铜绿假单胞菌与轻型链球菌混合生物膜体外模型的建立
铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究
复旦大学硕士学位论文铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究姓名：谢红梅申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：胡必杰20040518中文摘要背景细菌生物膜（Ｂｉｏｆｉｌｍ，ＢＦ）是细菌粘附于物体表面，并分泌大量多糖、蛋白和ＤＮＡ等多聚物质，将自身包裹于其中而形成的复杂膜状结构。
生物膜是细菌的～种保护性生长模式，广泛存在于自然界。
细菌也可定植于植入物、留置导管或人体组织表面形成生物膜。
生物膜内的细菌生物学特性与普通浮游细菌有显著差异，它具有极强的对外界化学物质的耐受性和抵抗宿主免疫系统的能力，是临床上难治性感染的一个重要原因。
近年来随着医学的发展，各种人工器官和留置导管使用的Ｒ益增多，生物膜相关感染也在不断增加，因此，研究生物膜形成影响因素及机理对于生物膜相关感染的防治具有重要意义。
第一部分铜绿假单胞菌生物膜分析方法的研究目的筛选一种有效且简单易行的生物膜分析方法方法分别采用流动培养法和静止培养法建立生物膜模型，用４种不同的方法分析：共聚焦激光扫描显微镜（ＣＬＳＭ）法、扫描电镜法、结晶紫染色法和超声振荡一活菌计数法分析生物膜的形成情况，ＣＬＳＭ观察生物膜的形态结构和厚度，扫描电镜法观察生物膜的形态结构，结晶紫染色法检测吸光度值，超声振荡一活菌计数法计数生物膜内的活细菌数。
分别将扫描电镜法、结晶紫染色法、超声振荡一活菌计数法所反映生物膜形成情况与ＣＬＳＭ结果相比较。
结果ＣＬＳＭ观察显示２４ｈ生物膜内微菌落呈稀疏散在分布，７２ｈ生物膜内细菌己形成微菌落，且许多微菌落已融合，形成稳定成熟的生物膜结构；２４ｈ和７２ｈ生物膜厚度分别为２７．６¨ｍ、６４．６ｐｒｏ。
扫描电镜法显示７２ｈ生物膜表面有大量形状不规则的基质成分，细菌被包裹于其中。
结晶紫染色法测得８ｈ、１６ｈ、２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ的吸光度值分别为０．０８土０．０４、０．２０土０．０７、０．４１士０．３３、Ｏ．４７士０．３３和０．６８＋０．３４，结果有统计学差异（Ｐ＜０．００１）。
铜绿假单胞菌的生物膜形成及其致病机制
铜绿假单胞菌的生物膜形成及其致病机制铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的革兰氏阴性杆菌，它产生的生物膜在其致病机制中起着重要的作用。
本文将探讨铜绿假单胞菌生物膜的形成机制以及致病机制的相关内容。
生物膜是由微生物聚集在生物界面上形成的一种复杂的结构。
它由多种微生物、水分、有机物质和矿物质组成，形成了一种稳定的生态系统。
在铜绿假单胞菌中，生物膜的形成是通过一系列复杂的步骤完成的。
首先，菌体附着在生物界面上，形成团块。
接着，菌体在团块之间建立起一种可以将细胞聚集在一起的基质。
这种基质通常由多糖、DNA以及蛋白质等分泌物组成，在保护细菌免受外界环境的侵害方面起到了重要的作用。
最后，菌体在这种环境中继续增殖，形成三维的生物膜结构。
生物膜的形成使得铜绿假单胞菌具有了许多特殊的性质，这些性质有助于其在致病过程中的适应和存活。
首先，生物膜提供了一种有效的保护罩，使得菌体免受抗生素和宿主免疫系统的攻击。
这也是为什么铜绿假单胞菌常常引起慢性感染的原因之一。
其次，生物膜提供了菌体相互作用和信号传递的平台，从而增强了菌体的适应能力和生存能力。
此外，生物膜还为菌体提供了营养物质，以支持其生长和繁殖。
铜绿假单胞菌生物膜形成的致病机制主要与其产生的一些分泌物有关。
其中，腺嘌呤环化酶是铜绿假单胞菌生物膜形成的关键酶之一。
腺嘌呤环化酶能够将腺嘌呤转化为二鸟苷酸（c-di-GMP），从而促进生物膜的形成。
c-di-GMP是一种重要的信号分子，能够调控一系列与生物膜形成相关的基因表达。
除了腺嘌呤环化酶，铜绿假单胞菌还能产生一些胞外信号分子，如N-3-氧代十二碳烯酰-L-丙氨酸（3O-C12-HSL）和N-但酰-L-丙氨酸（C4-HSL）。
这些信号分子能够介导菌体之间的相互作用和协调菌群行为，进一步促进生物膜的形成。
铜绿假单胞菌的生物膜形成和致病机制还与许多其他因素有关。
例如，菌体与宿主细胞表面的相互作用以及细胞外基质的组成都会影响生物膜的形成和稳定性。
铜绿假单胞菌生物膜及抗生物膜生成相关基因的研究进展
铜绿假单胞菌生物膜及抗生物膜生成相关基因的研究进展
王洪曼;顾欣峰;翟欣悦;李倩
【期刊名称】《临床合理用药杂志》
【年(卷),期】2020(13)32
【摘要】铜绿假单胞菌(Pseudomnas aeruginosa)在自然界中分布广泛,土壤、水、空气、人体的体表、呼吸道和肠道等与外界相通的腔道中均有该菌的存在。
铜绿假单胞菌是一种革兰阴性非发酵杆菌,是医院内常见的条件致病菌,是院内感染最常见
的细菌之一,常见于外伤特别是烧伤后的继发感染、尿路感染、血流感染、囊性纤
维化、抗生素相关感染及免疫抑制相关患者的继发感染中,位居临床非发酵菌检出
率的首位[1]。
铜绿假单胞菌感染目前已成为临床治疗的重点和难点,这是由于铜绿
假单胞菌存在较强的固有耐药性,且近年来随着抗菌药物的滥用,多重耐药菌株不断
出现。
【总页数】4页(P178-181)
【作者】王洪曼;顾欣峰;翟欣悦;李倩
【作者单位】潍坊医学院医学检验学系;山东省高密市人民医院检验科
【正文语种】中文
【中图分类】R44
【相关文献】
1.生物膜与铜绿假单胞菌耐药相关性研究进展
2.铜绿假单胞菌临床分离株生物膜、群体感应相关基因及耐药性分析
3.野生型铜绿假单胞菌和新型mucA突变铜绿假
单胞菌生物膜形成的动态观察4.抗铜绿假单胞菌生物膜形成相关因素及干预药物的研究进展5.抗铜绿假单胞菌生物膜药物研究进展
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铜绿假单胞菌生物膜体外模型
一、改良平板法建立铜绿假单胞菌生物膜体外模型（扫描电镜观察）1、取单克隆培养过夜的菌液，LB培养基1：200稀释2、取3ml置于6孔平底组织培养板中，每孔放入无菌盖玻片，37°培养，每24小时换培养液一次3、分别在24小时，3天，6天取出盖玻片，PBS漂洗三次，除去浮游细菌4、2.5%戊二醛预固定2小时（戊二醛能通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA，能保存糖原，也可以固定和蛋白质有关联的或含有氨基和亚氨基的脂类。
但是只使用戊二醛固定的样品无法阻止后面的脱水、渗透和包埋过程对样品脂类的抽提，因而对细胞膜的固定效果不理想。
）5、0.1mol/LPBS漂洗三次，再用1%锇酸固定2小时（经锇酸固定后，又能防止用酒精脱水时所产生的沉淀作用。
也是唯一能固定脂类分子的最好的化学固定剂）6、40-100%系列浓度酒精脱水（1、酒精可以置换组织内的水，最终脱水用的是无水乙醇。
高浓度的酒精（95%以上）对细菌有强烈的收缩和脆化的缺点，因此洗后不能立即投入高浓度酒精中。
脱水时为了避免细菌萎缩、僵硬，应在不同浓度的酒精里逐渐脱水。
2、如果使用高浓度酒精，对细菌蛋白脱水过于迅速，这时细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固的包膜，酒精反而不能很好的深入细菌内部）7醋酸乙戊酯置换（醋酸乙戊酯的极性较弱,临界点干燥时可以更好的与co2置换,从而更加完整的保持生物样品的表面形态.）8将盖玻片装入样品盒中置HCP-2临界点干燥仪中干燥2小时（扫描电镜在观察样品要求在高真空中进行。
无论是水还是脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈的汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构，因此，样品在用电镜观察前必须要干燥。
）9喷金三分钟，电镜扫描（生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。
用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。
铜绿假单胞菌体外生物膜模型的建立和鉴定
铜绿假单胞菌体外生物膜模型的建立和鉴定沈健;冯晨;沈香娣;唐佩;冯磊【摘要】Objective To build and identify verdigris pseudomonas biofilm model in vitro. Methods Verdigris pseudomonas were selected. By modified plate methods, stable verdigris pseudomonas biofilm model in vitro was built. The shapes of verdigris pseudomonas biofilm model in vitro and pelagic type verdigris pseudomonas were observed by sem, Fontana silver staining method, AB combined extracellular polysaccharide staining. Results By AB combined extracellular polysaccharide staining, cells were light red, extracellular glucose was deep red, and background was blue. By Fontana silver staining, cell was faint red, extracellular glucose was deep yellow, and background was orange yellow. By sem, bacterial biofilm was short sticky, bounding by viscous material, and there was melicera fibrous brin among becterials. Conclusion Building verdigris pseudomonas biofilm model in vitro was simple, and the results were reliable and repeatable. It provided experimental basis for further verdigris pseudomonas clinical therapy.%目的建立和鉴定铜绿假单胞菌体外生物膜.方法采用改良平板法,用扫描电镜、Fontana镀银染色法和刚果红-阿利新蓝(AB)染液联合胞外多糖染色法观察体外生物膜型的铜绿假单胞菌和浮游型铜绿假单胞菌的形态,建立稳定、可靠的铜绿假单胞菌体外生物膜模型.结果刚果红-阿利新蓝(AB)染液联合细菌胞外糖染色法,细菌细胞呈淡红色,胞外糖为深紫红色,背景呈蓝色；Fontana 镀银染色法细菌细胞呈绛红色,胞外糖为深黄色,背景呈桔黄色；扫描电镜下生物膜细菌呈短杆状,周围被黏稠状物质紧紧包绕,菌体间以黏稠的纤维状黏液丝相连.结论铜绿假单胞菌体外培养建立生物膜的方法简便易行,结果可靠,重复性好,为进一步开展铜绿假单胞菌临床治疗的研究提供了实验手段.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2013(042)001【总页数】5页(P50-54)【关键词】铜绿假单胞菌;生物膜;建立;鉴定【作者】沈健;冯晨;沈香娣;唐佩;冯磊【作者单位】310053杭州,浙江医学高等专科学校;310058 杭州,浙江大学医学院;310053杭州,浙江医学高等专科学校;325000 温州医学院;310058 杭州,浙江大学医学院;311300杭州,浙江农林大学健康管理系【正文语种】中文细菌生物膜(bacterial biofilm，BBF)是指细菌吸附于惰性物体如医学材料或机体黏膜表面后，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等蛋白－多糖复合物，细菌相互粘连形成结构性群落的膜样物［1］。
抗铜绿假单胞菌生物膜药物研究进展
[13] Furiga A, Lajoie B, et al. Impairment of Pseudomonas
aeruginosa Biofilm Resistance to Antibiotics by Combining the
Drugs with a New Quorum-Sensing Inhibitor[J].Antimicrob Agents
Pseudomonas Aeruginosa Lectins As Targets for Novel Antibacterials
凝集素抑制剂
[2]A.V. Grishin, M.S.Krivozubov, et al. Pseudomonas Aeruginosa L1e9ctins As Targets for Novel Antibacterials[J].Acta Naturae, 2015,7 (25):28-41.
（quorum sensing system，QS system）
11
[5]饶敏,魏维,等. 铜绿假单胞菌的群体感应系统与其致病及耐药机制[J]. 世界临床药物,2011,32(6):337-341+351.
铜绿假单胞菌群体感应系统及其抑制剂的研究进展
[6]曾莉莉,史道华,等. 铜绿假单胞菌群体感应系统及其抑制剂的研究进展[J]. 中国抗生素杂志,2014,39(9):70112-705+714.
Impairment of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Resistance to Antibiotics by Combining the Drugs with a New Quorum-Sensing Inhibitor
铜绿假单胞菌外膜亚蛋白质组图谱的建立
桂酰 基氨 酸钠 ， 再次 超速 离心 ， 淀溶于样 品裂解液 （ 沉 ７
ｍｏ／ ｌＬ尿 素 ， ｌＬ硫 尿 ， ％Ｃ ２ｍｏ／ ４ ＨＡＰ １ Ｄ Ｓ， ＴＴ） 室 ，
温裂 解 ２ｈ 上 清用 Ｂ ａ ｆｒ 法 测定 蛋 白浓度 ， ， ｒｄｏ ｄ 分装后
关 键 词 ： 绿假单胞菌 ； 铜 外膜蛋 白； 白质组学 ； 蛋 免疫学
中图分类 号 ： ８ Ｑ ７４
文 献标 识码 ： Ａ
文章 编号 ：４８ ４９２０）１ １１ ５ ０３— ７ （０８０— １— ０ ０ ０
铜 绿假单胞 菌 是人 类 机 会 致 病 菌 ， 为革 兰 氏 阴性
ｎ ｓ 厦 大生物 学 系胡 志 钰 老师 惠赠 ， ｏａ为 大肠 杆 菌工 程 菌株 为 大肠 杆 菌 Ｄ ａ和 Ｂ ２ （ ３ ， 实 验 室 保 Ｈ５ Ｌ １ ＤＥ ） 本
得 到应用 Ｊ ．
１ ２ 方 法 ．
１ ２ １ 外膜 蛋 白的提取 ．．
按参 考 文 献 Ｅ ３ 行． Ｌ 培 养 基 中 接 种 Ｐ． ８进 在 Ｂ
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剂均 为 国产分 析纯试 剂 ．
硫 菌） Ｌ ｐ ｏｐ ｒ （ 端螺 旋 体 ） Ｍｅｈ ｌｃｃｕ ａ — ， ｅ ｔｓ ｉ 钩 ａ ， ｔｙｏｏｃ ｓ ｐ ｃ ｓｌｔｓ 荚膜 甲基 球 菌） ｕａ ｕ （ 等多种 革兰 氏 阴性菌 的研究 中
铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性相关性探究
铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性相关性探究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的致病菌，可以导致各种感染，尤其在医疗机构和免疫功能低下的人群中特别常见。
其中，铜绿假单胞菌的生物膜形成和抗菌药物耐受性是该菌引起感染并导致治疗困难的重要原因之一。
本文将探究铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性之间的相关性。
生物膜是铜绿假单胞菌在环境中常见的生存形式，它是由菌落中的细菌通过分泌胞外多糖以及其他黏附因子形成的一层黏稠的聚集体。
生物膜在菌落内提供了保护和致病的优势。
在生物膜内，铜绿假单胞菌形成了一种高度结构化的矩阵，其中包括细菌细胞本身、胞外多糖、蛋白质以及DNA等物质。
铜绿假单胞菌生物膜的形成是一个复杂的过程，涉及多个遗传和环境因素的调控。
首先，一些遗传因素可以促进生物膜的形成。
例如，细菌生物膜有关的基因簇（pel和psl）会编码产生胞外多糖的酶以及其他黏附因子。
此外，铜绿假单胞菌还可以通过调节某些转录因子（例如vqsR和lasR）的表达来控制生物膜的形成。
其次，环境条件对生物膜形成也有重要影响。
铜绿假单胞菌通常生长在潮湿和富含养分的环境中，例如人体上的生化硝化滤池、人体创口和医疗设备表面等。
在这些环境中，菌落周围的水分和营养素可以促进细菌的黏附并形成生物膜。
此外，一些物理和化学参数，例如温度、pH值和氧气浓度，也会影响生物膜的形成。
铜绿假单胞菌生物膜的形成对抗菌药物的耐受性具有重要意义。
一方面，生物膜提供了一种物理屏障，使得抗菌药物难以通过，从而减少了其对菌落内细菌的杀菌效果。
另一方面，生物膜内的细菌通常处于生长缓慢或处于休眠状态，这使得它们对抗菌药物的杀菌作用更加耐受。
此外，生物膜中的细菌群体也通过细菌间的相互作用和基因共享等方式共同抵抗抗菌药物的作用。
为了解铜绿假单胞菌生物膜形成与抗菌药物耐受性之间的关系，研究人员开展了大量的实验和研究。
通过研究发现，生物膜相关基因的突变和缺失会导致菌落内生物膜的形成受到抑制。
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控机制 奠定基础 。方法 分别培养铜绿假单胞 菌ｒ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍ ｏ ｎ ａ ｓ ａ ｅ ｒ ｕ ｇ ｉ ｎ ｏ ｓ ａ ） 菌株Ｐ ＡＯ１ 、轻 型链球 菌（ Ｓ ｔ ｒ ｅ ｐ ｔ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ｍｉ ｔ ｉ ｓ ） 标准株 Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ４ ９ ４ ５ ６ 。紫外分光光度 计 、Ｃ Ｃ Ｋ． ８ （ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｏ ｕ ｎ ｔ ｉ ｎ ｇ ｋ ｉ ｔ 一 ８ ） 比色法 比较２ 种细 菌在不 同ｐ Ｈ值、培养基 、混合 比例 、加入 顺序和 混合时间条件下 的生长情况 。建 立单独及混合 细菌ＢＦ 后 ，荧光探针Ｓ ＹＴ Ｏ９ ／ Ｐ Ｉ 标记 ，激 光共 聚焦显微镜（ ｃ ｏ ｎ ｆ ｏ ｃ ａ ｌ ｌ ａ ｓ ｅ ｒ ｓ ｃ ａ ｎ ｎ ｉ ｎ ｇ
适 宜２ 种细 菌生长 ，Ｐ＜ ０ ． ０ １ ；２ 种 细菌在脑心浸 出液 培养基 中生长 明显优 于胰大豆蛋 白胨 肉汤培 养基 ，Ｐ＜ ０ ． ０ １ ；Ｐ Ａ Ｏ１ 与Ｓ ． ｍｉ ｔ ｉ ｓ 以１ ： ３ 混合 ，且Ｐ ＡＯ１ 优先加入 ，能形成较好的Ｂ Ｆ ，Ｐ＜ ０ ． ０ １ ；２ 种细菌混合的时机 以Ｐ Ａ Ｏ１ 培养 后立 即混合 ｍｉ ｔ ｉ ｓ 为优 ，Ｐ＜ ０ ． ０ １ 。 Ｃ Ｌ Ｓ Ｍ结 果显示Ｐ ＡＯ１ 可形成成熟致密 的Ｂ Ｆ ； ｍｉ ｔ ｉ ｓ 单独培 养不形成Ｂ Ｆ ；混合细 菌Ｂ Ｆ 较单独Ｐ Ａ Ｏ１ 组活菌 比例增 多，３ 组厚度分 别 为（ １ ９ ． ０ ２ ￣ １ ． ２ ９ ８ ） ｇ ｍ，（ ２ ． ２ ５ ０ ￣ ０ ． ２ ５ ） ｍ和（ ２ ８ ． ７ ６ ￣ ３ ． ４ ７ ２ ） ｇ ｍ，Ｐ＜ ０ ． ０ ５ 。Ｓ Ｅ Ｍ显示 混合细菌Ｂ Ｆ 内两种 细菌共存 ，结构更加致密立 体 。结 论 成功建立Ｐ Ａ Ｏ１ 混合 ｍｉ ｔ ｉ ｓ 的Ｂ Ｆ 体外模 ，方法简便易行 ，结果可靠 ，重复性强 。初步证实 ｍｉ ｔ ｉ ｓ 可 参与混合菌Ｂ Ｆ
（ 重庆 医科大学附属儿童 医院新生儿 中心，儿 童发育疾病研 究省部共建教育部重 点实验室 ，重庆市儿童发育 重大疾病 诊治与预防 国际科技合作基地 ，儿科 学重庆 市重点实验 室，重庆 ４ ０ ０ ０ １ ４ ）
摘 要 ： 目 的 探 索 混 合 细 菌 生 物 膜 （ ｂ ｉ ｏ ｉ ｆ ｌ ｍ，Ｂ Ｆ ） 培养 的 适 宜 条 件 ，建 立 混 合 细 菌 Ｂ Ｆ 体 外模 型 ， 并 为 研 究 混 合 细 菌 Ｂ Ｆ 的 调
形 成 ， 并起 促 进 作 用 。
关键 词 ： 铜绿 假 单 胞 菌 ；轻 型 链 球 菌 ；生 物 膜 ；模 型
中图分类号：Ｒ ３ ７ ８
文献标志码： Ａ
Ｅｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈｍ ｅ ｎｔ ｏ ｆ／ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｍｉ ｘ ｅ ｄ－ ｂｉ ｏ ｉ ｆ ｌ ｍ ｍｏ ｄｅ ｌ ｆ ｏｒ ｍｅ ｄ ｂ ｙ Ｐｓ ｅ ｕｄ ｏ ｍｏ ｎａ ｓ ａ ｅ ｒ ｕ ｇ ｉ ｎｏ ｓ ａ ａ ｎｄ Ｓｔ ｒ ｅ ｐｔ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ｍｉ ｔ ｉ ｓ
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２ ７ ８
中 国抗 生 素 杂 志 ２ ０ １ ５ ｆ ｇ ４ 月第４ ０ 卷第４ 期
文章编号 ：１ ０ ０ １ — ８ ６ ８ ９ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ４ — ０ ２ ７ ８ — ０ ７
铜绿假单胞 菌与轻型链球菌混合生物膜体外模型 的建立
傅雅琨 余加林 芦起 艾青 宋思捷 贺雨 张云辉