免疫学检验-免疫电泳技术PPT优选课件

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３.四甲基异硫氰酸罗丹明 （tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC） 其最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光。荧光效率亦较低，但因其 荧光猝灭速度慢，除作衬染外，也可单独采用。
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２.四乙基罗丹明（rhodanune，RB200）为橘红色 粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定， 可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射 光波长为595－600nm，呈橘红色荧光。可与FITC 的翠绿色荧光形成鲜明的对比，常用于双重标记或 对比染色。但荧光效率较低。
第七章 免疫电泳技术
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对流免疫电泳
（counter immunoelectrophoresis,CIEP）,原 理是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免 疫扩散技术，其在pH8.4以上的缓冲液中，大部分 蛋白质抗原成分带负电，在电场中向正极移动；而 作为抗体的IgG因其分子量大，暴露的极性基因较少， 解离也少，在电场中亦向正极缓慢移动，但电渗引 向负极移动的液流速度超过了lgG向正极的移动，带 动抗体移向负极,在抗原抗体最适比处形成乳白色沉 淀线，这就是电渗所致的IgG呈反向负极倒退。
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火箭免疫电泳
火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis， RIE）技术是将单向免疫扩散与电泳相结合的一项 检测技术。
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火箭电泳操作时应注意以下几点： １.所用琼脂要选择无电渗或电渗很小的，否则火箭 形状不规则。 ２.注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清晰的 云雾状或圆形皆提示未达终点。 ３.标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并 开启电源（电流要小）后再加样。否则易形成宽底 峰形，使定量不准。
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第九章 荧光免疫技术
荧光免疫技术（fluoroimmnoassay）是将免疫 学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一 种方法，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方 法。
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荧光物质
（一）荧光色素 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用做
荧光色素。只有那些能产生明显荧光的有机化合物 才能作为荧光色素。
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常用的荧光色素有： １.异硫氰酸荧光素（fluoresceln isothiocya－nate，
FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶 剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490－495nm， 最大发射光波长520－530nm，可呈现明亮的黄绿色荧 光。有两种同分异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定 性、与蛋白质的结合力等方面都更加良好，在冷暗干燥 处可保存多年。FITC是应用最广泛的荧光素。其主要优 点在于：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常标本中的绿 色荧光较少，有利于降低背景干扰。
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４.藻红蛋白（R-RE）是红藻和绿藻中一类被称为 藻蛋白（phycoblliprotein）家族中的一员，与 光合作用有关。其分子量为240000。其最强吸收 光波长为565nm，最大发射光波长为578nm。它 在488nm处的光吸收率为565nm处（最大的）的 75％。因此R-RE可以有效地与FITC一起用于双色 免疫荧光染色，因为它们可以共用488nm激发光。
（1）隔热滤板：能阻断红外线的透过而隔 热。它安装在灯室聚光镜的前面。
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（2）激光滤板：能选择性地透过紫外线可 见波长的光域，以激发荧光色素。激发滤 光片有两种，UG为紫外光滤片，只允许波 长275－400nm的紫外光通过，最大透光 度在365nm。BG为蓝紫外光滤片，只允许 波长325－500nm的蓝紫外光通过，最大 透光度为410nm。
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４.作IgG定量时，由于抗原和抗体的性质相同，火 箭峰因电渗呈纺锤状。为了纠正这种现象，可用 甲醛与IgG上的氨基结合（甲酸化），使本来带 两性电荷的IgG变为只带负电荷，加快了电泳速 度，抵消了电渗作用，而出现伸向阳极的火箭峰。
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免疫电泳
免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）技术， 是区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫化学分析技 术。检测原理是将待测样品置于琼脂糖凝胶上进行电泳， 样品中各蛋白质成分因分子量及电泳迁移率不同，被分 离成肉眼不可见的若干区带。停止电泳后，沿与电泳方 向平行的两侧开槽并加入抗血清。置室温或37℃使两者 扩散，经18－24小时后，各区带蛋白在相应位置与抗体 反应形成弧形沉淀线。抗原含量越多，则反应沉淀线越 接近抗体槽，形成的沉淀弧线较粗，反之，则形成的沉 淀线较细。
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以此可作细微的蛋白质组分分析。根据各蛋白 所处的电泳位置，将沉淀弧的位置、形态与已知标 准抗原、抗体生成的沉淀弧进行比较，可分析待测 样品中所含成分的种类及性质、例如，多发性骨髓 瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白 沉淀弧，而其他类型的免疫球蛋白形成的沉淀弧可 明显细、短于对照沉淀弧（图7－4）。
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免疫固定电泳
免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis， IFE）是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。 Alfonso在1964年第一个报道了免疫固定技术 （IFE），1969年Alper与Johson相继报道了IFE在 铜蓝蛋白、lgG基因的多态性检测和C3激活后分子 转变中的应用
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荧光免疫分析常用的仪器和设备
（一）荧光显微镜 荧光显微镜是荧光显微技术的基本工具。其主
要结构与普通光学显微镜基本相同，与普通显微镜 不同之处在于光源、滤板以及不吸收紫外线的聚光 器和镜头等。 １.光源
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பைடு நூலகம்
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２.滤板 滤板的作用在于隔热、选择适宜的激发
光及选择适宜的检测光。按其作用分为隔热 滤板、激发滤板及吸收滤板。