PCR实验中的污染预防及处理
避免PCR 实验室交叉污染的预防措施
防止PCR实验室交叉污染的方法
• 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程， 最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。
• (一) 划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管， 实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要 求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后 处理要在不同的隔离区内进行：
污染的监测
• 一个好的实验室，应时刻注意污染的监测， 考虑有无污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染。
• 对污染的监测主要包括：阴阳性对照的设 立、重复性试验、选择目的基因不同区域 的引物进行扩增等
阳性对照：
• 在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设 有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物 条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的 参考标志。
• 4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲 液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作， 避免污染，又可以增加反应的精确度；
实验操作注意事项
• 5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； • 6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证
PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的 可信性；
• 1．PCR用水应为高压的双蒸水；
• 2．引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产 物区配制；
• 3．引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间， 以备发生污染时查找原因。
实验操作注意事项
• 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样 品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增 反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节 都应该注意：
细胞培养污染拯救及预防方法
细胞培养污染拯救及预防方法概论污染是细胞培养的大敌。
预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。
(一)污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。
1、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。
最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
2、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
丝状菌污染3、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。
开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。
多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。
但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
阳性阴性支原体污染4、病毒污染组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。
目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。
尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。
实验室环境污染的预防
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实验室环境污染的预防
1实验室的设计分区和布局1.1样品准备区该区域无压力设置要求。该区域是用于对样品进行分样,将样品进行研磨、粉碎、匀浆的区域。由于在这些粉碎、研磨和匀浆处理过程中会产生气溶胶,因此,存在阳性样品污染后续操作的可能性。该区域与后面的区域应严格隔离,应放在与后面的三个区域隔开的独立的房间中。在样品准备区内还可设立一个专用的封闭区或房间用于样品的接收和储存。这个房间可以放置冰箱用于样品储存,应该和样品准备区其它区域隔离开。样品准备区域的人员不得进入试剂准备区。1.2核酸提取区核酸提取区是进行样品核酸提取的区域。该区域为负压,目的是防止核酸溢出造成污染。样品准备区又包括从样品中进行核酸提取和纯化的区域以及将核酸加到包含PCR主反应混合液管中的操作区域。添加完样品后,PCR管的盖子要尽可能快地盖好。使用PCR板和胶盖时,阳性对照和含目标序列的样品要与待测样本分开操作,以避免模板添加
如何预防细胞培养污染问题
如何预防细胞培养污染问题细胞培养是生物学和医学研究中常用的一种技术方法，但细胞培养过程中常常会面临细胞污染问题。
细胞培养污染会严重影响实验结果的准确性，因此需要采取一系列措施来预防细胞培养污染。
本文将介绍几种常见的细胞培养污染问题以及预防措施。
1. 细菌污染细菌污染是细胞培养中最常见的问题之一。
来自操作人员、试剂、培养器具和工作环境等多方面的细菌污染都可能导致细胞培养中的细菌污染。
预防措施：•穿戴合适的实验服和手套，并进行消毒处理，减少操作人员带入的细菌污染。
•使用无菌、高质量的试剂，并在实验中进行常规无菌操作，保持培养器具的无菌状态。
•经常对实验室进行清洁和消毒，保持工作环境的无菌。
2. 真菌污染真菌污染是细胞培养中另一个常见的问题。
真菌往往来自环境中的空气、试剂、培养器具或操作人员。
真菌污染会导致细胞生长异常，细胞死亡或实验结果异常。
预防措施：•定期消毒工作环境，特别是操作台和培养箱，避免真菌的滋生。
•使用高质量的培养基和抗生素，抑制真菌的生长。
•采取无菌技术操作，减少操作人员带入的真菌污染。
•定期更换培养器具，特别是培养瓶和培养皿，避免真菌滋生。
3. Mycoplasma 污染Mycoplasma 污染是细胞培养中常见但容易被忽视的问题。
Mycoplasma 是一类细小的细菌样微生物，常常会导致细胞株的污染。
Mycoplasma 污染会影响细胞生长、代谢以及实验结果的可靠性。
预防措施：•定期检测细胞株的 Mycoplasma 污染情况，可以使用 PCR 或流式细胞术等方法进行检测。
•新购买的细胞株进行隔离培养，并进行 Mycoplasma 检测，确保细胞株的无菌性。
•严格控制培养器具、培养基和操作人员的无菌操作，减少Mycoplasma 污染的可能性。
•定期更换培养基并添加抗生素，可以抑制 Mycoplasma 的生长。
4. 交叉污染交叉污染是指在细胞培养过程中，不同细胞株之间发生的细胞混合现象。
培养基实验室发生污染后处理方法
培养基实验室发生污染后处理方法
污染是培养基实验室中常见的问题，必须采取适当的措施来处理并恢复实验条件。
以下是一些处理污染的方法：
1. 隔离受污染的培养基：在发现污染后，立即将受污染的培养基从其他无污染的培养基中隔离开来，以防止进一步传播。
2. 清洁污染区域：对于实验室内的污染区域，应采取适当的清洁措施。
首先，用合适的消毒剂进行清洁，然后用酒精或其他溶剂进行消毒。
确保对污染区域进行彻底的清洁和消毒。
3. 处理污染培养基：处理受污染的培养基的方法取决于污染的类型和严重程度。
对于轻微的污染，可以尝试通过过滤或离心等方法去除污染物。
对于严重的污染，可能需要废弃受污染的培养基并重新制备新的培养基。
4. 检测和预防：在处理了培养基污染后，应进行污染源的定位和分析以避免再次发生类似的污染情况。
通过检测和预防措施，可以降低污染风险并保护实验室的无菌条件。
请注意，以上方法仅为一般性建议，具体处理污染的方法可能因实验室实际情况而异。
在处理污染时，请始终遵循实验室安全规范和适用的法规要求。
参考文献：。
PCR实验注意事项
实验中的一些好习惯加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性一定要记着关水浴箱，切记切记多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNA 酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。
临床分子生物实验假阳性的预防对策程序
临床分子生物实验假阳性的预防对策程序一、目的：规范实验检测操作，严格按照各项实验的条件及操作要求进行，预防出现假阳性的结果。
二、适用范围：临床基因扩增检验实验室。
三、职责：由临床基因扩增检验实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、预防程序：1、对产物污染的预防在经常进行PCR检测的实验室要采用至少一种针对产物污染的方法：1）、尿苷酶(UNG)消解：（Pre-PCR decontamination）:扩增中以脱氧尿苷(dUTP)取代脱氧胸苷(dTTP)，此种含尿苷产物可被尿苷酶消解，再经加热或加碱处理，即在脱氧尿苷处断裂，不再能作为模板扩增。
在后续扩增之前在PCR反应体系中加入尿苷酶处理，可能的产物污染被消除。
2）、补骨脂素加合：PCR反应体系中加补骨脂素，扩增后以紫外线照射反应体系，补骨脂素加合到核酸上，加合了补骨脂素的DNA不能再作为模板，但仍能用于杂交。
3）、3´次黄苷引物：引物合成时在3´端引入黄苷，PCR之后加入氢氧化钠，热处理后，含引物的序列被破坏。
2、对于交叉污染、培养物及其它污染的预防应采用综合性防范措施1）、实验人员岗前培训及一年一度定期考核；2）、实验设备及试剂的规范化和标准化；3）、设严格的阴性对照；4）、器械专用；5）、消耗品一次性专用；6）、严格规范的操作程序。
3、出现污染现象后的处理措施1）、发现污染现象的标本必须重新检测，对由于产物污染所致的假阳性最好使用抗污染的检测方法；2）、查找污染源；3）、对于试剂有污染者，更换试剂；4）、环境被污染，清洁工作环境、仪器等。
避免PCR实验室交叉污染的预防措施
避免PCR实验室交叉污染的预防措施PCR实验室交叉污染是一个常见但严重的问题。
交叉污染可能导致错误的实验结果，并浪费大量的时间和资源。
为了避免PCR实验室交叉污染，以下是一些预防措施：1.设立区域：按照操作流程将实验室划分为不同的区域。
例如，将制备PCR反应体系的区域和扩增反应的区域分隔开来，确保实验者在不同的区域操作。
2.空间隔离：确保设备、试剂和操作区域的有效隔离。
使用独立的PCR工作站，在每个工作站上进行不同的PCR实验，并且在不同的PCR实验之间进行清洁和消毒。
3.重复实验器具：在进行PCR实验之前，确保所有实验器具都进行彻底的清洁和消毒。
最好为每个PCR实验使用新的试剂盒和器具。
4.清洁实验台和仪器：在每次实验之前和之后，对实验台和设备进行彻底的清洁和消毒。
使用含酒精的消毒剂对实验台面、机器表面和仪器的每个部分进行清洁，并确保完全干燥。
5.使用负控制：为了确保结果的准确性，应该在每次PCR实验中设置负对照。
负对照通常是使用无DNA模板的反应体系。
这有助于排除实验中的任何污染。
6.分离样品：在进行PCR实验之前，确保每个样品都在不同的管子中操作，并在操作过程中避免将不同样品的器具接触。
每次更换样品时，应彻底清洁操作区域。
8.操作员培训和规范操作：确保所有操作员都经过PCR实验室的培训，并且了解交叉污染的风险和如何避免。
开展定期的回顾培训，以确保操作员持续遵循规范操作。
9.使用控制措施：避免使用可能产生污染的物品，例如手套、实验室衣、口罩等。
确保动作轻柔，减少颗粒物和污染的产生。
10.定期消毒实验室：除了日常清洁之外，定期对实验室进行消毒，以减少细菌和病毒的存在。
特别应关注常接触的表面，如门把手、操作台面等。
通过采取上述预防措施，实验者可以最大程度地减少PCR实验室交叉污染的风险，准确获取实验结果，并确保实验的可靠性。
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PCR实验中的污染预防及处理一．污染的预防进行PCR 操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR 污染或杜绝污染的出现。
（一）划分操作区：目前，普通PCR 尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；2. PCR 扩增区，包括反应液的配制和PCR 扩增；3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。
如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。
切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
（二）分装试剂：PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。
所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA 和其他来源的DNA：1．PCR 用水应为高压的双蒸水；2．引物和dNTP 用高压的双蒸水在无PCR 扩增产物区配制；3．引物和dNTP 应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。
（三）实验操作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。
因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；2. 使用一次性吸头，严禁与PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。
若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA 的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。
如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；8. 重复实验，验证结果，慎下结论。
二．追踪污染源如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。
（一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。
选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。
如果以含靶序列的重组质粒为对照，100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。
阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR 敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。
此外，每次扩增均应包括PCR 体系中各试剂的时机对照，即包括PCR 反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR 产物残留污染是非常有益的。
如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。
此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。
（二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。
环境污染中常见的污染源主要有：1. 模板提取时真空抽干装置；2. 凝胶电泳加样器；3. 电泳装置；4. 紫外分析仪；5. 切胶用刀或手术刀片；6. 离心机；7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。
1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml 去离子水浸泡；3）取5ml 做PCR 实验；4）电泳检测结果。
8. 气溶胶。
如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。
三．污染处理（一）环境污染1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L 盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA 脱嘌呤；2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min 即可。
需要注意的是，选择UV 作为消除残留PCR 产物污染时，要考虑PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV 照射仅对500bp 以上长片段有效，对短片段效果不大。
UV 照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV 照射还可使二聚体断裂。
形成二聚体的程度取决于UV 波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。
在受照射的长DNA 链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 链间与链内的交联和DNA 断裂等）均可终止Taq DNA 聚合酶的延伸。
这些位点的数量与二聚体位点相当。
如果这些位点（ 0.13/碱基）在DNA 分子上随机分布，一个500bp片段的DNA 分子链上将有32 处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。
相反，如果100bp 的片段，每条链上仅有6 处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。
这就是UV 照射有一定的片段长度限制的原因。
（二）反应液污染可采用下列方法之一处理：1. DNase I 法：PCR 混合液（未加模板和Taq 聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30min 后加热灭活，然后加入模板和Taq 聚合酶进行正常PCR 扩增。
该方法的优点是不需要知道污染DNA 的序列；2. 内切酶法：选择识别4 个碱基的内切酶（如Msp I 和Taq I 等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR；3. 紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV 照射法；4. g 射线辐射法：1.5kGy 的辐射可完全破坏0.1ng 基因组DNA，2.0 kGy 可破坏104 拷贝的质粒分子，4.0 kGy 仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR 扩增效率下降。
引物可受照射而不影响PCR，g 射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA 的。
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法由于UV 照射的去污染作用对500bp 以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR 扩增片段通常为300bp 左右，因此UNG 的预防作用日益受到重视和肯定。
1. 原理：在PCR 产物或引物中用dU 代替dT。
这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。
UNG 对不含dU 的模板无任何影响。
UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶，而对RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
2. dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使产物中掺入大量dU。
在再次进行PCR 扩增前，用UNG 处理PCR 混合液即可消除PCR 产物的残留污染。
由于UNG 在PCR 循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU 的新的PCR 产物。
3. dU 引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR 产物中仅5ˊ端带dU。
UNG 处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。
对长片段（1-2kb 以上）的扩增用dUTP 法效率较用dTTP低，而用dU 法就可克服这一缺点。
dU 引物最好将dU 设计在3ˊ端或近ˊ端。
该法仅能用于引物以外试剂的处理。
4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG 处理可以和PCR 扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU 存在，可彻底消除污染源。
5. 需注意的是掺入dUTP 的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR 产物克隆时，应该转化UNG-（UNG 缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG 消化掉。
（四）固相捕获法用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA 探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA 探针杂交区域。
第2）步的漂洗后可用PCR 检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。
（五）RS-PCR 法（RNA-specific PCR）也称为链特异性PCR，主要指用于RNA 模板的特异性PCR 法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR 的敏感性。
其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端（A 区）有2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0 个核苷酸（C 区）为附加修饰碱基。
与mRNA逆转录后，经超速离心使cDNA 与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR 循环中用逆转录引物的B 区和引物C 进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA 或质粒DNA 才不会被扩增。
（六）抗污染引物法该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。
这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。
如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。
只有原病毒DNA 才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。