DNA，即逆转录。
这可以通过使用反转录酶（RT）实现。
在反转录步骤中，会加入反转录引物和其他试剂来增强逆转录效果。
这些引物是由需要扩增的RNA序列的反向互补核酸序列构成的。
这些步骤如下：•将RNA加入反转录反应混合物中，该混合物包含反转录酶、引物和其他必要试剂。
•反转录混合物通常通过加热来促进逆转录引物结合到RNA模板上，并形成RNA-DNA杂交链。
随后，反转录酶在杂交链上寻找RNA模板，并通过降低杂交链的熔点来将反转录引物延伸为cDNA链。
3.PCR扩增完成逆转录后，需要进行PCR扩增以增加cDNA的数量。
PCR是一种将 DNA 扩增到数以百万计的技术，能够扩增非常小的DNA模板。
PCR的步骤如下：•在PCR反应混合物中加入适当的引物和其他必要试剂。
•该反应混合物包括DNA聚合酶、模板DNA、引物和核苷酸。
•反应混合物被放入PCR机器中，按照特定的程序进行加热和冷却，使DNA链复制为两条新的DNA链。
•扩增程度由PCR反应的周期数决定。
4.分析最后，将扩增的DNA分离并分析它们的大小、类型和量。
这可以通过游离电泳或毛细管电泳等技术实现。
RT-PCR实验步骤
RT-PCR实验步骤一、总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下混匀快速离心一次反应条件如下-20℃ 冰箱冻存三、PCR反应混匀快速离心一次反应条件如下PCR产物-20℃冰箱保存取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
RT-PCR实验方法总结1,2RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
rt-pcr反应步骤
rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。
它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。
以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。
这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。
2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。
引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。
4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。
在退火步骤中，引物与目标DNA结合。
在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。
5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。
总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。
Rt－PCR实验操作步骤
Rt－PCR实验操作步骤RT-PCR实验操作步骤（转）默认分类2007-12-25 17:51:05 阅读233 评论1 字号：大中小订阅一.所用试剂1.0.01MPBS缓冲液,PH7.4 ：高压灭菌，40C保存。
临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。
2.焦碳酸二乙酯(DEPC)：sigma公司，40C保存。
3.0.1%DEPC处理的灭菌去离子水：100ml去离子水中加入0.1mlDEPC，剧烈振荡混匀，让DEPC充分进入溶液中，370C放置过夜，高压蒸汽灭菌30分钟除去DEPC。
40C保存。
4.单相细胞裂解试剂TRizoL：Invitrogen生命技术公司，40C保存。
临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。
5.氯仿：用新开封的，10ml分装，40C保存。
临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。
6.异丙醇：用新开封的，20ml分装，40C保存。
临用前－200C 放置30分钟，确保冰冷。
7.0.1%DEPC处理的75％乙醇：无水乙醇75ml加0.1%DEPC处理的灭菌去离子水至100ml，4C保存。
临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。
8.cDNA反转录试剂盒：MBI公司，－200C保存。
9.2xPCR试剂：MBI公司，－200C保存。
10.5xTBE RNA电泳缓冲液：因为Tris碱可与DEPC发生反应并使之失活，所以含Tris碱的电泳缓冲液可用DEPC处理的灭菌去离子水配制，0.22um滤器过滤除菌。
室温保存，临用前用DEPC处理的灭菌去离子水10倍稀释。
使用本室RNA专用电泳槽，每次需配制0.5x 电泳缓冲液500ml。
11.50xTAE DNA电泳缓冲液：室温保存，临用前用去离子水50倍稀释。
使用本室DNA专用电泳槽，每次需配制1x电泳缓冲液1000ml。
12.6x上样缓冲液：1.5mlDEPC处理的灭菌离心管中称取2.5mg 溴酚蓝，加入0.3ml甘油，DEPC处理的灭菌去离子水定容至1ml，40C保存。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
rtpcr步骤及原理
rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。
本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。
同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。
引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。
反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。
一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。
这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。
反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。
反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。
RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。
引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。
二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。
PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。
PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。
PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。
每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。
变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。
三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。
凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。
RT-PCR全过程步骤
RT—PCR全过程步骤一．试剂材料准备1、塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管)2、玻璃制品:泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）(洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC)三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖二．总RNA提取1. 取100mg组织，放到1。
5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
（1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50—100mg 组织/ml Trizol 加入Trizo l，转入离心管进行第2 步操作。
(2）匀浆：组织样品按50—100mg/mlTrizol 加入Trizol。
另外,组织体积不能超过Trizol 体积的10％，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1—2 分钟.2. 震荡30s，室温放置5min，使其充分裂解。
12，000rpm 离心5min，弃沉淀。
3. 加0.2ml氯仿，摇动30s,室温5-10min。
注：禁用漩涡振荡器,以免基因组D NA 断裂。
4。
12000×g，4℃离心,15min。
5. 吸上层无色水相,移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，室温放置5—10min。
7。
12000×g,4℃离心,10min。
在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加冰预冷75%乙醇1ml，温和振荡，悬浮沉淀。
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4.弃上清的操作，我们一般将EP管倒置在平铺于桌面的卷纸上，吸干。
5.最后一步弃酒精，将RNA溶于DEPC水的操作，我们的做法是：先按4的步骤吸干酒精，
其实这样还是不彻底的，再将EP管小离心后用20μl小枪头（DEPC处理过的）吸出多余的酒 精。最后用200μl中枪头（DEPC处理过的）吸11.5μl（20μl体系，如果是40μl体系则加倍）的DEPC水至EP管中，吹打助溶，然后转移至200μl的EP管（这些EP管中可以事先加好Oligo（dT）15，以节省枪头）中。
脂糖凝固）后现进行电泳。
2．1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.5g
六．需购置材料
Taq酶（-20度保存）（配10×buffer和MgCl2）：不需要使用高保真Taq酶，一般的就行。个人感觉天为时代的普通Taq酶就很不错。
dNTP（4度保存）：向生物公司购买，原装和分装均可。
oligo（dT）15（-20度保存）：可以向生物公司购买Invitrogen合成的廉价货， 每支10元，稀释后 使用（注意稀释浓度），也可以购买Promega的原装货，稀释10倍后使用， 稀释液4度保存。
1．DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。
2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（DEPC水需先高压，高压时注意：
1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟， 所以水要适当多
干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干）。高压后烤干备用。如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。
3.匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，超声消毒即可（不需要泡DEPC。）
三．试剂配制
Marker（4度保存）：按照目的条带大小购买，推荐使用天为时代的
电泳Loading Buffer（4度保存）：按照配方自己配制，不需要购买（购买的话价格挺贵）。
七．引物合成
1．内参照：GAPDH（452bp）正义：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3
反义：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3
加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出）。
3．异丙醇：放入棕色瓶中。
4．氯仿：放入棕色瓶中。
5．琼脂糖
四．缓冲液配制
1．电泳缓冲液（5×TBE贮存液）：Tris 54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用（工作浓度）
2．上样缓冲液（6×缓冲液，4℃保存）：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油 五．琼脂糖凝胶配制
1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液， 微波炉加热至沸腾（如果首次煮胶， 一定要煮透， 以不出现泡沫为标志），熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min（可以放入4度冰箱加 快琼
9.铝制饭盒：
1-2个
10.大瓷缸：
1个
11.锡泊纸：
一卷
12.卷纸：2卷
13.三角烧瓶：带盖，稍大
二．实验器具处理
1.塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中（注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水），过夜后取出（注
意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩
↓
加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟
↓
4℃，离心12000g，10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇（DEPC水配）1ml
↓
4℃离心7500g，5分钟
↓
弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中
注意：1.RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解。
2.细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年以上）。
2．退火温度计算：2（A+T）+4（G+C），正反义平均数，再上下波动4-5度。
3．引物2 OD已足够，每管1 OD分装。
4．引物稀释：加DEPC水量（μl）＝X nmol/OD（合成的引物管上有标注）×管上所标OD数（推荐每管引物为1 OD分装，合成之前向公司说明这一点，切记！！）×100。最终引物浓度为10pmol /μl。
RT-PCR实验步骤
一．实验器具：
1.移液枪：
1ml、200μl、20μl、
10μl、2.5μ
2.吸头：
1ml、200μl、20μl
3.匀浆管：
5ml
4.EP管：
1.5ml、500μl、200μl
5.试剂瓶：
棕色试剂瓶（广口，放
75%乙醇)
6.量筒：100ml
7.容量瓶：
1000ml
8.试管架：
5ml、1.5ml、20μ
M-MLV（-20度保存）：向生物公司购买， 推荐使用Promega的，当然有钱可以购买更好的AMV。
RNasin（-20度保存）：向生物公司购买，推荐使用Promega的，原装分装均可。
DEPC（4度保存）：向生物公司购买，5克足矣。
Trizol（4度保存）：有50ml和100ml规格，按照实验需要自己购买。国外进口的有Invitrogen（Trizol）、罗氏（Tri Pure）、MRC（Tri Reagent）；国内的也行，天为时代的就不错。
↓
加1mlTRIzol
↓
组织：匀浆（彻底，分几次打，是匀浆时产生的热量能散出，后转至EP管）
细胞：用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
4℃，离心12000g，15分钟
↓
转上层水相（约400μl）于另一1.5mμl（一般取5μl）PCR产物，加已点在纸上的6×上样缓冲液，反复吸打混匀后进行电泳，一般用稳压状态进行电泳，100V左右，电泳20-30分钟，紫外灯下观察，结果进行扫 描保存。
九．注意点：1逆转录后应立即冰水浴2 RNA抽提前，打开离心机预冷
TRIzol法抽提总RNA
组织100mg/细胞1×107