利用激光扫描共聚焦显微镜研究拟南芥气孔发生与发育

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拟南芥实验报告

一、实验目的1. 了解拟南芥基因表达调控的基本原理和实验方法；2. 掌握利用RNA干扰技术（RNAi）研究基因表达调控的方法；3. 通过实验验证特定基因在拟南芥生长发育过程中的功能。

二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学研究的模式植物。

在植物生长发育过程中，基因表达调控起着至关重要的作用。

RNA干扰技术（RNAi）是一种利用双链RNA（dsRNA）降解特定mRNA，从而抑制目标基因表达的技术。

本实验通过构建特定基因的RNA干扰载体，导入拟南芥，观察目标基因表达受抑制后的表型变化，以研究该基因在拟南芥生长发育过程中的功能。

三、实验材料1. 拟南芥野生型植株；2. 目标基因cDNA克隆；3. 载体pCAMBIA1300；4. 实验试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、pUC18载体、DNA分子量标准等；5. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、激光共聚焦显微镜等。

四、实验方法1. 目标基因cDNA克隆：利用PCR技术扩增目标基因cDNA，克隆到pUC18载体上，进行序列验证；2. RNA干扰载体构建：利用PCR和限制性内切酶技术，将目标基因cDNA克隆到载体pCAMBIA1300的RNAi表达框中，构建RNA干扰载体；3. 拟南芥转化：采用花序浸染法将RNA干扰载体导入拟南芥野生型植株；4. 表型观察：观察转化植株的生长发育状况，记录表型变化；5. 基因表达分析：采用RT-qPCR技术检测转化植株中目标基因mRNA表达水平的变化。

五、实验结果与分析1. 目标基因cDNA克隆：通过PCR和序列验证，成功克隆目标基因cDNA；2. RNA干扰载体构建：成功构建了RNA干扰载体，经测序验证无误；3. 拟南芥转化：成功转化拟南芥野生型植株，获得转化植株；4. 表型观察：转化植株在生长发育过程中出现表型变化，如叶片变小、生长缓慢等；5. 基因表达分析：RT-qPCR结果显示，转化植株中目标基因mRNA表达水平显著降低。

拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究

植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254Chinese Bulletin of Botany收稿日期：　２００５－１２－２０；　接受日期：　２００６－０３－０７基金项目：　科技部重大基础研究前期研究专项（９７３预研）　（２００３ＣＣＡ０１１００）＊　通讯作者　Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｚｎｙａｎｇ＠ｓｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．研究报告．拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究王鹏程１王晨１米华玲２周根余１杨仲南１＊（１上海师范大学生命与环境科学学院上海２００２３４）（２中国科学院上海植物生理生态研究所上海２０００３２）摘要生物信息学分析表明，　模式植物拟南芥叶绿体中含有大约４　０００多种蛋白质，　目前只分离得到１　０００多种，　其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。

本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白ＡＴ５Ｇ４８７９０进行了亚细胞定位研究。

我们克隆了该基因５＇端长１７８　ｂｐ的ＤＮＡ片段，　与绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因构建重组载体ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ。

转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察，　ＧＦＰ只在叶绿体中特异表达。

实验结果表明，　ＡＴ５Ｇ４８７９０的确为叶绿体蛋白。

本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。

关键词融合蛋白，　亚细胞定位，　转运肽Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein inArabidopsis thalianaＰｅｎｇｃｈｅｎｇ　Ｗａｎｇ１，　Ｃｈｅｎ　Ｗａｎｇ１，　Ｈｕａｌｉｎｇ　Ｍｉ２，　Ｇｅｎｙｕ　Ｚｈｏｕ１，　Ｚｈｏｎｇｎａｎ　Ｙａｎｇ１＊１（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２３４）２（Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ，　２０００３２）ＡｂｓｔｒａｃｔＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｈａｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ａｂｏｕｔ　４　０００　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ；　ｈｏｗｅｖｅｒ，　ｏｎｌｙａｂｏｕｔ　１　０００　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｖａｌｉｄａｔｅｄ．　Ｔｈｕｓ，　ｗｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｖｅｒｉｆｙｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ａｔ５ｇ４８７９０　ｗａｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ａｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ　１７８　ｂｐ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　５＇ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｆｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ＧＦＰ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｏｎ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｌａｓｅｒ－ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ　Ａｔ５ｇ４８７９０　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｃａｎ　ａｌｓｏ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉ－ｇａｔｅ　ｏｔｈｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ，　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器，　由叶绿体膜、类囊体和基质３部分构成，　其主要功能是进行光合作用，　另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成（Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２００１）。

STE20L4促进拟南芥下胚轴伸长的机制研究

热带作物学报2022, 43(6): 1144 1151Chinese Journal of Tropical CropsSTE20L4促进拟南芥下胚轴伸长的机制研究佘玉婷，丁勇*中国科学技术大学生命科学学院，安徽合肥 230027摘要：下胚轴伸长是高等植物进行正常生命活动的保障，下胚轴的伸长协助植株破土而出并由异养转变为自养生长。

本研究通过对一系列拟南芥突变体材料进行下胚轴观察，鉴定到一个具有短下胚轴的突变体ste20l4，并对其调控下胚轴伸长的分子机制进行初步探索。

结果表明：STE20L4编码与酵母中STE20同源的丝裂原活化蛋白激酶，在MAPK级联信号通路中作为MAP4K激活下游的MAP3K。

基因型鉴定和半定量结果显示，ste20l4-1、ste20l4-2均为功能缺失的突变体。

通过表型观察，ste20l4突变体无论在长日照（16 h光照/8 h黑暗）、短日照（8 h光照/16 h黑暗）及黑暗（24 h 黑暗）条件下与野生型相比均呈现出短的下胚轴。

细胞学结果显示，突变体ste20l4短的下胚轴是由于其细胞长度的变短而不是细胞数目的变化导致的。

植物激素赤霉素可促进下胚轴的伸长，对其处理的敏感性可作为是否参与GA信号转导途径的判断方法。

在不同梯度浓度的GA处理（0、0.5、1、2、5 µmol/L）下，ste20l4突变体与野生型相比下胚轴伸长作用不明显。

多效唑（PAC）是内源GA合成的抑制剂，随着不同梯度浓度的PAC处理（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 µmol/L），ste20l4突变体下胚轴伸长的抑制作用相对于野生型不明显。

上述生理学结果表明，STE20L4参与到GA信号转导通路中调控拟南芥下胚轴的生长发育。

将STE20L4蛋白与荧光标签融合后转染烟草或拟南芥原生质体观察其亚细胞定位，结果表明STE20L4在细胞膜和细胞质中均有表达。

对野生型、ste20l4突变体中进行一系列GA下游与下胚轴伸长相关基因的RT-qPCR检测，结果表明XTH17、EXP2、PRE1、PIF4、YUC2和SAUR19基因的转录水平在ste20l4突变体中明显下调，即STE20L4可能通过间接调控这些下游基因的表达参与下胚轴的伸长。

飞秒激光对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响

飞秒激光对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响
袁野;韩亚萍;马斯晗
【期刊名称】《哈尔滨师范大学自然科学学报》
【年(卷),期】2017(033)005
【摘要】以哥伦比亚野生型拟南芥种子为材料,利用波长800nm、频率1KHz的飞秒激光对其进行不同功率与时间的辐照处理.经MS组织培养后,统计其发芽率、根长、鲜重,测量叶绿素、可溶性糖、过氧化氢酶及丙二醛的含量,研究飞秒激光对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响.结果表明:低剂量的飞秒激光辐照能促进拟南芥种子萌发及幼苗的生长,当辐照功率为175 mW、辐照时间为12s时,拟南芥种子的发芽率、根长、鲜重、叶绿素、可溶性糖、过氧化氢含量均高于对照组,丙二醛含量低于对照组,此条件下的飞秒激光对拟南芥起促进作用.
【总页数】6页(P24-29)
【作者】袁野;韩亚萍;马斯晗
【作者单位】东北林业大学;东北林业大学;东北林业大学
【正文语种】中文
【中图分类】Q631
【相关文献】
1.NaCl胁迫对拟南芥种子萌发与幼苗生长的影响 [J], 鲁红侠;杨艳;朱小茜
2.葡萄糖对拟南芥种子萌发和幼苗生长的影响 [J], 宋玉伟;赵丽英;杨建伟
3.不同激素处理对拟南芥种子萌发和幼苗生长的影响 [J], 陆玉建;高春明;张婷婷;
钮松召
4.外源糖对拟南芥AtRGS1蛋白缺失突变体种子萌发及幼苗生长的影响 [J], 季芳芳;顾闽峰;陈云;郑佳秋;万林生
5.He-Ne激光处理对拟南芥种子萌发和幼苗生长特性的影响 [J], 李晓阳;陈慧泽;韩榕
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拟南芥子叶发育过程中叶绿体特征的量化及分布分析

求。目前，常用的成像仪器均匹配了专业的操控软件,不仅可以实现设备控制和图像采集，而且能够进行一定程度的图像处理和量化分析。但是，大部分软件均侧重于设备控制及采集参数的设置，而图像处理功能往往不能满足深度分析的需求。因此, 研究者们开发了一系列专业的图像处理及分析软件或模块，以实现对不同种类的数据进行图像识另U、优化、分割及分析等。常见的图像分析软件如 Bitplan 公司的 Imaris, Thermo Fisher 公司的 Avizo, 以及美国国立卫生研究院 (National Institute of Heath, NIH)开发的ImageJ等［9—10］,这些图像分析软件多侧重于数据优化、结构分析及图像展示等功能,对于细胞器分布性和连接度分析涉及较少。与之对应的是,SR-Tesseler作为一个基于泰森多边形分割算法的开源软件，能够根据细胞质心点的分布数据对图像进行快速、可靠的自动分割，并对细胞进行聚类分析W 因此，将图像量化分析软件与分布度分析软件联和应用，可以实现快速高效的多细胞特性分析曲2］。
马灵玉⑺,王广超▽,张曦W ,胡子建▽,沈微微W ,林金星］，2**
(1.北京林业大学林木分子设计育种高精尖创新中心，北京100083； 2.北京林业大学生物科学与技术学院，林木育种国家工程实验室，北京100083)
摘要拟南芥子叶发育过程中叶绿体的体积、面积和形状及分布等特征对于植株生长具有重要影响，但如何对萌发过程中细胞内叶绿体的体积、面积和形状等特征进行定量和分布的相关性分析仍然存在一定空白。本研究首先使用荧光显微镜获取不同萌发时期的子叶叶绿体的二维层扫图集，然后对图集进行优化及三维重构和叶绿体分割，并对叶绿体的体积、面积、及形状等特征进行量化分析，不仅获得不同尺寸、形状的叶绿体分布比例，而且将特征和分布进行四维可视化展示。此外，研究中还使用泰森多边形算法对不同属性的叶绿体进行聚类分析，进而得到不同类别的叶绿体在组织中的连接和分布信息。另外，本文通过电子显微镜成像方法，进一步确认了随着拟南芥子叶的生长，叶绿体的超微结构发生了显著变化，逐渐变大。该图像处理方法不仅能够快速识别细胞中叶绿体的不同特征及参数，还能够根据细胞中叶绿体的密度、面积、距离等特征参数对叶绿体的连接度和分布进行特异性分析，是一种功能强大且高效灵活的多细胞分析方法。关键词叶绿体成像；细胞参数；四维可视化；泰森多边形；图像处理中图分类号：Q334；Q336；TP317.4 文献标识码：A doi: 10. 3969/j.issn.l000-6281. 2021. 03. 009

植物活体成像实验报告

一、实验目的1. 了解植物活体成像技术的基本原理和操作方法。

2. 通过活体成像技术观察植物细胞在正常和逆境条件下的生理变化。

3. 掌握植物活体成像技术在研究植物生理学、分子生物学和遗传学等方面的应用。

二、实验原理植物活体成像技术是一种非破坏性、实时监测植物细胞生理活动的技术。

该技术利用荧光染料或荧光蛋白标记的细胞器，通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）等设备，对活体植物进行成像，从而观察细胞器在空间和时间上的动态变化。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗、30% PEG溶液、5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）溶液、GFP荧光素酶基因表达载体。

2. 实验仪器：激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）、荧光显微镜、培养箱、水培装置、移液器、超净工作台等。

四、实验方法1. 实验分组：将拟南芥幼苗分为对照组和PEG处理组，每组50株。

2. 5-ALA溶液处理：将5-ALA溶液稀释至1mg/mL，用移液器将溶液滴在拟南芥幼苗叶片上，处理时间为10分钟。

3. GFP荧光素酶基因表达载体转化：将GFP荧光素酶基因表达载体电转化至拟南芥幼苗中，培养至幼苗长至一定大小。

4. 实验分组：将转化成功的拟南芥幼苗分为正常组和PEG处理组，每组50株。

5. PEG处理：将PEG溶液稀释至30%，用移液器将溶液滴在拟南芥幼苗叶片上，处理时间为3小时。

6. 活体成像：将PEG处理后的拟南芥幼苗放入培养箱中，使用LSCM观察GFP荧光素酶基因表达载体在细胞中的表达情况，并记录图像。

五、实验结果与分析1. 5-ALA溶液处理后的拟南芥幼苗叶片出现绿色荧光，表明5-ALA成功进入叶片细胞，并转化为荧光素酶。

2. 在正常条件下，GFP荧光素酶基因表达载体在拟南芥幼苗细胞中均匀表达，荧光强度稳定。

3. 在PEG处理条件下，GFP荧光素酶基因表达载体在拟南芥幼苗细胞中的表达受到抑制，荧光强度减弱，表明植物在逆境条件下生理活动发生变化。

钙通道蛋白与植物抗盐性和抗冷性关系研究进展

钙通道蛋白与植物抗盐性和抗冷性关系研究进展宋唯一;郑爱珍;张正斌;刘福林【摘要】植物钙通道蛋白几乎在植物生长发育的所有阶段都是必需的,它们参与细胞内钙离子浓度的调控,在植物细胞内钙离子的跨膜转运过程中起着极其重要的作用;它们同时调控植物细胞和组织的极性生长,参与植物应对一系列不同逆境胁迫因素的适应性反应,在植物抗逆方面同样起着极其重要的作用.本文对近年来国内外有关不同钙通道蛋白的性质及其在植物抗冷性和抗盐性中的作用研究进展进行综述,为在生理水平和分子水平上深入阐明植物钙通道蛋白参与植物抗逆性的机理提供信息资料.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2010(030)011【总页数】7页(P2351-2357)【关键词】钙通道蛋白;抗冷性;抗盐性;抗逆性【作者】宋唯一;郑爱珍;张正斌;刘福林【作者单位】商丘师范学院,生命科学系,河南商丘,476000;商丘师范学院,生命科学系,河南商丘,476000;中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心,河北石家庄,050021;商丘师范学院,生命科学系,河南商丘,476000【正文语种】中文【中图分类】Q945.79Abstract:Plant calcium channel proteins are needed at almost all stages of plant growth and development. They participate in the regulation of intracellular Ca2+concentration,and play an important role in thetrans2membrane transport of Ca2+in plant cells.Meanwhile,plant calcium channel proteins not only regu2 late the polar growth of plant cells and tissues,and participate in plant adaptations to a serious of various stress factors,but also play an identically important role in plant stress resistance.In this paper,the charac2 teristics of calcium channel proteins and their roles in plant salt and cold resistance are mainly reviewed,so as to provide theoretical basis for the elucidation of the mechanism of calcium channel proteins involvement into plant stress resistance at both physiological and molecular levels.Key words:calcium channel protein;cold resistance;salt resistance;stress resistance钙通道蛋白存在于植物细胞质膜、内质网膜、叶绿体膜和核膜上。

利用激光共聚焦扫描显微镜对溃疡病菌侵染柑橘叶片的实时观察

第26卷第2期2017年4月激光生物学报ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol. 26 No. 2Apr. 2017doi：10. 3969/j. issn. 1007-7146. 2017.02. 009利用激光共聚焦扫描显微镜对溃疡病菌侵染柑橘叶片的实时观察赵亚，马先锋，肖翠，刘利平，李娜，邓子牛*(湖南农业大学园艺园林学院，国家柑橘改良中心长沙分中心，湖南长沙410128) m要：柑橘溃疡病对柑橘产业造成了巨大损失，而研究柑橘与溃疡病菌的互作关系以及柑橘的感病和抗病性均需要观察溃疡病菌在柑橘寄主中的侵染和定殖过程。

激光共聚焦扫描显微镜不仅可以观察活细胞，活组织的动态代谢过程，而且可以获得三维图像，对于病原菌在柑橘植物组织内的繁殖和致病机制研究具有重要意义。

但是，选择适宜的植物材料和制片方法对激光共聚焦扫描显微镜的观察效果影响很大。

本文对激光共聚焦扫描显微镜所观察的材料在其处理和观察方法上加以改进,获得了质量更好的图片和实验结果，也使得实验更为方便快捷。

激光共聚焦扫描显微观察还在瞬时表达分析中得到应用，提高了柑橘瞬时表达分析的效果。

通过将切片和压片相结合观察到溃疡病菌在不同时间点对柑橘叶片的侵染情况，而通过3D建模能观察到柑橘叶片不同组织层面中的病菌数量和病菌位置，为研究溃疡病菌在叶片中的定殖方式和人侵数量提供了前期基础。

关键词：激光共聚焦显微镜；柑橘溃疡病菌；人侵中图分类号：S182文献标志码：A文章编号= 1007-7146(2017)02 ~0143-08Real Time Observation of the Infection of Xanthomonas citri subsp.citri in Citrus Leaf by Using Confocal Laser Scanning MicroscopyZ H A O Y a，M A Xianfeng，X I A O Cu i，L I U Liping，LI N a，D E N G Ziniu*(Horticulture and Landscape College, National Center for Citrus Improvement Changsha, HunanAgricultural University, Changsha 410128, Hunan, China )Abstract： Citrus canker caused a huge losses to the citrus industry in our country, therefore, the observation of infection and colonization of the pathogen in citrus is indispensable to the research of interaction between citrus and Xanthomonas citri subsp. citri( Xcc) as well as the susceptibility and resistance of citrus. Confocal laser scanning microscopy can as well observe the dynamic metabolism of living cells and living tissues, it can obtain the 3-D image as well, it is of great significance to the study of the propagation and pathogenic mechanism of pathogenic bacteria in citrus tissues.However, the selection of appropriate tissue materials and production methods have great influence on the observation effect of observations. In this paper, the improvement of material handling and observing methods of confocal laser scanning microscopy was made to obtain better quality images and experimental results；By comparing the old and new two收稿日期=2016-12-13;修回日期：2017~03-01基金项目：国家自然科学基金（31572111)作者简介:赵亚（1990 -),女，硕士研究生，主要研究方向为果树遗传育种与生物技术。

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ＷＡＮＧＮｕａｎ，ＣＨＥＮＺｈｉ — Ｘｉｏｎｇ，ＵＵＸｉａｎｇ — Ｄｏｎｇ’ （￣ｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｔ，ｂ￣研ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ曰ｄ，ＳｏｕｔｈＣｈ／ｎａＡｇｒ／ｃｕ／ｍｍｌ，Ｇｕａｎｇ￣ｈｏｕ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ）
气孔是植物进行气体与水分交换的门户，对植物生长具有重要的作用。气孔的发生决定气孔的结构，而气孔的结构是其功能的基础。所以，研究气孔
育，目的是弄清其发生发育的真实形态变化，为进一步开展分子生物学研究提供依据。
１材料与方法
１．１材料
选取拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａ￣） “ Ｃｏｌｕｍｂｉａ ” 生态型种子在４ ℃ 条件下春化５ｄ后，先后用次氯酸钠溶液和７０％乙醇分别消毒５ｍｉｎ和２ｍｉｎ，无菌蒸馏水冲洗２次，将消毒后的种子接种到１／２ＭＳ培养基上，在２８ ℃光照培养箱中培养并萌发种子。取真叶为６— ９片幼苗的叶片用于ＣＬＳＭ观察。
中图分类号：Ｑ９４２．４文献标识码：Ａ文章编号：１０００・４７０Ｘ（２００７）０２・０１０９．０３
ＳｔｕｄｉｅｓｏｎＭｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＳｔｏｍａｔａＵｓｉｎｇＣｏｎｆｏｃａｌＬａｓｅｒＳｃａｎｎｉｎｇＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
ｗａｓａｄｏｐｔｅｄｎｄａｕａｇｒｄｃｅｌｓｗｅｅｒｅｅｓｎｃｌｅａｒｌｙ．ＩｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｈａｔｔＣＬＳＭｗａｓａｖｅｒｙｎｏｖｅｌｔｏｏｌｔｏｓｔｕｄｙｈｅｔ
武汉植物学研究２００７，２５（２）：１０９—１１１
ＪｏｕｒｎａｌＤ，ＷｕｈａｎＢｏｔａｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ
利用激光扫描共聚焦显微镜研究ห้องสมุดไป่ตู้ 南芥气孔发生与发育
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｌａｍｉｎａｓｔｏｍａｔａｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．
ｕｎｄｅｒＵＶｌａｓｅｒ（３５１ｎｍ）．Ｄｕｉｒｎｇｈｅｔｆｏｍａｒｔｉｏｎｏｆｓｔｏｍａａ，ｔｏｎｅｐｏｔｒｏｄｅｍａｒｌｃｅｌｌｐｒｏｄｕｃｅｄａｍｅｉｒｓｔｅｍｏｉｄ
ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ，ｇｕａｒｄｎｄａｅｐｉｄｅｒｍａｌｐａｖｅｍｅｎｔｃｅｌｌｓ，ａｎｄｈｅｔｉｒｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓｖａｒｉａｔｉｏｎｗｅｅｒｏｂｓｅｒｖｅｄｃｌｅａｒｌｙ
ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓｎｄａｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｆｏｌａｍｉａｎｓｔｏｍａａ．ｔ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ；Ｓｔｏｍａａ；Ｃｔｏｎｆｏｃｌａｌａｓｅｒｃａｓｎｎｉｎｇｍｉｃｏｓｒｃｏｐｅ（ＣＬＳＭ）
．
ｇｕｒｄａｃｅｌｓｃｏｕｌｄ
ｎｏｔｅｍｉｔｌｆｕｏｅｓｒｃｅｎｃｅｕｎｄｅｒＵＶｌａｓｅｒ（３５１ａｍ）．Ｓｏｂｌｕｅｌａｓｅｒ（４８８ｎｍ）ｗｉｈｔｓａｉｔｎｉｎｇｂｙｌｆｕｏｅｓｒｃｅｉｎ
汪暖，陈志雄，刘向东 ’
（华南农业大学广东省植物分子育种重点实验室，广州５１０６４２）
摘
要：通过激光扫描共聚焦显微镜，利用不同种类（波长）的激光研究拟南芥叶片气孔发生与发育。结果表明，
利用紫外激光（３５１砌）扫描可以清楚观察到拟南芥表皮各种细胞及其发生发育的形态变化，包括表皮毛细胞、副
ｎｄａｓｕｂｓｉｄｉａｒｙｃｅｌｓｂｙａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｄｉｖｉｓｉｏｎ，ｆｏｌｏｗｅｄｂｙｈｅｔｆｏｍａｒｔｉｏｎｏｆｕａｇｒｄｍｏｈｅｔｒｃｅｌ，ｗｈｉｃｈｂｅｃａｍｅ
ｕｓｉｎｇｃｏｎｆｏｃｌａｌａｓｅｒｓｃｎｎａｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ｒＩ１ｌｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｌｌｔｙｐｅｓｏｆｃｅｌｌｓ，ｓｕｃｈａｓｔｒｉｃｈｏｍｅｓ，
的发生过程对于进一步开展其调控的分子机理具有重要的意义 ¨ Ｊ。拟南芥是双子叶的模式植物，已有对其气孔发生发育的研究主要是采用固定的叶片通过光学显微镜和电子显微镜［３ ’ ４进行的。目前，尚未见到
直接利用活体材料通过激光扫描共聚焦显微镜（ｃｏｎｆｏｃｌａｌａｓｅｒｃａｓｎｎｉｎｇｉｃｍｏｓｒｃｏｅ，ｐ简称ＣＬｓＭ，下
ｔｗｏｕａｇｒｄｃｅｌｓ．Ｓｔｏｍａａｔｗｅｒｅｔｅｒｍｉｎａｌｌｙｄｉｆｅｅｎｒｉａｔｔｅｄ．Ａｆｔｅｒｈｅｔｆｏｍａｒｔｉｏｎｏｆｓｔｏｍａａｔ
１．２方法
同）观察拟南芥叶表皮形态和气孔发生发育的报道。我们拟利用拟南芥的活体叶片，通过ＣＬＳＭ采用紫外和蓝光两种波长的激光研究气孔的发生发
选取拟南芥叶片，上表皮朝上（以获取上表皮
收稿日期ｔ２００６ — １０－０５，修回日期：２ＯＯ６ — １１－３０。基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０２７０８１４）；教育部 “ 高校青年教师奖 ” （２００２３８３）资助。作者简介：汪暖（１９８２一），女，浙江金华人，在读硕士生，从事种质创新及细胞学研究；刘向东（１９６５一），男，教授，博导。・通讯作者（Ｅ — ｍａｉｌ：ｘｄｌｉｕ＠８ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）。
卫细胞、保卫细胞、铺垫表皮细胞等。气孔发生过程中，首先原表皮细胞不对称分裂产生拟分生组织和副卫细胞，
接着分化出保卫细胞母细胞，进一步发育形成保卫细胞，最终形成气孔器。气孔分化完成后，保卫细胞在紫外激光下不产生荧光，但利用蓝光激发（４８８砌）辅助荧光素染色，可清晰地看到保卫细胞。结果表明，激光扫描共聚焦显微镜在拟南芥叶表皮细胞形态研究上有独特的功能。关键词：拟南芥；气孔；激光扫描共聚焦显微镜