关于RNA提取的一些问题

问题：1 RNA提取的时候怎么样有效的避免DNA的污染？

2 RNA提取后在-20放置，可保存多久？

3 大家用的trizol是自己配的还是买的？

答案一：1、在提取过程增加DNase消化步骤。除使用酶消化外的方法去DNA都不是很彻底。视后续实验而定。

2、如有条件最好放-80保存。主要担心是如果提得不纯（有杂质或未完全灭活的RNase）在-20度保存过程中降解。且这个保存时间跟物种、提取方法等有关。尝试过有些物种的RNA放-20度保存一个月后出现降解的情况（未知是提得不纯或物种原因）

3、实验要求不高可以自己配点Trizol来提，如果重要的实验建议还是购买invitrogen 的。

答案二：我之前提取过RNA,鼠肺组织的，关键是避免污染，所用TRIZOL买的是天根试剂公司的，感觉还可以，当然跟你的提取方法还有所用材料有关。提完最好放-80保存，可以存放久一点。至于用DNA酶处理我没有使用，提取质量还可以。

答案三、在提取RNA时最好所用的所有器械都要经过DEPC水过夜处理，实验平台和仪器不能和做NDA的混用，最好要有专用的RNA操作实验平台

答案四、动作要快，避免空气中，皮肤中以及呼吸中的RNA酶。加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。组织样品应保持新鲜。RNA样品长时间反复使用可以-20保存，但是易降解。建议分装小管后保存-80。Trizol试剂购自Takara公司

答案五、我们实验室一般都是把提取的RNA逆转成cDNA后，在放在-80°C，这样可以保存的久一点；Trizol是Takara公司的。

答案六、同意5楼观点，逆转录成cDNA再保存方便一点，有条件的话当然是买现成的，RNA酶处理过的枪头，trizol的话目的有二，一是抑制RNA酶的活性，二是使蛋白质变性并溶解，里面成分的量会对效果有影响，而且既然是能使蛋白变性的东西，对人体也是有毒的，所以能买尽量买吧。

答案七、1.RNA提取注意事项很多，但都是一个目的：放置降解和杂质干扰，特别是降解。相关仪器的DEPC处理自不必说，还有操作台面以及移液器的75%乙醇擦拭、研钵的180度处理，再就是操作者的口罩手套防护，操作过程的低温保持等等。

2. 提取的RNA我从来不放到-20度，除非几分钟之后马上进行下面的操作，避免反复冻融。倒是有一次一个同学勿放到-20度约一个月，基本不能用了。

3. Trizol都是买的，一直用的宝生物，好像很可以。

答案八、我们提RNA时用的离心管都是买的经过DEPC睡处理后无RNA酶的，在生物通风柜中戴口罩手套进行操作，trizol是买的Takara公司的。RNA提取出来后一般都不直接这样子保存在-20，都是反转录成cDNA后保存在-80里的。

答案八、Takara公司的Trizol就没问题，按步骤提取即可，液氮速冻存于-80℃。所有用具需用depc水处理。多操作几次就好了，没必要着急。

TRIZOL法提取RNA的具体步骤：

1、在提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。

2、将组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；在EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟。

3、取上层水相置于新EP管中,按照每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟。

4、按照每1mlTRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用Rnase-free water溶解RNA沉淀。Ps:在收集到生物材料之后，最好马上进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

想请教用过Trizol法提取RNA，且结果比较理想的详细步骤及注意事项，是否可以共享一下？

我这边刚好在做，给你说下：

贴壁细胞的话去培养液，PBS洗一遍，加Trizol吹打下来。组织的话，在液氮里面捣碎，然后粉末放进Trizol,用超声粉碎器粉碎（超声每3秒，停10秒冷却，直到看不见组织碎末）。（此步骤可以-80oC冻存，下面可以以后再做）

每1毫升Trizol加200微升氯仿（氯仿需饱和，可以在氯仿加一两公分高的水层，摇晃后静置分层，用时到下层取氯仿）

使出吃奶的劲把Trizol氯仿混合液摇成浑浊的乳液，每个样起码狂摇30秒（用手拿着，不能用漩涡混匀器）

静置3分钟，分层，进4度离心机，14000转15-30分钟。

取上层无色清澈液体，进新管。枪尖绝对不能贴壁，绝对不能碰触到极薄的乳白固态中间层，绝对不能吸到下层的红色液体。假定是1毫升Trizol200微升氯仿的量，你这里取个400-500微升就可以偷笑了，千万别贪心，造成污染。

加相等体积异丙醇，倒置数次混匀，不用太激烈。

（次步骤又可以-80oC冻存，下面可以以后再做）

进4度离心机，14000转10分钟，这个时候可以看见小沉淀物了，白色，看不见的话，产量就悲剧了。。。

弃上清，用1毫升75%酒精洗两次（加酒精，手摇看到沉淀物游来游去就可以了，然后离心弃上清）酒精尽量吸干净，但枪尖不要碰到沉淀物。

盖子打开，在通风橱里面晾干（一般5-10分钟。看到沉淀物从白色变半透明就赶快停了，干过头了等下难以溶解）

加干净的水（没有核酸酶的，你懂的）10-50微升依你产量而定啦。55oC水浴5-10分钟充分溶解。

大功告成，可以测浓度和各项指标，分装，冻存了。

如果需要用DNAse去DNA，加在异丙醇步骤前即可。