高二生物选修一第六课时 蛋白质的分离和纯化.导学案doc

第六课时蛋白质的分离和纯化【课标要求】：本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

【学习目标】：知识：尝识从血液中提取和分离血红蛋白，了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理能力：体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤学习蛋白质提取和分离的一些基本技术情感：初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神【学习重点】：凝胶色谱法的原理和方法【学习难点】：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填【课前导学】一、制备蛋白质的粗制品组织破碎_______________细胞破碎_______________酸性蛋白质：_______________蛋白质抽提水溶性蛋白质：_______________脂溶性蛋白质：_______________去除固体杂质______________蛋白质粗制品:可能是多种蛋白质的混合物，其中还可能混有许多小分子化合物二、蛋白质的分离与纯化1、原理：根据不同的物质其分子的大小、溶解度的大小、所带电荷的多少，吸附性质等方面存在差异进行的。

2、方法：⑴透析法：其原理是___________不能透过半透膜，而其他小分子化合物可以透过_____________。

⑵离心沉降法：通过控制_________，使得___________________不同的蛋白质发生沉降分层，从而达到分离出不同种类蛋白质的目的。

⑶电泳法①概念：带电颗粒在电场作用下向着与其____________________的现象②影响泳动速度的因素：____________________，（一般来说，分子直径_________，越接近于____形，所带净电荷_______，泳动速度越快，反之，则越慢。

）③常用的方法：______________电泳。

常用的支持物有___________、______________和__________等。

④实例——血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳【原理】血清中含有多种蛋白质，这些蛋白质分子大小不同，在pH为8.6的环境中均带负电荷，且所带电荷的多少不同，所以在电场中泳动的速度也不同，因此通过电泳可将血清蛋白分离纯化。

经染色后可计算出各蛋白质含量的百分数。

【步骤】1、配制试剂：巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液2、架滤纸桥：一端与支架前沿________，另一端_______缓冲液内。

3、浸泡薄膜：（1）用_______夹取醋酸纤维薄膜：为何不用手拿？___________________________________（2）在_______面用笔做上记号。

4、点样：（1）取出薄膜，吸去多余的液体，但不能吸干：___________________________________________。

（2）平铺在玻璃板上，______________朝下。

（3）在薄膜的______面，距离薄膜一端_____cm 处点样。

5、平悬薄膜：（1）用________夹取薄膜(2)点样端平贴在电泳槽________支架的“滤纸桥”，上，另一端平贴于_______，呈______状态。

(3) _____________朝上，6、实施电泳：（1）实施电泳时电泳槽盖应该_______,原因是____________________________________________。

【结果】三．凝胶色谱法（分配色谱法）：1．原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

2．分离过程：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

3．缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

4．血红蛋白的分离与纯化(一)基础知识准备：1、蛋白质分离和纯化的一般步骤？样品处理、粗分离、纯化、纯度的鉴定2、血液的成分？（二）提取与分离的过程1．选材：可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。

2．分离血细胞：500r/min离心2min，获取下层红色血细胞3．洗涤红细胞：试剂：生理盐水目的:除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化4、血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。

在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

5、分离血红蛋白溶液:2000r/min的速度离心10min用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体4、透析：除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液。

5、凝胶色谱分离蛋白质【讨论】1、正确的加样操作？2、在纯化血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？3、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？【典例反馈】1、凝胶色谱法分离蛋白质的原理是（ ）A 、根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小B 、根据蛋白质分子质量的大小C 、根据蛋白质所带净电荷的多少D 、根据蛋白质溶解度的大小2、凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用的方法。

但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离。

能分离的蛋白质分子之间必须（ ）A 、具有相同的相对分子质量B 、相对分子质量不同，但都是相对分子量较大的分子C 、相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子D 、具有相对分子质量不同的蛋白质3、下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是（ ）A 、层析柱高B 、层析柱的直径C 、缓冲溶液D 、样品的分布4、用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 （ ）A 、路程较长，移动速度较慢B 、路程较长，移动速度较快C 、路程较短，移动速度较慢D 、路程较短，移动速度较快5、洗涤红细胞时，分离所用的方法是（ ）A 、低速长时间离心B 、低速短时间离心C 、高速长时间离心D 、高速短时间离心6、利用凝胶色谱法分离蛋白质时，蛋白质洗脱出来的顺序是（ ）①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐关闭出口②滴加透析过的样品：用吸管吸1ml 样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

④洗脱：小心加入pH 为7的20mmol/l 的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml 一试管，连续收集。

①相对分子质量最大的②相对分子质量最小的③相对分子质量适中的A、①②③B、③②①C、①③②D、②①③7、分离血红蛋白时，将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min 后，可以明显看到试管中溶液分为四层。

下列描述正确的是（）A、第一层为无色透明的甲苯层B、第二层为红色透明层，含血红蛋白C、第三层为暗红色沉淀物，含未破裂的细胞D、第四层为白色薄层固体，是脂溶性沉淀物8、凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是（）A、改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B、吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C、将酶或细胞固定在凝胶中D、与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度【课堂反馈】一．选择题1．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。

（）A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。

（）A温度 B pH C渗透压D氧气浓度3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。

（）A相同B相反C相对D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。

（）A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。

（）A白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）A. NaClB.甲苯C.蒸馏水D.柠檬酸钠7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层（）A无色透明的甲苯层B脂溶性物质的沉淀层C血红蛋白的水溶液D其他杂质的暗红色沉淀物二．非选择题8．电泳利用了待分离样品中各种分子以及、的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。

9、分离血红蛋白溶液时，将混合液离心后可看到试管中的液体分为4层：第一层为______，第二层为______固体，是______的沉淀层，第三层是______液体，是______的水溶液，第四层是其他杂质的______沉淀物。

10、红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：（1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：___ ___、____ __、____ __和____ __。

（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。

①加入柠檬酸钠的目的是__________________。

②以上所述的过程即是样品处理，它包括___ __、___ ___、收集血红蛋白溶液。

（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。

①透析的目的是__________________。

②透析的原理是______________________________。

（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

①样品纯化的目的是______________________________。

②血红蛋白有什么特点？_____________________。

这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？第六课时蛋白质的分离和纯化【课前导学】机械破碎（剪碎）研磨、超声波、酶解法等稀碱性溶液中性缓冲液（透析液）有机溶剂离心二、蛋白质的分离与纯化2、⑴蛋白质半透膜⑵离心速率分子大小、密度⑶①电性相反的电极移动②电场强度、溶液的pH、带电颗粒的性质越小球形越多③支持物醋酸纤维薄膜滤纸大分子凝胶【步骤】3、（1）镊子防止手上的蛋白质污染醋酸纤维薄膜（2）光泽4、（1）保持湿润才能有利于缓冲液在电泳过程中起到缓冲作用（2）有记号的一面（3）无光2~35、（1）镊子(2) 负极正极绷直(3) 有标记的一面6、盖上由于醋酸纤维膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，以免过多过度蒸发。