饮用水中几种细菌计数方法的比较
生活饮用水标准检验方法 第8部分
生活饮用水标准检验方法第8部分
生活饮用水标准检验方法的第8部分涉及到水质中微生物的检测方法。
这部分通常包括了对大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌等微生物的检测方法。
首先，对水样进行预处理，通常包括过滤、浓缩等步骤，以提高微生物的检测灵敏度。
接着，常用的检测方法包括培养法、PCR法、蛋白质分析法等。
培养法是最常见的微生物检测方法之一，通过将水样接种在含有营养物质的培养基上，观察并计数产生的菌落来确定水样中微生物的数量。
PCR法则是一种分子生物学技术，能够快速、准确地检测特定微生物的DNA序列，从而确定水样中是否存在目标微生物。
蛋白质分析法则是通过检测水样中微生物特定蛋白质的含量来间接判断微生物的存在和数量。
除了这些常见的方法外，还有一些新兴的检测技术，如基因测序技术、质谱分析技术等，也正在逐渐应用于生活饮用水的微生物检测中。
这些方法各有优缺点，可以根据实际情况选择合适的方法进行检测。
总的来说，第8部分的生活饮用水标准检验方法涉及到了对水质中微生物的全面、准确的检测，以保障饮用水的安全和健康。
生活饮用水标准检验方法
生活饮用水标准检验方法在各种水体，特别是污染水体中存在有大量的有机物质,适于各种微生物的生长,因此水体是仅次于土壤的第二种微生物天然培养基。
水体中的微生物主要来源于土壤，以及人类的动物的排泄物及污染.水体中微生物的数量和种类受各种环境条件的制约。
一般认为，水中微生物以革兰氏阴性杆菌占有较大优势.与其他水体相比，河水及溪水中革兰氏阳性菌相对较多，这是因为陆地微生物冲洗污染的缘故。
《中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验法》提供了水质中细菌总数和总大肠菌群的检测方法。
1、国家标准中，细菌总数是指１ml水样在营养琼脂培养基中，于3７℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。
对生活饮用水,直接吸取1ml水样于平皿中，加入营养琼脂后混匀，37℃培养２4ｈ,进行计数。
对水源水,根据情况对样品进行10倍梯度稀释，选择适宜稀释液１ml，加注平皿，营养琼脂混匀，３7℃培养2４h,进行计数。
按照规定格式报告每毫升水中细菌总数.2、国家标准中，利用总大肠菌群作为粪便污染的指标。
总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的,37℃生长时能使乳糖发酵，在２4h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
水样中总大肠菌群数的含量,表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。
国家标准物质提供了多管发酵法及滤膜法检测总大肠菌群的方法。
3、多管发酵法检测总大肠菌群,分为三步:初发酵试验，平板分离，复发酵证实试验。
初发酵试验,采用乳糖蛋白胨培养液３7℃培养24h，观察产酸产气情况。
对阳性管培养物，接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基，观察菌落特征,并进行革兰氏染色和镜检。
对典型和可疑菌落，接种于乳糖蛋白胨培养液，进行复发酵证实试验，并根据标准所附检数表报告结果。
其中，对生活饮用水，初发酵试验接种水样总量30０mｌ，即100mｌ接种2管，1０ml接种10管，采用两个稀释度,1２支发酵管.对水源水，初发酵试验接种水样总量55．5ｍl，即１0ml接种５管，1ml接种5管，0.1ml接种1０管，共采用三个稀释度，15支发酵管。
自来水中细菌总数的测定
自来水中细菌总数的测定自来水是我们生活中必需的一种水源，但由于其经过管道输送，可能会受到外界环境的影响，其中细菌是其中一种污染物。
因此，对自来水中的细菌总数进行测定，有助于判断自来水是否符合生活饮用水标准。
一、实验原理本实验采用了膜过滤法对自来水中的细菌总数进行测定。
其原理是通过将水样通过微孔膜滤器，将水中的微生物捕捉在滤膜的表面，再将滤膜培养在含有营养物质的琼脂培养基中，使细菌能够生长形成菌落，然后再通过计数器进行计数。
二、实验步骤1. 实验前处理：先将实验室的玻璃仪器清洗干净，用工业酒精将滤器放入灭菌杯中斜着着火杀菌，备用。
2. 取一个样品瓶，将自来水（1L）倒入瓶中。
将样品瓶放入一个不透明的塑料袋中，用胶带密封塑料袋，防止紫外线照射导致细菌死亡。
3. 首先将滤装置组装好，将滤膜放入滤装置的中间柄内，放入开口的滤膜夹中。
然后用无菌注射器将琼脂培养基吸入滤装置的压力室中，将压力室旋好。
4. 用烧杯等容器将自来水倒入滤装置中，通过压力室将水样通过滤膜，滤膜表面残留的微生物被滤装置中的滤膜抓住，滤液通过过滤口流出。
滤液需丢弃。
5. 将滤膜夹子取下，将滤膜放入用滤膜侧朝上的营养琼脂培养基培养皿中，培养皿需用无菌手套拆开。
将其覆盖好，标明标识，并用胶带作为封口。
6. 将培养皿竖起放入培养箱中，温度设定为37℃左右，需要放置24h以上，17~25℃下也可进行培养，培养天数也需要视不同微生物而定。
7. 取出培养皿，用目镜进行菌落计数。
计数时需要注意，培养皿中的菌落数量需要控制在20~200个之间。
计数完后将数据进行转换，得出升级菌落数，即水样中的细菌总数。
三、实验注意事项1. 玻璃仪器需要在实验前清洗干净，并且需要消毒处理，防止样品污染。
2. 在进行实验前，实验人员需要洗手，并穿戴洁净的实验服和手套，防止手部细菌对实验结果的影响。
3. 滤装置和培养皿需要在无菌条件下进行处理，避免细菌的交叉感染。
4. 培养皿中需要加盖，防止紫外线照射导致细菌死亡，同时也可以避免污染。
几种常见生活饮用水菌落总数分析
几种常见生活饮用水菌落总数分析水是生活的必须，水是生命的源泉，水对人的生命和健康至关重要，世界卫生组织调查指出：人类疾病80%与水有关，长期饮用不清洁的水，对人类的健康有害。
日常生活中与我们关系最密切的水就是生活饮用水，生活饮用水是指人类饮用和日常生活中的使用水，它是人类生存不可缺少的要素。
在城市，生活用水主要是自来水，自来水是指通过自来水处理厂净化、消毒后生产出来的符合国家饮用水标准的供人们生活、生产使用的水。
它主要通过水厂的取水泵站汲取江河湖泊及地下水，地表水，并按照《国家生活饮用水相关卫生标准》，经过沉淀、消毒、过滤等工艺流程的处理，最后通过配水泵站输送到各个用户。
桶装水是近几年发展较快的生活饮用水，尤其是城市住宅集中区、学校、单位等人群较多的地方，广泛使用桶装水。
桶装水是指采用自来水或抽取地下水，经过现代工业技术（反渗透、电渗析、蒸馏、树脂软化等）处理而成的纯净水或矿泉水，再经过灌装生产线灌装至PVC桶而得到的产品。
在农村，生活饮用水主要有三个方面，第一是集中式供水，也就是自来水，多数为单村供水，只有水源和管网，无净化消毒设施和水源水质监测措施；第二是井水，包括浅井水、深井水和引泉水，均不经过净化消毒处理而直接饮用；第三是地表水，包括江河水、湖库水、池塘水和水窖水。
菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的微生物集合而成。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数是指水样在营养琼脂培养基上36℃左右培养48小时后，所得1毫升水样所含菌落的总数。
其单位是CFU。
CFU是形成菌落的菌落个数，不等于细菌个数。
菌落总数往往采用的是平板计数法，经过培养后我们数出平板上所生长出的菌落个数，从而计算出每毫升或每克待检样品中可以培养出多少个菌落。
菌落总数的多少代表了水被微生物污染的程度，菌落总数一旦超出国家标准规定范围，就可能危害人体健康安全。
介绍几种新的水中细菌总数检测方法
介绍几种新的水中细菌总数检测方法
1.流式细胞术：利用流式细胞仪将水样中的细菌进行分析和计数。
这种方法可以快速、高效地获取大量细菌数据，并且还可以进行不同种类细菌的分类和分析。
2. 基于荧光的检测方法：这种方法利用细菌表面的荧光素来进
行检测。
通过添加特定的荧光素探针，可以在短时间内快速、准确地测量水中细菌总数。
3. 基于DNA技术的检测方法：这种方法通过提取水样中的DNA，利用聚合酶链式反应(PCR)等技术来进行检测。
这种方法可以检测到
非常微小的细菌数量，而且还可以进行不同种类细菌的分子生物学鉴定。
4. 浸润法：这种方法是将一定量的水样浸润在适宜生长条件下
的培养基上，然后通过培养基上产生的菌落来计算水中细菌总数。
这种方法具有简单、易操作等特点，但是需要较长时间的培养过程。
5. QPCR技术：这种方法是一种快速、灵敏的检测细菌数量的方法，它利用荧光探针来放大和检测DNA序列。
这种方法可以在数小时内完成检测，而且可以检测不同种类的细菌。
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饮用水中几种细菌计数方法的比较
ႂႨඣᇏࠫᇕ༥ऩ࠹ඔٚم֥бࢠ鲁巍,王云,张晓健(清华大学环境科学与工程系,北京 100084)ᅋေ:比较采用不同培养基的平板计数(Plate Counts ,PC )方法,以及不同荧光染色剂的显微镜直接计数方法与常规计数方法的差别.研究认为,常规平板计数方法并不能准确反映饮用水中实际存活的细菌数量;吖啶橙直接计数(Acridine Orange DirectCounts ,AODC )的结果最高,较常规平板计数方法高出3～4个量级;活细菌直接计数(Direct Viable Counts ,DVC )中,DVC 2N.A.、DVC 2CTC 和DVC 2BacLight 等计数方法的结果较常规平板计数结果高出2～3个量级.以地表水为水源的水厂出水中活细菌数占总细菌数的比例在10%左右.ܱՍ:饮用水;直接计数;平板计数;活细菌直接计数;细菌ᇏٳোݼ:X832;TU991125 ໓ངѓ്:A ໓ᅣщݼ:025023301(2004)0420167203൬۠ರ௹:2003208207;ྩרರ௹:2003209225ࠎࣁཛଢ:国家自然科学基金资助项目(50238020);国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2002AA601140)ቔᆀࡥࢺ:鲁巍(1978～),男,博士研究生,主要从事水污染防治技术研究.Methods of Enumeration of B acteria in Drinking W aterL U Wei ,WAN G Yun ,ZHAN G Xiao 2jian(Department of Environmental Science and Engineering ,Tsinghua University ,Beijing 100084,China )Abstract :Methods of the enumeration of total bacteria and Coliform in drinking water were researched in this paper.The differences between heterotrophic plate count and direct viable count method were compared.It is concluded that the total number of bacteria in R2A medium is one order of quantity higher than the traditional plate count agar ,and the results of acridine orange direct counts (AODC )is the highest.S ome different staining methods in direct viable count were also compared in this paper ,such as nalidixic acid ,CTC staining and BacLight staining.The proportion of the live bacteria to the dead is about 10%.K ey w ords :drinking water ;enumeration ;PC ;DVC ;bacteria 在饮用水处理中,出厂水加氯消毒后进入管网,部分存活的微生物和管网中生物膜中的微生物会利用管网水中的微量可生物降解有机物进行再生长,引起所谓的生物稳定性问题[1].长期以来,国内多采用异养菌平板计数法(Heterotrophic Plate Counts ,HPC )和最大或然数法(Most Probable Number ,MPN )来测定饮用水中的活菌数.但由于饮用水中的贫营养环境有别于传统培养基提供的富营养环境,大多数在显微镜下观察到的细菌不能在传统培养基中生长(Nonculturable ),致使活菌计数结果偏低.近些年来,国外先后应用吖啶橙染色直接计数(Acridine Orange Direct Counts ,AODC )、活菌直接计数(Direct Viable Counts ,DVC )等方法对饮用水中的细菌总数及活菌数进行快速、直接的镜检计数.一些新的染色方法,如采用52氰基22,32联甲苯四唑盐酸盐(52Cyano 22,32ditolyltetrazolium chloride ,CTC )、核酸探针(BacLight )等对活细菌计数,都取得了很好地效果.国内这方面的研究却未见报道.本文应用AO 、CTC 、BacLight 等试剂染色,采用显微镜直接计数对饮用水中的细菌数量进行测定,并与常规平板计数方法所得结果进行了比较与讨论.1൫ဒҋਘބٚم111 水样的采集本试验所用水样分别取自实验室自来水和北方某市管网水.水样均采用无菌磨口玻璃瓶采集.实验室自来水未经特殊处理直接测定.现场水样采集后立即放入冷却箱中保存,4h 内测定.消毒试验所用水样为实验室自配水.112 细菌计数11211 总细菌计数(1)AODC 法[2] 水样采集后迅速加入甲醛固定,甲醛最终浓度2%;取10mL 固定后水样加入015mL 012%吖啶橙(Acridine Orange ,Sigma 公司)染色1～2min ;将染色水样经滤膜(孔径012μm ,直径25mm ,黑色聚碳酸脂滤膜,Nuclepore 公司)过滤;过滤后将滤膜置于载玻片上,用落射荧光显微镜(日本Nikon ,EF 2D 型)计数视野中发橙色或绿色荧光的菌体;显微镜光源为200W 汞灯,激发光滤光片第25卷第4期2004年7月环 境 科 学ENV IRONM EN TAL SCIENCEVol.25,No.4J uly ,20041༥ऩ࠹ඔࢲݔFig.1 The results of bacteria enumeration为450～490nm ,光束分离滤光片510nm ,阻挡滤光片520nm.(2)BacLight 染色直接计数法 将试剂按照产品要求配制后,取2mL 固定后水样加入60μL 所配BacLight 染色试剂,避光培养15～20min ;然后按照AODC 处理方法制片,观察计数视野中发红色或绿色荧光的菌体.所用滤光片波段同AODC 相同.11212 活细菌计数(1)DVC 法 方法①(DVC 2N.A.):向水样中加入01002%萘啶酮酸(N.A.,Nalidixic Acid ,Fluka 公司)和01025%酵母膏(均为最终浓度),避光,25℃培养6h ,然后2%甲醛固定,再按照AODC 法直接镜检计数.视野中长大或变粗的菌体被认为是活菌;方法②(DVC 2CTC ):将012mL 1167%的CTC 加入10mL 水样中(CTC 最终浓度1mmol/L ),避光室温培养4h ,然后2%甲醛固定,再按照AODC 法直接镜检计数视野中的红色菌体;方法③(DVC 2BacLight ):参见11211,只镜检计数视野中发绿色荧光的菌体.(2)HPC 法 采用传统营养琼脂培养基和R2A 培养基进行平板计数,详见相关检验手册[3].R2A 培养基基本组成为:酵母浸膏015g ,蛋白胨015g ,酸水解干酪素015g ,葡萄糖015g ,可溶性淀粉015g ,丙酮酸钠013g ,K 2HPO 4013g ,MgSO 4・7H 2O 0105g ,琼脂15g ,溶于1L 水.11213 总大肠菌群计数消毒试验考察消毒剂的灭菌效果,配水中投加的大肠杆菌菌液为实验室自培养.(1)滤膜法 常规检测方法,详见检验手册[3].(2)荧光显微计数 参见11211,11212.2൫ဒࢲݔაษં211 细菌计数方法比较应用AODC 、DVC 及HPC 等方法对实验室自来水及城市管网水中细菌总数及活菌数计数的结果见图1,表1中计算了活菌数占总细菌数的比例.і1ࠃऩඔᅝሹ༥ऩඔ֥б২/%Table 1 Proportion of the live bacteria to the total/%样品计数方法N.A./AODCCTC/AODC Bac 2live/AODC HPC/AODC营养琼脂R2A 实验室自来水13191717251701094111某水厂出水6119181217未检出01068管网水818101512140100770112管网末梢水7191113915010100112 由图1可以看出,AODC 和BacLight 2种方法得出的总细菌数无显著性差异.北方某市各点水样中细菌总数在105个/mL 量级,活菌数在104个/mL 量级.实验室自来水中细菌总数在104个/mL量级,活菌数在103个/mL 量级.以营养琼脂作为培养基的平板计数只有几十个CFU/mL ,以R2A 作为培养基的平板计数也只达到102个/mL 量级.实验室自来水是高校自供水,水源为地下水,所调查水厂的水源为地表水,水源水质差异可能是引起细菌数差异的因素之一.由表1看出,实验室自来水中活菌数所占比例在10%～25%之间,而以地表水为水源的水厂出水中活菌数所占比例基本在10%左右.活菌计数中计数结果大小顺序为:BacLight >CTC >N.A.>R2A >营养琼脂.R2A 培养基是一种贫营养培养基,其提供的培养条件更接近饮用水中的贫营养环境,因此其结果较常规营养琼脂培养基高.但是由于自然环境中大多数微生物是不可培养的(Nonculturable ),所以DVC 结果又远高于平板计数结果.萘啶酮酸可以抑制细菌DNA 的复制,但不影响细胞中其它合成途径的继续运转,在一定浓度营养物存在下,菌体伸长、变大(如图2所示).但是由于部分格兰氏阳性及格兰氏阴性菌对萘啶酮酸有抗性,低浓度的NA 不能抑制它们的繁殖,致使计数结果出现偏差[4].BacLight 是近年来由分子探针公司研制出的新型荧光染色剂,由SYTO9和碘化丙锭(propidium iodide )2种核酸探针组成.SYTO9能将所有细菌染色,发绿色荧光,而碘化丙锭能穿透细胞膜受损细胞,发红色荧光(如图2所示)[5].由于碘化丙锭只能穿透受损细胞,因此部分细胞膜完好但实际不能存活的部分细菌未能被染色,这就导致了BacLight 的活菌计数结果高于CTC 、NA 的计数结果.应用CTC 进行活菌计数时,由于细菌的呼吸作用,CTC 被还原成CTF (CTC Formazan ),其在荧光显微镜下发红色荧光(如图2所示)[6],从理论上看,CTC 方法的基本原理是利用活细胞的呼吸作用,因此能够比较准确地反映活细菌的数量,而且该方法的试验费用相对较低,适合实验室研究使用.212 消毒试验大肠杆菌计数2ࠃऩ࠹ඔم႐ܻಙཞ(ᅶோनູՂऩအު෮ജ,٢նПඔູ࣍රᆴ,ࣇ܂ҕॉ)Fig.2 The images of fluorescent staining methods 实验室通过配水试验,考察一定浓度余氯对大肠菌群的灭活效果,大肠菌群计数方法采用常规膜滤法和DVC 方法.当初始加氯量015mg/L 时,存活细菌数与时间的关系如图3所示.3թࠃ༥ऩඔაൈࡗ֥ܱ༢Fig.3 The relationship of time and the number of the live bacteria从图3中可以看出,AODC 计数结果基本不随时间变化,始终停留在初始量级105.N.A.,CTC ,BacLight 3种药剂的DVC 计数结果基本相同,从105逐渐下降到103.传统的膜滤法平板计数结果同样都随着时间的推移而逐渐减少,但是计数结果与DVC 方法存在显著的差异,这说明常规计数方法并不能准确反映水体中微生物的存活状况.3ࢲં (1)显微镜直接计数的结果远远高于常规平板计数,更能准确反映饮用水中的微生物数量.(2)活菌计数中计数结果大小顺序为:DVC 2BacLight >DVC 2CTC >DVC 2N.A.>R2A >营养琼脂.其中CTC 方法能够比较准确地反映活细菌的数量,而且该方法的试验费用相对较低,适合实验室研究使用.(3)在考察消毒剂对细菌的灭活效果时,直接计数可以更准确地反映细菌存活的状况.ҕॉ໓ང:[1] 王占生,等.微污染水源饮用水处理[M ].北京:中国建筑工业出版社,1999.236～243.[2] Hobbie J E ,et e of nuclepore filters for counting bacteriaby fluorescence microscopy [J ].Appli.Environ.Micriobiol.,1976,33(5):1225～1228.[3] 俞毓馨,等.环境工程微生物检验手册[M ].北京:中国环境科学出版社,1990.136～144.[4] Kazuhiro K ogure ,et al .An improved direct viable countmethod for aquatic bacteria[J ].Arch.Hydrobiol.,1984,102:117～122.[5] Lina Boulos ,et al.L IVE/DEAD BacLight TM :application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water [J ].J.Microbiological Methods.,1999,37:77～86.[6] Rodriguez G G ,et e of a fluorescent redox probe fordirect visualization of actively respiring bacteria.Appli.Environ.Micriobiol.,1992,58(6):1801～1808.。
生活饮用水检验标准微生物指标
生活饮用水是人们日常生活中不可或缺的重要物质，其质量和卫生安全直接关系到人们的健康。
国家对生活饮用水的质量进行了严格的监管和检测。
其中微生物指标是评价生活饮用水卫生安全的重要指标之一。
以下将围绕生活饮用水检验标准中的微生物指标，进行详细的分析和阐述。
一、微生物指标的含义微生物指标是指生活饮用水中微生物的种类和数量。
微生物包括细菌、病毒、寄生虫等，在水中存在的微生物主要来自污染源，如粪便、废水等。
通过检测水中微生物的种类和数量，可以评估水质的污染程度，以及是否存在潜在的卫生风险。
二、生活饮用水检验标准中的微生物指标根据国家标准《生活饮用水卫生标准》，生活饮用水的微生物指标主要包括大肠杆菌、菌落总数、大肠埃希氏菌等。
这些微生物指标的含量和标准均是对水质卫生安全的重要保障。
1. 大肠杆菌大肠杆菌是一类常见的肠道微生物，在水中存在的数量和比例可以反映水质的卫生安全情况。
国家标准规定，每升生活饮用水中大肠杆菌的数量应当为0个。
这意味着生活饮用水中不应当存在大肠杆菌，如果水中发现大肠杆菌，就表明水质存在严重的卫生风险，不适宜饮用。
2. 菌落总数菌落总数是指水样中可增殖繁殖的微生物的总数目，通常用于评估水质的微生物污染程度。
国家标准对于生活饮用水中菌落总数的要求是每毫升不超过100个。
这表示生活饮用水的微生物污染应当控制在一个很低的水平，以保障水质的卫生安全。
3. 大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌是一类肠道病原菌，其存在可以直接威胁人体健康。
国家标准规定，生活饮用水中大肠埃希氏菌的数量应当为0个。
这也是对水质卫生安全的严格要求，意味着生活饮用水中不应当存在大肠埃希氏菌。
三、微生物指标的检测方法针对生活饮用水中微生物指标的检测，通常采用的是微生物培养法和分子生物学检测法两种方式。
1. 微生物培养法微生物培养法是通过将水样放置在适当的培养基上，利用微生物自身的代谢特性，培养出各类微生物菌落，然后通过计数和鉴定来确定其中的微生物种类和数量。
细菌总数的计算方法
细菌总数的计算方法一、直接计数法直接计数法是通过对细菌进行可见光显微镜观察，并使用计数室将细菌数量统计出来。
这种方法可以对样品中的所有细菌进行计数，包括活细菌和死细菌。
1.视觉法：这种方法利用显微镜对细菌进行观察和计数。
首先，将样品涂布在载玻片上，然后在显微镜下使用适当的目镜和物镜来观察细菌，使用计数室将细菌数量统计出来。
2.过滤法：这种方法适用于样品中细菌数量很大的情况。
首先，将样品经过滤器过滤，然后将过滤器放在培养基上进行培养，最后对培养基上细菌进行计数。
3.流式细胞仪法：这种方法适用于样品中的细菌数量很小的情况。
流式细胞仪会将细菌进行分散并单个通过激光束，然后通过光散射、荧光标记等方法对细菌进行计数和鉴定。
二、间接计数法间接计数法是通过测量细菌的生长特性来估计细菌总数。
这种方法可以很快得到结果，但只能对活细菌进行计数。
1.湿涂法：这种方法基于细菌在固体培养基上形成的菌落数来估计细菌数量。
首先，将样品通过稀释后涂布在固体培养基上，培养一段时间后，观察并计算形成的菌落数。
2.光密度法：这种方法利用测量细菌培养液中的光密度来估计细菌数量。
细菌培养液的光密度与细菌浓度呈正相关关系，可以通过分光光度计等仪器来测定光密度。
3.ATP酶法：这种方法基于细菌细胞内的ATP含量与细菌数量呈正相关关系。
通过检测样品中的ATP含量，可以估计细菌数量。
细菌总数的计算方法并不仅限于上述的几种，科学家们还在不断发展和改进计数方法。
但无论哪种方法，准确性都是一个重要考量因素。
因此，在进行细菌计数时，需要选择适当的方法，并结合标准曲线、稀释方法等进行校正和验证，以保证结果的准确性。
水环境卫生细菌学检测—生活饮用水生物指标监测
主要内容
生活饮用水卫生标准： 细菌总数 大肠菌群
一、细菌总数
①定义：将定量的水样接种于营养琼脂培养基中，37℃下经24h培养后， 所生长的菌落数，然后根据接种的水样量即可算出每毫升水中所含的 菌数。单位：cfu/mL。 ②意义：水体有机物污染的指标 ③测定方法：稀释平板计数法（一般采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） ④测定步骤：采样→稀释水样→培养→菌落计数
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二、大肠菌群－滤膜法
优点：操作简单、快速 缺点：适用于杂质较少的水样，如井水和自来水 步骤：①配制伊红美蓝琼脂培养基 ②滤膜及滤膜过滤
水质 细菌总数的测定 菌落计数
水质细菌总数的测定菌落计数1. 适用范围本方法适用于测定饮用水、水源水、地表水细菌总数的测定。
2. 原理平板计数法是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异养菌密度的方法。
因为细菌在水中能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在，而且没有任何单独一种培养基或一套物理、化学条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求。
所以，由此法所得的菌落数可能要低于真正存在的活细菌的总数。
3. 仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱冰箱解剖镜。
采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
培养基营养琼脂培养基：市售营养琼脂培养基，按说明配制，装于三角烧瓶中，经121℃高压蒸汽灭菌15min，经无菌性检验和标准菌株检验后，贮存于暗处备用。
4. 步骤4.1 选择稀释度稀释度要选择适宜，以期在平皿上的菌落总数介于30～300之间。
大多数饮用水水样，未经稀释直接接种1mL，所得的菌落总数可适于计数。
4.2 水样的稀释方法①将水样用力振摇20～25次，使可能存在的细菌凝团成分散状。
②以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌水的试管中，混匀成1：100稀释液。
按同法依次稀释成1：1000、1：10000稀释液（稀释倍数按水样污浊程度而定）。
注意：吸取不同浓度的稀释液时，必须更换吸管。
4.3 操作方法①以无菌操作方法用1mL灭菌吸管吸取充分混匀的水样或2～3个适宜浓度的稀释水样1mL，注入灭菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。
每个水样应倾注两个平皿。
②待琼脂冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于37℃恒温箱内培养24h，进行菌落计数。
4.4 菌落计数培养之后，立即进行平皿菌落计数。
如果计数必须暂缓进行，平皿需存放于5～10℃冰箱内，且不得超过24h。
但是不可以使这种做法成为常规的操作方式。
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ႂႨඣᇏࠫᇕ༥ऩ࠹ඔٚم֥бࢠ鲁巍,王云,张晓健(清华大学环境科学与工程系,北京 100084)ᅋေ:比较采用不同培养基的平板计数(Plate Counts ,PC )方法,以及不同荧光染色剂的显微镜直接计数方法与常规计数方法的差别.研究认为,常规平板计数方法并不能准确反映饮用水中实际存活的细菌数量;吖啶橙直接计数(Acridine Orange DirectCounts ,AODC )的结果最高,较常规平板计数方法高出3～4个量级;活细菌直接计数(Direct Viable Counts ,DVC )中,DVC 2N.A.、DVC 2CTC 和DVC 2BacLight 等计数方法的结果较常规平板计数结果高出2～3个量级.以地表水为水源的水厂出水中活细菌数占总细菌数的比例在10%左右.ܱՍ:饮用水;直接计数;平板计数;活细菌直接计数;细菌ᇏٳোݼ:X832;TU991125 ໓ངѓ്:A ໓ᅣщݼ:025023301(2004)0420167203൬۠ರ௹:2003208207;ྩרರ௹:2003209225ࠎࣁཛଢ:国家自然科学基金资助项目(50238020);国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2002AA601140)ቔᆀࡥࢺ:鲁巍(1978～),男,博士研究生,主要从事水污染防治技术研究.Methods of Enumeration of B acteria in Drinking W aterL U Wei ,WAN G Yun ,ZHAN G Xiao 2jian(Department of Environmental Science and Engineering ,Tsinghua University ,Beijing 100084,China )Abstract :Methods of the enumeration of total bacteria and Coliform in drinking water were researched in this paper.The differences between heterotrophic plate count and direct viable count method were compared.It is concluded that the total number of bacteria in R2A medium is one order of quantity higher than the traditional plate count agar ,and the results of acridine orange direct counts (AODC )is the highest.S ome different staining methods in direct viable count were also compared in this paper ,such as nalidixic acid ,CTC staining and BacLight staining.The proportion of the live bacteria to the dead is about 10%.K ey w ords :drinking water ;enumeration ;PC ;DVC ;bacteria 在饮用水处理中,出厂水加氯消毒后进入管网,部分存活的微生物和管网中生物膜中的微生物会利用管网水中的微量可生物降解有机物进行再生长,引起所谓的生物稳定性问题[1].长期以来,国内多采用异养菌平板计数法(Heterotrophic Plate Counts ,HPC )和最大或然数法(Most Probable Number ,MPN )来测定饮用水中的活菌数.但由于饮用水中的贫营养环境有别于传统培养基提供的富营养环境,大多数在显微镜下观察到的细菌不能在传统培养基中生长(Nonculturable ),致使活菌计数结果偏低.近些年来,国外先后应用吖啶橙染色直接计数(Acridine Orange Direct Counts ,AODC )、活菌直接计数(Direct Viable Counts ,DVC )等方法对饮用水中的细菌总数及活菌数进行快速、直接的镜检计数.一些新的染色方法,如采用52氰基22,32联甲苯四唑盐酸盐(52Cyano 22,32ditolyltetrazolium chloride ,CTC )、核酸探针(BacLight )等对活细菌计数,都取得了很好地效果.国内这方面的研究却未见报道.本文应用AO 、CTC 、BacLight 等试剂染色,采用显微镜直接计数对饮用水中的细菌数量进行测定,并与常规平板计数方法所得结果进行了比较与讨论.1൫ဒҋਘބٚم111 水样的采集本试验所用水样分别取自实验室自来水和北方某市管网水.水样均采用无菌磨口玻璃瓶采集.实验室自来水未经特殊处理直接测定.现场水样采集后立即放入冷却箱中保存,4h 内测定.消毒试验所用水样为实验室自配水.112 细菌计数11211 总细菌计数(1)AODC 法[2] 水样采集后迅速加入甲醛固定,甲醛最终浓度2%;取10mL 固定后水样加入015mL 012%吖啶橙(Acridine Orange ,Sigma 公司)染色1～2min ;将染色水样经滤膜(孔径012μm ,直径25mm ,黑色聚碳酸脂滤膜,Nuclepore 公司)过滤;过滤后将滤膜置于载玻片上,用落射荧光显微镜(日本Nikon ,EF 2D 型)计数视野中发橙色或绿色荧光的菌体;显微镜光源为200W 汞灯,激发光滤光片第25卷第4期2004年7月环 境 科 学ENV IRONM EN TAL SCIENCEVol.25,No.4J uly ,20041༥ऩ࠹ඔࢲݔFig.1 The results of bacteria enumeration为450～490nm ,光束分离滤光片510nm ,阻挡滤光片520nm.(2)BacLight 染色直接计数法 将试剂按照产品要求配制后,取2mL 固定后水样加入60μL 所配BacLight 染色试剂,避光培养15～20min ;然后按照AODC 处理方法制片,观察计数视野中发红色或绿色荧光的菌体.所用滤光片波段同AODC 相同.11212 活细菌计数(1)DVC 法 方法①(DVC 2N.A.):向水样中加入01002%萘啶酮酸(N.A.,Nalidixic Acid ,Fluka 公司)和01025%酵母膏(均为最终浓度),避光,25℃培养6h ,然后2%甲醛固定,再按照AODC 法直接镜检计数.视野中长大或变粗的菌体被认为是活菌;方法②(DVC 2CTC ):将012mL 1167%的CTC 加入10mL 水样中(CTC 最终浓度1mmol/L ),避光室温培养4h ,然后2%甲醛固定,再按照AODC 法直接镜检计数视野中的红色菌体;方法③(DVC 2BacLight ):参见11211,只镜检计数视野中发绿色荧光的菌体.(2)HPC 法 采用传统营养琼脂培养基和R2A 培养基进行平板计数,详见相关检验手册[3].R2A 培养基基本组成为:酵母浸膏015g ,蛋白胨015g ,酸水解干酪素015g ,葡萄糖015g ,可溶性淀粉015g ,丙酮酸钠013g ,K 2HPO 4013g ,MgSO 4・7H 2O 0105g ,琼脂15g ,溶于1L 水.11213 总大肠菌群计数消毒试验考察消毒剂的灭菌效果,配水中投加的大肠杆菌菌液为实验室自培养.(1)滤膜法 常规检测方法,详见检验手册[3].(2)荧光显微计数 参见11211,11212.2൫ဒࢲݔაษં211 细菌计数方法比较应用AODC 、DVC 及HPC 等方法对实验室自来水及城市管网水中细菌总数及活菌数计数的结果见图1,表1中计算了活菌数占总细菌数的比例.і1ࠃऩඔᅝሹ༥ऩඔ֥б২/%Table 1 Proportion of the live bacteria to the total/%样品计数方法N.A./AODCCTC/AODC Bac 2live/AODC HPC/AODC营养琼脂R2A 实验室自来水13191717251701094111某水厂出水6119181217未检出01068管网水818101512140100770112管网末梢水7191113915010100112 由图1可以看出,AODC 和BacLight 2种方法得出的总细菌数无显著性差异.北方某市各点水样中细菌总数在105个/mL 量级,活菌数在104个/mL 量级.实验室自来水中细菌总数在104个/mL量级,活菌数在103个/mL 量级.以营养琼脂作为培养基的平板计数只有几十个CFU/mL ,以R2A 作为培养基的平板计数也只达到102个/mL 量级.实验室自来水是高校自供水,水源为地下水,所调查水厂的水源为地表水,水源水质差异可能是引起细菌数差异的因素之一.由表1看出,实验室自来水中活菌数所占比例在10%～25%之间,而以地表水为水源的水厂出水中活菌数所占比例基本在10%左右.活菌计数中计数结果大小顺序为:BacLight >CTC >N.A.>R2A >营养琼脂.R2A 培养基是一种贫营养培养基,其提供的培养条件更接近饮用水中的贫营养环境,因此其结果较常规营养琼脂培养基高.但是由于自然环境中大多数微生物是不可培养的(Nonculturable ),所以DVC 结果又远高于平板计数结果.萘啶酮酸可以抑制细菌DNA 的复制,但不影响细胞中其它合成途径的继续运转,在一定浓度营养物存在下,菌体伸长、变大(如图2所示).但是由于部分格兰氏阳性及格兰氏阴性菌对萘啶酮酸有抗性,低浓度的NA 不能抑制它们的繁殖,致使计数结果出现偏差[4].BacLight 是近年来由分子探针公司研制出的新型荧光染色剂,由SYTO9和碘化丙锭(propidium iodide )2种核酸探针组成.SYTO9能将所有细菌染色,发绿色荧光,而碘化丙锭能穿透细胞膜受损细胞,发红色荧光(如图2所示)[5].由于碘化丙锭只能穿透受损细胞,因此部分细胞膜完好但实际不能存活的部分细菌未能被染色,这就导致了BacLight 的活菌计数结果高于CTC 、NA 的计数结果.应用CTC 进行活菌计数时,由于细菌的呼吸作用,CTC 被还原成CTF (CTC Formazan ),其在荧光显微镜下发红色荧光(如图2所示)[6],从理论上看,CTC 方法的基本原理是利用活细胞的呼吸作用,因此能够比较准确地反映活细菌的数量,而且该方法的试验费用相对较低,适合实验室研究使用.212 消毒试验大肠杆菌计数2ࠃऩ࠹ඔم႐ܻಙཞ(ᅶோनູՂऩအު෮ജ,٢նПඔູ࣍රᆴ,ࣇ܂ҕॉ)Fig.2 The images of fluorescent staining methods 实验室通过配水试验,考察一定浓度余氯对大肠菌群的灭活效果,大肠菌群计数方法采用常规膜滤法和DVC 方法.当初始加氯量015mg/L 时,存活细菌数与时间的关系如图3所示.3թࠃ༥ऩඔაൈࡗ֥ܱ༢Fig.3 The relationship of time and the number of the live bacteria从图3中可以看出,AODC 计数结果基本不随时间变化,始终停留在初始量级105.N.A.,CTC ,BacLight 3种药剂的DVC 计数结果基本相同,从105逐渐下降到103.传统的膜滤法平板计数结果同样都随着时间的推移而逐渐减少,但是计数结果与DVC 方法存在显著的差异,这说明常规计数方法并不能准确反映水体中微生物的存活状况.3ࢲં (1)显微镜直接计数的结果远远高于常规平板计数,更能准确反映饮用水中的微生物数量.(2)活菌计数中计数结果大小顺序为:DVC 2BacLight >DVC 2CTC >DVC 2N.A.>R2A >营养琼脂.其中CTC 方法能够比较准确地反映活细菌的数量,而且该方法的试验费用相对较低,适合实验室研究使用.(3)在考察消毒剂对细菌的灭活效果时,直接计数可以更准确地反映细菌存活的状况.ҕॉ໓ང:[1] 王占生,等.微污染水源饮用水处理[M ].北京:中国建筑工业出版社,1999.236～243.[2] Hobbie J E ,et e of nuclepore filters for counting bacteriaby fluorescence microscopy [J ].Appli.Environ.Micriobiol.,1976,33(5):1225～1228.[3] 俞毓馨,等.环境工程微生物检验手册[M ].北京:中国环境科学出版社,1990.136～144.[4] Kazuhiro K ogure ,et al .An improved direct viable countmethod for aquatic bacteria[J ].Arch.Hydrobiol.,1984,102:117～122.[5] Lina Boulos ,et al.L IVE/DEAD BacLight TM :application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water [J ].J.Microbiological Methods.,1999,37:77～86.[6] Rodriguez G G ,et e of a fluorescent redox probe fordirect visualization of actively respiring bacteria.Appli.Environ.Micriobiol.,1992,58(6):1801～1808.。