免疫学检验-免疫电泳技术PPT优选课件
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免疫电泳技术精品PPT课件
即：单扩+电泳
用途：定量抗原 优点：快 缺点：影响因素多，不常用
三）免疫电泳
（immunoelectrophoresis，IEP）
即：电泳后进行双相琼脂扩散 实验
用途：定性实验，主要用于纯 化抗原和抗体成分的分析及正 常和异常免疫球蛋白的识别和 鉴定。
四）免疫固定电泳
（immunofixation electrophoresis）
即：区带电泳+沉淀反应
用途：常用于M蛋白的鉴定与分型
学习总结
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
You Know, The More Powerful You Will Be
免疫电泳技术
Immunoelectrophoresis technique
一、基本原理 二、类型 一）对流免疫电泳
（counter immunoelectrophoresis，CIEP）
即双扩+电泳技术 用途：同双扩 优点：快、敏感性高 缺点：分辨力低
二）火箭免resis，RIE）
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
用途：定量抗原 优点：快 缺点：影响因素多，不常用
三）免疫电泳
（immunoelectrophoresis，IEP）
即：电泳后进行双相琼脂扩散 实验
用途：定性实验，主要用于纯 化抗原和抗体成分的分析及正 常和异常免疫球蛋白的识别和 鉴定。
四）免疫固定电泳
（immunofixation electrophoresis）
即：区带电泳+沉淀反应
用途：常用于M蛋白的鉴定与分型
学习总结
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
You Know, The More Powerful You Will Be
免疫电泳技术
Immunoelectrophoresis technique
一、基本原理 二、类型 一）对流免疫电泳
（counter immunoelectrophoresis，CIEP）
即双扩+电泳技术 用途：同双扩 优点：快、敏感性高 缺点：分辨力低
二）火箭免resis，RIE）
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
免疫学检测技术(课堂PPT)
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36
一、凝聚反应(Agglutination)
二、沉淀反应
1、溶液中的沉淀反应
2、凝胶扩散沉淀
3、免疫电泳Biblioteka 血清免疫电泳火箭电泳
对流免疫电泳
三、补体参与的反应
四、免疫标记的抗原抗体技术
酶联免疫吸附（ELISA）
.
37
一、凝集反应
凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合 反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整 的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在 一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称 为凝集原，抗体称为凝集素。
. Equivalence – Lattice formatio6 n
抗原或抗体检测原理
.
7
• 免疫学（Immunology）：
是研究抗原性物质、免疫系统、免疫应 答的规律及免疫应答的调节的一门科学。
• 免疫的定义（Immunity）：免疫是机体识 别自我与非自我的过程。排除异己，维护 自身稳定的生理反应。
体细胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响，使
细胞发生癌变，形成肿瘤等，机体可识别、清除这些
细胞，这是免疫系统的第三个功能。当这一功能低下
或失调时，会导致肿瘤或癌. 症。
9
抗原 （Antigen）
抗原概念 凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，
并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生 反应的物质。
亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强。
自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体 蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白
2. 大分子胶体：一般在10 kD以上 。
3. 具有复杂的立体结构或空间构象.
如明胶分子量虽然为100 kD，但结构简单，免疫原性差。
免疫学实验 对流免疫电泳 (2)
电泳
将加好样品的板置于电泳槽上，抗原孔置 负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分 别用四层纱布与0.05mol/L、PH8.6的缓 冲液相连，接通电源。电流以玻片的宽度 计算，为4mA/cm；电压以玻片的长度计 算，为6V/cm；通电30-60min后，切断 电源，观察结果
结果和讨论
将玻片对着光，先观察AFP阳性血清孔与 抗体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待 检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出 现，如有沉淀线，则表示AFP试验阳性， 否则AFP试验为阴性。如沉淀线不清晰， 可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电 泳槽过夜再观察。
免疫电泳技术
免疫电泳技术
是将电泳与免疫扩散相结合的一种常 用的免疫学实验方法 。
沉淀反应
是可溶性抗原与相应抗体在适当 条件下发生特异性结合所出现的沉 淀现象。
分类
絮状沉淀试验 液体内沉淀试验 环状沉淀试验
沉
免疫浊度测定
淀
ห้องสมุดไป่ตู้
反 应
单向琼脂扩散试验 免疫扩散
双向琼脂扩散试验
凝胶内沉淀试验
免疫电泳
火箭免疫电泳 对流免疫电泳
注意事项
1. 电泳时电流不宜过大，以免蛋白质变性。
2. 抗原、抗体的电极方向不能放反。
3. 电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳 时间越长。
4.抗原抗体浓度的比例：当抗原抗体比例不适合时， 均不能出现明显可见的沉淀线。抗原太浓太稀时 都不易出现沉淀线。所以除了应用高效价的血清 外，每份待测样品均可做几个不同的稀释度来进 行检查。
思考题
抗原、抗体的电极反向放反了，会出现什 么结果？？
为什么对流免疫电泳试验的敏感性要比双 向扩散高8-10倍？
在电泳过程中，可见抗原抗体孔均出现色 带泳向阳极，为什么？
实验十一免疫电泳
免疫电泳技术将可溶性抗原（如人血清蛋白）与相应抗体（如兔抗人血清的抗体）混合，当两者比例合适并有电解质（如氯化钠、磷酸盐等）存在时，即有抗原-抗体复合物的出现，此为沉淀反应。
如以琼脂凝胶为支持介质，则在凝胶中出现可见的沉淀线、沉淀弧或沉淀峰。
根据沉淀的出现与否及沉淀量的多寡，可定性、定量地检测出样品中抗原或抗体的存在和含量，免疫学的一些测定方法即基于此特性。
抗原与抗体的结合在沉淀反应中，呈一定的分子比例。
不同抗原和抗体之间的分子比例是不同的，但只有在分子比例合适时，才出现可见的沉淀。
所以沉淀能否出现并不完全反映抗原和抗体是否存在和发生结合。
抗原结合多个抗体分子，称抗原为多价；抗体一般只能结合两个抗原分子（IgM类抗体分子通常可以结合5个抗原分子）的抗原决定法簇，故为二价。
只有在彼此的结合价饱和时，才出现大量的抗原-抗体复合物沉淀。
当抗原与抗体的比例合适时，即二者结合价彼此饱和，就可形成网状结构的大分子抗原-抗体复合物沉淀，称为等价带。
若比例不合适时，抗体或抗原过量，则虽有抗原、抗体的结合，但不能大量形成网状结构的大分子复合物，沉淀量很少，甚至不出现沉淀。
在抗原、抗体数量关系曲线中，抗体过剩区域称为抗体过剩带，抗原过剩区域称为抗原过剩带。
如图1所示，在等价带的反应液中加入过量的抗原或抗体，沉淀复合物就会有部分溶解，甚至全部溶解的现象。
这是由于新加入的抗原或抗体竞争地结合相应的抗体或抗原，使网状大分子结构破坏，形成小分子复合物，致使沉淀出现溶解，沉淀量减少甚至完全消失。
在沉淀反应中，由于抗原过量而不出现沉淀的现象，称为前带现象。
此时不能误认为无沉淀就是无抗原存在，为了检测就必须稀释抗原。
抗体过量时，称为后带现象，同理需要稀释抗体进行检测。
图1的位置抗原与抗体的结合是依赖于两者分子结构的互补性，故其特异性高。
这种结合也是相当稳定的。
在一定条件下（过酸、过碱或浓盐存在下），二者可以分开，即结合是可逆的。
免疫电泳详细教程培训ppt课件
n 如果实验对敏感性没有特殊的要求，并且如果不 是要检测半抗原，可以考虑这些经典免疫沉淀方 法。它们操作简单，并且不会造成大量的物质消 耗，不需要昂贵的ELISA等仪器。
免疫电泳详细教程
14
7.2当今的免疫沉淀
n 免疫沉淀现在更多的被用作一种分析方法。利用 该技术，细胞大家族里面的某些特定抗原能够被 检测出来。
n 另外，单克隆抗体的抗原特异性也可以用免疫沉 淀的方法来测得。利用现代免疫技术，不需要考 虑抗原表位与抗体互补位间的平衡，而这在传统 方法里是相当重要的。抗体通常被加到过量的抗 原中。另外单克隆抗体也可以用此方法。因为抗 体被交联到了一个固定相上，如琼脂糖凝胶，免 疫沉淀复合物可以通过简单的离心而分离，然后 便可以对其进行分析。
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7.1.4.1简单免疫电泳
n 简单免疫电泳只追求单纯的定性分析。它 尤其适用于在复杂样品中同时检测多种抗 原。对抗原的分离是基于其电荷的差异， 因此该技术提供了更好的解决方法。因为 抗原在免疫电泳的过程中扩散占用了较大 的空间，所以它的灵敏性不是太高。
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2
n 将抗原溶液加入到加样槽中，在电流作用 下电泳分离过程就开始了。根据分子所带 净电荷的不同，分子量大小的差异，在琼 脂糖凝胶中进行电泳时分子的迁移速率和 方向也不同，这样电泳就会将不同抗原分 子在琼脂糖凝胶中分离成若干区带。然后 与电泳方向平行挖一小槽，加入抗血清( 含抗体)，通过免疫扩散，抗体与已经分 离的抗原在琼脂糖凝胶中双向扩散，二者 特异性结合在比例合适处形成弧形沉淀线。
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8
免疫电泳详细教程
9
n 利用胶中连续的抗体浓度，峰的最大高度是和提 供的抗原的浓度呈比例的。根据已知浓度的各种 标准抗原，交叉免疫电泳可以定性和定量的分析 抗原。
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7.2当今的免疫沉淀
n 免疫沉淀现在更多的被用作一种分析方法。利用 该技术，细胞大家族里面的某些特定抗原能够被 检测出来。
n 另外，单克隆抗体的抗原特异性也可以用免疫沉 淀的方法来测得。利用现代免疫技术，不需要考 虑抗原表位与抗体互补位间的平衡，而这在传统 方法里是相当重要的。抗体通常被加到过量的抗 原中。另外单克隆抗体也可以用此方法。因为抗 体被交联到了一个固定相上，如琼脂糖凝胶，免 疫沉淀复合物可以通过简单的离心而分离，然后 便可以对其进行分析。
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7.1.4.1简单免疫电泳
n 简单免疫电泳只追求单纯的定性分析。它 尤其适用于在复杂样品中同时检测多种抗 原。对抗原的分离是基于其电荷的差异， 因此该技术提供了更好的解决方法。因为 抗原在免疫电泳的过程中扩散占用了较大 的空间，所以它的灵敏性不是太高。
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2
n 将抗原溶液加入到加样槽中，在电流作用 下电泳分离过程就开始了。根据分子所带 净电荷的不同，分子量大小的差异，在琼 脂糖凝胶中进行电泳时分子的迁移速率和 方向也不同，这样电泳就会将不同抗原分 子在琼脂糖凝胶中分离成若干区带。然后 与电泳方向平行挖一小槽，加入抗血清( 含抗体)，通过免疫扩散，抗体与已经分 离的抗原在琼脂糖凝胶中双向扩散，二者 特异性结合在比例合适处形成弧形沉淀线。
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9
n 利用胶中连续的抗体浓度，峰的最大高度是和提 供的抗原的浓度呈比例的。根据已知浓度的各种 标准抗原，交叉免疫电泳可以定性和定量的分析 抗原。
临床常用免疫学检验方法PPT(21张)
•
3、大概是没有了当初那种毫无顾虑的勇气，才变成现在所谓成熟稳重的样子。
•
4、世界上只有想不通的人，没有走不通的路。将帅的坚强意志，就像城市主要街道汇集点上的方尖碑一样，在军事艺术中占有十分突出的地位。
•
5、世上最美好的事是：我已经长大，父母还未老;我有能力报答，父母仍然健康。
•
6、没什么可怕的，大家都一样，在试探中不断前行。
糖脂类P460-461
癌抗原50（cancer antigen 50, CA-50) 癌抗原72-4（cancer antigen 72-4, CA72-4) 糖链抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9,
CA19-9) 癌抗原242（carbohydrate antigen 242, CA242)
临床常用免疫学检
验
西南医院检验 科
府伟 灵
要 求 了解常用免疫学检验方法
熟练掌握常用免疫学指标的临床意义
能根据诊断需要准确选用免疫学指标
能准确解读临床免疫学检验报告
免疫学检验技 免疫沉术淀技术
免疫电泳技术 酶联免疫测定 放射免疫分析 化学发光免疫测定 其他免疫细胞活性与数量测定技术
免疫球蛋白 IgA、IgG、IgM 免疫比浊法
IgE
IgE
免疫发光
血清补体检测
P442-443
缺乏特异性诊断意义，主要用于 机体体液免疫功能状态的评估。
临床检验现状：
感染性疾病的免疫学诊断
在《临床病原体检查》 中讲述。
肿瘤标志物检测
P458-462
肿瘤标志物（tumor marker)：P458
在肿瘤发生、发展过程中，由肿瘤细 胞合成、释放的物质或由机体对肿瘤发 生反应而产生的一类物质；与正常组织 相比，这些物质在机体内的含量显著增 高；检测这些物质可以反映肿瘤的恶变 阶段和肿瘤的基因型。
电泳技术PPT课件2
医用检验技术及应用
电泳技术
第六节 免疫电泳
• 火箭免疫电泳(RIE)
图 6-16 Laurell 技术示意图及火箭免疫电泳图谱 Ag：抗原；1、2、3为待测标本；4、5、6为标准
医用检验技术及应用
电泳技术
第六节 免疫电泳
• 火箭免疫电泳(RIE)－－检验医学中的应用
– 火箭电泳放射自显影定量甲胎蛋白
医用检验技术及应用
电泳技术
第三节 SDS-PAGE电泳
• 检验医学中的应用－－非浓缩尿蛋白电泳
图 6-7 非浓缩尿蛋白电泳 示意图
医用检验技术及应用
电泳技术
第三节 SDS-PAGE电泳
• 检验医学中的应用－－非浓缩尿蛋白电泳
图 6-8 临床常见蛋白尿电泳图谱 左：肾小球性蛋白尿； 中：肾小管性蛋白尿，泳道4示混合性蛋白尿，肾小管性蛋白尿为主型； 右：混合型蛋白尿
电泳技术
第七节 高效毛细管电泳技术
• 基本原理
电渗流
蛋白泳动
－ 电流
+
检测器 －
缓冲液
温度控制器
+
电源
泳动
缓冲液
图 6-23 高效毛细管电泳原理图
医用检验技术及应用
电泳技术
第七节 高效毛细管电泳技术
• 高效毛细管电泳的分离模式
– 毛细管区带电泳 (capillary zone electrophoresis, CZE) – 毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis, CGE） – 胶束电动力学毛细管色谱（micellar electrokinetic capillary
医用检验技术及应用
电泳技术
第六节 免疫电泳
7第七章 免疫电泳技术
第七章免疫电泳技术本章考点1.概述2.免疫电泳技术3.应用免疫电泳技术是根据抗原及抗体反应的高度特异性，电泳技术的高分辨力和具有微量、快速的特点，将凝胶内电泳与免疫扩散相结合的一项免疫学技术。
第一节基本原理一、原理免疫电泳技术实质上是在直流电场作用下的凝胶扩散试验。
它的原理是将凝胶扩散置于直流电场中，在一定的条件下，抗原及抗体离解成为带正电或负电的电子，在电场中向异相电荷的电极移动，所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越快，反之则慢。
由于电流加速了抗原、抗体的运行速度，缩短了两者结合的时间，加快了沉淀现象的产生。
当有多种带电荷的物质电泳时，由于静电荷不同，而区分成不同区带，使抗原决定簇不同的成分得以区分。
影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗等。
二、电解质和蛋白质的电离特性、电泳迁移率、电渗蛋白质的基本单位是氨基酸，在水溶液中具有两性电离特性，当缓冲液pH与蛋白质等电点（PI）相当时呈电中性，无电泳迁移性；缓冲液pH大于蛋白质等电点（PI）时带正电荷，向阴极端移动；缓冲液pH小于蛋白质等电点（PI）时带负电荷，向阳极端移动。
在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内的移动距离称电泳迁移率。
在电场中液体对固体可出现相对移动，产生电渗现象。
电渗不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置。
影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗。
三、常用载体有琼脂和琼脂糖凝胶。
其特点是提高了敏感性及反应速度，并可将带电性不同的组分区分开。
第二节常用技术免疫电泳常用技术有：1.对流免疫电泳：对流免疫电泳原理是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。
在琼脂板上打两排孔，左侧各加入待测抗原，右侧孔内加入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。
通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。
本法敏感度比双向扩散试验高8～16倍。
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第七章 免疫电泳技术
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2020/10/18
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对流免疫电泳
（counter immunoelectrophoresis,CIEP）,原 理是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免 疫扩散技术，其在pH8.4以上的缓冲液中，大部分 蛋白质抗原成分带负电，在电场中向正极移动；而 作为抗体的IgG因其分子量大，暴露的极性基因较少， 解离也少，在电场中亦向正极缓慢移动，但电渗引 向负极移动的液流速度超过了lgG向正极的移动，带 动抗体移向负极,在抗原抗体最适比处形成乳白色沉 淀线，这就是电渗所致的IgG呈反向负极倒退。
2020/hodanune，RB200）为橘红色 粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定， 可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射 光波长为595－600nm，呈橘红色荧光。可与FITC 的翠绿色荧光形成鲜明的对比，常用于双重标记或 对比染色。但荧光效率较低。
15
４.藻红蛋白（R-RE）是红藻和绿藻中一类被称为 藻蛋白（phycoblliprotein）家族中的一员，与 光合作用有关。其分子量为240000。其最强吸收 光波长为565nm，最大发射光波长为578nm。它 在488nm处的光吸收率为565nm处（最大的）的 75％。因此R-RE可以有效地与FITC一起用于双色 免疫荧光染色，因为它们可以共用488nm激发光。
2020/10/18
2
2020/10/18
3
火箭免疫电泳
火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis， RIE）技术是将单向免疫扩散与电泳相结合的一项 检测技术。
2020/10/18
4
火箭电泳操作时应注意以下几点： １.所用琼脂要选择无电渗或电渗很小的，否则火箭 形状不规则。 ２.注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清晰的 云雾状或圆形皆提示未达终点。 ３.标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并 开启电源（电流要小）后再加样。否则易形成宽底 峰形，使定量不准。
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以此可作细微的蛋白质组分分析。根据各蛋白 所处的电泳位置，将沉淀弧的位置、形态与已知标 准抗原、抗体生成的沉淀弧进行比较，可分析待测 样品中所含成分的种类及性质、例如，多发性骨髓 瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白 沉淀弧，而其他类型的免疫球蛋白形成的沉淀弧可 明显细、短于对照沉淀弧（图7－4）。
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9
免疫固定电泳
免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis， IFE）是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。 Alfonso在1964年第一个报道了免疫固定技术 （IFE），1969年Alper与Johson相继报道了IFE在 铜蓝蛋白、lgG基因的多态性检测和C3激活后分子 转变中的应用
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5
４.作IgG定量时，由于抗原和抗体的性质相同，火 箭峰因电渗呈纺锤状。为了纠正这种现象，可用 甲醛与IgG上的氨基结合（甲酸化），使本来带 两性电荷的IgG变为只带负电荷，加快了电泳速 度，抵消了电渗作用，而出现伸向阳极的火箭峰。
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6
免疫电泳
免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）技术， 是区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫化学分析技 术。检测原理是将待测样品置于琼脂糖凝胶上进行电泳， 样品中各蛋白质成分因分子量及电泳迁移率不同，被分 离成肉眼不可见的若干区带。停止电泳后，沿与电泳方 向平行的两侧开槽并加入抗血清。置室温或37℃使两者 扩散，经18－24小时后，各区带蛋白在相应位置与抗体 反应形成弧形沉淀线。抗原含量越多，则反应沉淀线越 接近抗体槽，形成的沉淀弧线较粗，反之，则形成的沉 淀线较细。
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荧光免疫分析常用的仪器和设备
（一）荧光显微镜 荧光显微镜是荧光显微技术的基本工具。其主
要结构与普通光学显微镜基本相同，与普通显微镜 不同之处在于光源、滤板以及不吸收紫外线的聚光 器和镜头等。 １.光源
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２.滤板 滤板的作用在于隔热、选择适宜的激发
光及选择适宜的检测光。按其作用分为隔热 滤板、激发滤板及吸收滤板。
（1）隔热滤板：能阻断红外线的透过而隔 热。它安装在灯室聚光镜的前面。
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（2）激光滤板：能选择性地透过紫外线可 见波长的光域，以激发荧光色素。激发滤 光片有两种，UG为紫外光滤片，只允许波 长275－400nm的紫外光通过，最大透光 度在365nm。BG为蓝紫外光滤片，只允许 波长325－500nm的蓝紫外光通过，最大 透光度为410nm。
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2020/10/18
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３.四甲基异硫氰酸罗丹明 （tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC） 其最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光。荧光效率亦较低，但因其 荧光猝灭速度慢，除作衬染外，也可单独采用。
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常用的荧光色素有： １.异硫氰酸荧光素（fluoresceln isothiocya－nate，
FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶 剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490－495nm， 最大发射光波长520－530nm，可呈现明亮的黄绿色荧 光。有两种同分异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定 性、与蛋白质的结合力等方面都更加良好，在冷暗干燥 处可保存多年。FITC是应用最广泛的荧光素。其主要优 点在于：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常标本中的绿 色荧光较少，有利于降低背景干扰。
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第九章 荧光免疫技术
荧光免疫技术（fluoroimmnoassay）是将免疫 学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一 种方法，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方 法。
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荧光物质
（一）荧光色素 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用做
荧光色素。只有那些能产生明显荧光的有机化合物 才能作为荧光色素。
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2020/10/18
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对流免疫电泳
（counter immunoelectrophoresis,CIEP）,原 理是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免 疫扩散技术，其在pH8.4以上的缓冲液中，大部分 蛋白质抗原成分带负电，在电场中向正极移动；而 作为抗体的IgG因其分子量大，暴露的极性基因较少， 解离也少，在电场中亦向正极缓慢移动，但电渗引 向负极移动的液流速度超过了lgG向正极的移动，带 动抗体移向负极,在抗原抗体最适比处形成乳白色沉 淀线，这就是电渗所致的IgG呈反向负极倒退。
2020/hodanune，RB200）为橘红色 粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定， 可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射 光波长为595－600nm，呈橘红色荧光。可与FITC 的翠绿色荧光形成鲜明的对比，常用于双重标记或 对比染色。但荧光效率较低。
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４.藻红蛋白（R-RE）是红藻和绿藻中一类被称为 藻蛋白（phycoblliprotein）家族中的一员，与 光合作用有关。其分子量为240000。其最强吸收 光波长为565nm，最大发射光波长为578nm。它 在488nm处的光吸收率为565nm处（最大的）的 75％。因此R-RE可以有效地与FITC一起用于双色 免疫荧光染色，因为它们可以共用488nm激发光。
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火箭免疫电泳
火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis， RIE）技术是将单向免疫扩散与电泳相结合的一项 检测技术。
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火箭电泳操作时应注意以下几点： １.所用琼脂要选择无电渗或电渗很小的，否则火箭 形状不规则。 ２.注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清晰的 云雾状或圆形皆提示未达终点。 ３.标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并 开启电源（电流要小）后再加样。否则易形成宽底 峰形，使定量不准。
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以此可作细微的蛋白质组分分析。根据各蛋白 所处的电泳位置，将沉淀弧的位置、形态与已知标 准抗原、抗体生成的沉淀弧进行比较，可分析待测 样品中所含成分的种类及性质、例如，多发性骨髓 瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白 沉淀弧，而其他类型的免疫球蛋白形成的沉淀弧可 明显细、短于对照沉淀弧（图7－4）。
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免疫固定电泳
免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis， IFE）是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。 Alfonso在1964年第一个报道了免疫固定技术 （IFE），1969年Alper与Johson相继报道了IFE在 铜蓝蛋白、lgG基因的多态性检测和C3激活后分子 转变中的应用
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４.作IgG定量时，由于抗原和抗体的性质相同，火 箭峰因电渗呈纺锤状。为了纠正这种现象，可用 甲醛与IgG上的氨基结合（甲酸化），使本来带 两性电荷的IgG变为只带负电荷，加快了电泳速 度，抵消了电渗作用，而出现伸向阳极的火箭峰。
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免疫电泳
免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）技术， 是区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫化学分析技 术。检测原理是将待测样品置于琼脂糖凝胶上进行电泳， 样品中各蛋白质成分因分子量及电泳迁移率不同，被分 离成肉眼不可见的若干区带。停止电泳后，沿与电泳方 向平行的两侧开槽并加入抗血清。置室温或37℃使两者 扩散，经18－24小时后，各区带蛋白在相应位置与抗体 反应形成弧形沉淀线。抗原含量越多，则反应沉淀线越 接近抗体槽，形成的沉淀弧线较粗，反之，则形成的沉 淀线较细。
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荧光免疫分析常用的仪器和设备
（一）荧光显微镜 荧光显微镜是荧光显微技术的基本工具。其主
要结构与普通光学显微镜基本相同，与普通显微镜 不同之处在于光源、滤板以及不吸收紫外线的聚光 器和镜头等。 １.光源
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２.滤板 滤板的作用在于隔热、选择适宜的激发
光及选择适宜的检测光。按其作用分为隔热 滤板、激发滤板及吸收滤板。
（1）隔热滤板：能阻断红外线的透过而隔 热。它安装在灯室聚光镜的前面。
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（2）激光滤板：能选择性地透过紫外线可 见波长的光域，以激发荧光色素。激发滤 光片有两种，UG为紫外光滤片，只允许波 长275－400nm的紫外光通过，最大透光 度在365nm。BG为蓝紫外光滤片，只允许 波长325－500nm的蓝紫外光通过，最大 透光度为410nm。
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３.四甲基异硫氰酸罗丹明 （tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC） 其最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光。荧光效率亦较低，但因其 荧光猝灭速度慢，除作衬染外，也可单独采用。
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常用的荧光色素有： １.异硫氰酸荧光素（fluoresceln isothiocya－nate，
FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶 剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490－495nm， 最大发射光波长520－530nm，可呈现明亮的黄绿色荧 光。有两种同分异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定 性、与蛋白质的结合力等方面都更加良好，在冷暗干燥 处可保存多年。FITC是应用最广泛的荧光素。其主要优 点在于：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常标本中的绿 色荧光较少，有利于降低背景干扰。
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第九章 荧光免疫技术
荧光免疫技术（fluoroimmnoassay）是将免疫 学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一 种方法，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方 法。
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荧光物质
（一）荧光色素 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用做
荧光色素。只有那些能产生明显荧光的有机化合物 才能作为荧光色素。