叶绿素a的测定(B)
叶绿素a与叶绿素b含量的测定
CONSTRUCTION节能环保一、叶绿素的概念叶绿素是一类与光合作用有关的最重要的色素。
光合作用是通过合成一些有机化合物将光能转变为化学能的过程。
叶绿素实际上存在于所有能营造光合作用的生物体，包括绿色植物、原核的蓝绿藻（蓝菌）和真核的藻类。
叶绿素从光中吸收能量，然后能量被用来将二氧化碳转变为碳水化合物。
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜。
叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。
叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f 以及原叶绿素和细菌叶绿素等。
去镁叶绿素。
叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。
二、实验材料和方法1、实验材料使用韭菜叶片作为实验材料，测定其叶绿素含量，样品购自菜市场，仪器使用SPECORD ®50PLUS 型双光束分光光度计、高速电动匀浆机和电子天平。
药品：无水乙醇、石油醚、聚四氯乙烯、蒸馏水、丙酮（80%）、叶绿素a 和叶绿素b 标准品；用具：锥形瓶、超声波水浴锅。
2、实验方法（1）叶绿素提取提取前先进行提取试剂的优化选择，使用乙醇、丙酮和石油醚、异辛烷、正庚烷配制成2∶3的混合溶液。
从中选择出提取叶绿素含量最高的配比溶剂进行最终提取。
叶绿素含量根据朗伯.比尔定律进行计算，叶绿素含量测定结果用mg/kg 表示，使用如下公式：w=（kxA 校正xV）/mxl，其中A 校正=A665-（A705+A625）/2，w 为样品中叶绿素含量单位为mg/kg；A665为最大吸收665nm 的吸收值；A705为705nm 附近峰谷的吸收值；A625为625nm 附近峰谷的吸收值；k 为吸光常数取值13；l 为光程，指石英杯的厚度，单位为cm；m 为试样质量数值，单位为g；V 是提取试剂的体积，单位是ml。
称量定量切碎韭菜样品放入锥形瓶内，加入乙醇和石油醚混合浸提液（2：3，以上结果证明该配比提取含量最高），使用聚四氟乙烯密封带将瓶口密封，避免混合液挥发。
实验四叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定
实验四：叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定实验目的1、了解叶绿素分离与提取的原理和方法2、了解它们的光学特性和理化性质3、了解叶绿素a、b含量测定的方法。
实验原理1.脂溶性叶绿体色素提取：可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
2.分离：（1）叶绿体色素的分离＜纸层析法＞因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。
由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。
（2）叶绿素与类胡萝卜素的分离<皂化反应>叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
3.叶绿素a、b含量的测定：根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其溶液浓度c和液层厚度L成正比，即：A=φCL(φ为吸光系数) 因此，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用公式即可计算出提取液中各色素含量。
测定663nm 和645nm两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素a、b含量。
其校正过的公式为：Ca＝12.7A663－2.69A645 Ca:叶绿素a浓度,mg/LCb＝22.9A645－4.68A663 Cb:叶绿素b浓度,mg/LCT＝Ca + Cb CT:叶绿素总浓度,mg/L实验器材：1、仪器：剪刀、漏斗、烧杯、分光光度计、分液漏斗、铁架台、移液管、吸耳球、试管、毛细管、平底大试管、天平、研钵、滤纸2、试剂：石英砂、碳酸钙、丙酮、乙醚、四氯化碳、无水硫酸钠、30%KOH-甲醇溶液3、材料：菠菜实验步骤：1、叶绿素的提取称取去中脉叶片2g左右，剪碎放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成浆，再加入丙酮10ml，用漏斗过滤即为色素提取液，暗处备用。
实验名称：叶绿素a、叶绿素b含量测定
实验名称：叶绿素a、叶绿素b含量测定一、实验目的：熟悉在未经分离的叶绿体色素中测定叶绿素a、叶绿素b的方法。
二、实验原理；根据叶绿体色素提取液对可见光的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测其吸光度，即可利用公式计算出提取液中各种色素的含量：Ca=13.95A665-6.88A649Cb=24.96A649-7.32 A665C T= Ca+ Cb=18.08 A649+6.63 A665三、仪器、试剂与材料：仪器：分光光度计、离心机、研钵；试剂：96%乙醇溶液、石英砂、CaCO3粉末；材料：菠菜叶片；四、实验步骤：1.取干净的菠菜叶片剪碎，分别混匀。
2.称取剪碎的样品0.2g，各2份，分别放入研钵中，加少量石英砂和CaCO3粉末、及2-3ml 96%乙醇溶液，研成匀浆，倒入离心管，再用96%乙醇溶液多次洗涤研钵，洗涤液也倒入离心管中。
3．将离心管放入离心机后取上述提取液放入比色皿中，以96%乙醇为对照，分别测定665nm、649nm处的吸光度值。
4.按公式计算提取液中叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b的浓度。
五、实验结果及分析：1.研磨提取叶绿素是加入石英砂和CaCO3粉末各有什么作用？加入石英砂有助于研磨得更充分；加入CaCO3粉末可以保护叶绿素在研磨时不被破坏。
2.计算: A665(1)=0.399A A665(2)=1.237A 故A665=0.818AA649(1)=0.208A A649(2)=0.626A 故A649=0.417A 所以: Ca=13.95A665-6.88A649=8.542Cb=24.96A649-7.32 A665=4.421C T= Ca+ Cb=18.08 A649+6.63 A665=12.963。
植物生理学实验-叶绿素a b测定
叶绿素a,b含量测定［实验目的］熟悉在未经分离的叶绿素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。
［实验原理］在叶绿素a和b的吸收光谱曲线中，红波波长范围内，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm。
吸收曲线彼此又有重叠。
根据Lambert—Beer定律，最大吸收峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下关系：OD1＝Ca·ka1+Cb·kb1 (1)OD2＝Ca·ka2+Cb·kb2 (2)Ca为组分a的浓度（g/L） Cb为组分b的浓度（g/L）OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。
OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收缝波长）时，混合液的光密度OD值。
ka1，kb1，ka2，kb2分别为组分a，b的比吸收系数，即组分a（b）的浓度为（1g/L）时，其在相应波长（λ1，λ2）时的光密度OD值。
叶绿素A和B的80%丙酮溶液，当浓度为1时，比吸收系数K值如下表：将表中数值代入上式（1），（2）并整理的：Ca=0.0127OD663-0.00269OD645Cb=0.0229OD645-0.00468OD663若把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：Ca=12.7OD663-2.69OD645 (3)Cb=22.9OD645-4.68OD663 (4)Ct=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645 (5)Ct为叶绿素总浓度，单位为g/L。
利用（3），（4），（5）式即可计算出叶绿素A和B及总叶绿素的浓度（g/L）。
［器材与试剂］1.实验仪器：高级型分光光度计，离心机，台天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管2.实验试剂：丙酮，碳酸钙3.实验材料：植物叶片［实验步骤］1.色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5G放入研钵中加纯丙酮5ML，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5ML，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至20ML。
实验5 叶绿素a与叶绿素b含量的测定
C—叶绿素的浓度（mg/L)；v—提取液体积(ml)； n—稀释倍数；m—样品鲜重（g)
作业：
比较阳生植物和阴生植物的叶绿素有何不 同？
下周实验：植株磷素的测定(钼蓝法)
三、实验器料
1、材料： 菠菜或其它绿色植物叶片
2、试剂： 80% 丙 酮 或 96% 乙 醇 ； 石 英 砂 ；
CaCO3； 3、仪器：分光光度计（分光光度计
的使用）、高速离心机
四的植物叶片，称取0.2g剪碎后置 于研钵中，加入5ml 80%丙酮，少许CaCO3和 石英 砂。充分研磨（组织变白），再加10ml80%丙 酮，静止3-5分钟，冲洗研钵后转至离心管，定 容至15ml,3000转、15分钟，取上清液用80% 丙酮 定容至25ml。
2. 测定OD值： 取上清液1ml，加80%丙酮4ml， 以80%丙 酮
作空白对照，用分光光度计分别测定叶绿 素提取液在645nm、663nm、470 nm下的吸
光度。 3.计算：
把测出的吸光值带入(1)(2)(3)(4)式计算叶 绿素a、b、a+b和类胡萝卜素的浓度。 根据下式求出植物组织中叶绿素的含量：
实验六 叶绿素含量的测定
一、实验目的
1、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶 液中测定叶绿素a、b和类胡萝卜素 的方法及计算；
2、测定叶绿素含量a与叶绿素b含量 的意义。
二、实验原理
叶绿素提取液中同时含有叶绿素a、叶绿素b和 类胡萝卜素，三者的吸收光谱虽有不同，但又 存在着明显的重叠，在不分离他们的情况下同 时测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的浓度， 可分别测定在663nm、645nm、470 nm （分别是叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素在红 光区的吸收峰）的光吸收，然后根据 Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素 a、叶绿素b、和类胡萝卜素的浓度。
植物生理学实验五叶绿素a 、b 含量的测定(分光光度法)
实验步骤
4. 称重比较：将叶片对应部位重叠在一起，用 打孔器均匀打相同数目的孔（50），分别置 于光照及黑暗的两个称量皿中，80-90℃下 烘干至恒重，在分析天平上称重比较。
实验原理
改良半叶法是将植物对称叶片的一部分遮光或取 下置于暗处，另一部分则留在光下进行光合作用， 过一定时间后，在这两部分叶片的对应部位取同 等面积，分别烘干称重。因为对称叶片的两对应 部位的等面积的干重，开始时被视为相等，照光 后叶片重量超过暗中的叶重，超过部分即为光合 作用产物的量，并通过一定的计算可得到光合作 用强度。
结果分析
1. 仔细观察和记录实验结果。 2. 计算出Ca、Cb及总Ct的质量浓度。 3. 计算今天菠菜中Ca、Cb及总Ct的含量。 叶绿素a的含量（mg/g鲜重）= 叶绿素b含量（mg/g鲜重）= 叶绿素c含量（mg/g鲜重）=
韩山师范学院生物系
植物生理学实验
实验六 植物光合强度的测定 （改良半叶法）
叶绿素叶绿素aa的含量的含量mggmgg鲜重鲜重叶绿素叶绿素bb含量含量mggmgg鲜重鲜重叶绿素叶绿素cc含量含量mggmgg鲜重鲜重韩山师范学院生物系韩山师范学院生物系植物生理学实验植物生理学实验改良半叶法是将植物对称叶片的一部分遮光或取改良半叶法是将植物对称叶片的一部分遮光或取下置于暗处另一部分则留在光下进行光合作用下置于暗处另一部分则留在光下进行光合作用过一定时间后在这两部分叶片的对应部位取同过一定时间后在这两部分叶片的对应部位取同等面积分别烘干称重
植物生理学实验五叶绿素a 、b 含量 的测定（分光光度法）
叶绿素a和叶绿素b的快速鉴定
叶绿素a和叶绿素b的快速鉴定目录一、内容概括 (2)1. 叶绿素简介 (2)2. 叶绿素a与叶绿素b的重要性 (3)二、实验原理 (4)1. 叶绿素a与叶绿素b的光谱特性 (5)2. 鉴定原理 (5)三、材料与方法 (6)1. 实验材料 (7)样品来源 (8)样品处理 (8)2. 实验仪器与试剂 (9)萃光仪 (10)分光光度计 (10)缓冲液 (11)3. 实验步骤 (12)样品提取 (12)测定波长 (13)重复测定 (14)四、结果分析 (15)1. 叶绿素a与叶绿素b的吸收光谱图 (16)2. 数据处理与结果解读 (17)3. 结果讨论 (18)五、结论 (20)1. 快速鉴定叶绿素a与叶绿素b的效果 (21)2. 实验的局限性及改进方向 (21)一、内容概括本文档旨在介绍叶绿素a和叶绿素b的快速鉴定方法。
内容将涵盖叶绿素a和叶绿素b的基本性质、特点及其在生物体系中的重要性。
本文还将详细阐述快速鉴定叶绿素a和叶绿素b的流程和步骤，包括实验前的准备、实验操作的具体步骤以及结果的解析。
还将提及一些可能出现的问题以及解决策略，以确保实验的准确性和可靠性。
本文档旨在为研究人员、学生及叶绿素相关领域的从业者提供一种便捷、高效的鉴定方法，以推动相关领域的研究进展。
1. 叶绿素简介又称植物色素，是植物中一类重要的绿色色素，广泛存在于高等植物、藻类和某些微生物中。
它们是植物进行光合作用的关键色素，通过吸收和转化光能，将二氧化碳和水转化为有机物质，并释放氧气。
叶绿素的结构中包含一个镁原子，其骨架由两个吡咯环和一个碳链组成，这使得叶绿素具有特定的光谱特性，能够在特定波长下吸收光。
叶绿素a和叶绿素b是叶绿素中最主要的两种类型，它们在结构上有所不同。
叶绿素a的分子结构中除了镁原子外，还包含一个长链的碳链和一个醛基，这使得它呈现出蓝绿色的特征。
而叶绿素b的分子结构中则不含醛基，因此它呈现出黄绿色。
尽管这两种叶绿素在颜色上有所差异，但它们在光合作用中的作用却是相同的。
不同环境条件下植物叶绿素a、b含量的比较（分光光度法测定）.doc
一、实验课题名称不同环境条件下植物叶绿素a、b含量的比较（分光光度法测定）二、文献综述1.叶绿素a的生物合成过程起始物是谷氨酸，之后为5-氨基酮戊酸，两分子的ALA缩合形成胆色素原(PBG),4分子PBG相互连结形成原中卟啉IX.原卟啉IX与Mg结合形成Mg-原卟啉原IX，光下E环的环化形成，D环的还原作用和叶绿醇尾部的连接完成了整个合成过程，合成过程中的许多步骤在图中已省略2.影响叶绿素形成的条件（1）光光是影响叶绿素形成的主要条件。
从原叶绿素酸酯转变为叶绿酸酯需要光，而光过强，叶绿素又会受光氧化而破坏。
黑暗中生长的幼苗呈黄白色，遮光或埋在土中的茎叶也呈黄白色。
这种因缺乏某些条件而影响叶绿素形成，使叶子发黄的现象，称为黄化现象(etiolation)。
也有例外情况，例如藻类、苔藓、蕨类和松柏科植物在黑暗中可合成叶绿素，其数量当然不如在光下形成的多；柑橘种子的子叶及莲子的胚芽在无光照的条件下也能形成叶绿素，推测这些植物中存在可代替可见光促进叶绿素合成的生物物质。
(2)温度叶绿素的生物合成是一系列酶促反应，受温度影响。
叶绿素形成的最低温度约2℃，最适温度约30℃,最高温度约40℃。
秋天叶子变黄和早春寒潮过后秧苗变白，都与低温抑制叶绿素形成有关。
高温下叶绿素分解大于合成，因而夏天绿叶蔬菜存放不到一天就变黄；相反，温度较低时，叶绿素解体慢，这也是低温保鲜的原因之一。
(3)营养元素叶绿素的形成必须有一定的营养元素。
氮和镁是叶绿素的组成成分，铁、锰、铜、锌等则在叶绿素的生物合成过程中有催化功能或其它间接作用。
因此，缺少这些元素时都会引起缺绿症(chlorosis)，其中尤以氮的影响最大，因而叶色的深浅可作为衡量植株体内氮素水平高低的标志。
(4)氧缺氧能引起Mg-原卟啉IX或Mg-原卟啉甲酯的积累，影响叶绿素的合成。
(5)水缺水不但影响叶绿素生物合成，而且还促使原有叶绿素加速分解，所以干旱时叶片呈黄褐色。
通过对室外旱池处理条件下的甘薯叶片叶绿素含量变化的研究，结果表明，水分胁迫下甘薯品种叶片中叶绿素a、b及总叶绿素含量比对照均有所下降，叶绿素a/b比值比对照也有所下降，且叶绿素a/b比值占对照百分率与品种抗旱性呈极显著负相关。
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叶绿素a的测定(B)
叶绿素是植物光合作用中的重要光和色素。
通过测定浮游植物叶绿素，可掌握水体的初级生产力情况。
在环境监测中，可将叶绿素a含量作为湖泊富营养化的指标之一。
1.水样的采集与保存
可根据工作的需要进行分层采样或混合采样。
湖泊，水库采样500ml，池塘300ml，采样量视浮游植物的分布量而定，若浮游植物数量较少，也可采样1000ml。
采样点及采样时间同“浮游植物”。
水样采集后应放置在阴凉处，避免日光直射。
最好立即进行测定的预处理，如需经过一段时间（4～48h）方可进行预处理，则应将水样保存在低温（0～4℃）避光处。
在每升水样中加入1%碳酸镁悬浊液1ml，以防止酸化引起色素溶解。
水样在冰冻情况下（-20℃）最长可保存30d。
2.仪器设备
（1）分光光度计
（2）真空泵
（3）离心机
（4）乙酸纤维滤膜（孔径0.45um）
（5）抽滤器
（6）组织研磨器或其他细胞破碎器
（7）碳酸镁粉末
（8）90%丙酮
3.试验程序
(1)以离心或过滤浓缩水样，在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。
倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大（约为50kpa）。
水样抽完后，继续抽1～2min，以减少滤膜上的水分。
如需短时期保存1～2d时，可放入普通冰箱冷冻，如需长期保存（30d），则应放入低温冰箱（-20℃）保存。
(2)取出带有浮游植物的滤膜，在冰箱内低温干燥6～8h后放入组织研磨器中，加入少量碳酸镁粉末及2～3ml90%的丙酮，充分研磨，提取液绿色a。
用离心机（3000～4000r/min）离心10min。
将上清液倒入5ml或10ml容量瓶中。
(3)再用2～3ml的90%的丙酮，继续研磨提取，离心10min，并将上清液再转入容量瓶中。
重复1～2次，用90%的丙酮定容为5ml或10ml，摇匀。
(4)将上清液在分光光度计上，用1cm光程的比色皿，分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以90%的丙酮做空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。
4.计算方法
叶绿素a的含量按如下公式计算
[11.64×(D663-D750)—2.16×（D645-D750）+0.10×（D630-D750）].V1叶绿素a（mg/m3）= ----------——-—————————————-----------------------———V.δ
式中：V——水样体积（L）
D——吸光度
V1——提取液定容后的体积（ml）
δ——比色皿光程（cm）。