水稻转基因实验操作手册整理

水稻转基因实验操作

（廖鹏飞整理）

一、水稻愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）

1．消毒：

取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；

2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟；

3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。

2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）

1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；

2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天；

3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。(没有脱落的可在

原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)

二、预培养

将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度灭菌30min）。乙酰丁香酮（AS）浓度为100 μM (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升)

三、农杆菌（工程菌）培养

把-70℃保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基，在26-28℃，150 r/min振荡培养16-18 h，活化转入打靶载体的农杆菌。

在预培养的第2天，用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株，28 ℃静止培养2-3 d。3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基，28 ℃振荡培养3～4 h。分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调至0.5-1.0 OD600

四、感菌与共培养

1）将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间摇动数次；

2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；

3）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。19-20℃（组培室）暗培养3天。

五、愈伤组织的抗生素筛选

将共培养后的愈伤组织取出，用无菌水快速摇动清洗4次，然后加入无菌水浸泡10min,使愈伤内部的菌体游离出来；倒去洗液，再用含400mg/L头孢的无菌水浸泡20min。再用含400mg/L头孢的无菌水冲洗一次，最后置于无菌滤纸上沥干3h。

第一轮筛选：将沥干的愈伤转入含400 mg/L羧苄青霉素（Car）和400 mg/L头孢霉素的选择培养基（没有选择压力）上，26℃暗培养5-7天；

然后将愈伤转到含400mg/L羧苄青霉素（Car）、400 mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的培养基上进行选择，26℃，暗培养，两周一次，培养两次。

六、抗性愈伤组织的诱导分化和生根

1）将筛选获得的抗性愈伤组织接入预分化培养基中，26℃，暗培养5-7天。

2）预分化培养的抗性愈伤转入分化培养基（改用三角瓶或者平底试管）26℃，2000Lx 光照培养，再生转基因植株。

3）待小苗长到3-5cm;转入生根培养基上发根。

4）将根系健壮的植株移入盆砵，凉棚过渡3-5天；然后移到自然条件下生长，直至成熟。

注：分化过程中不可将愈伤继代培养，转基因苗从分化到移栽时间大约为三个月左右。将根部和茎叶分化得较完好的苗从试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。。

以上操作步骤皆在无菌条件下进行。

七、转化苗的检测验证

1）GUS检测：将准备好的材料浸泡在染液里，37℃保温过夜。GUS染液成分见附录。2）GFP检测：将材料放在共聚焦显微镜下观察成像。

3）PCR检测：设计潮霉素抗性基因引物HYG-F 5` CTTCTGCGGGCGATTTGT 3` HYG-R 5` CAGCGTCTCCGACCTGAT 3` PCR 反应条件为：95℃变性5min，55℃退火2min，72℃延伸2min，72℃保温10min。反应结束后，PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳

分析。

4）潮霉素快速检测转基因幼苗的方法（具体见附录）。

附录：

各种母液及培养基的配制方法

一、激素的配制

激素溶解方法母液浓度6-BA; KT

100mg样品加稀碱1ml振荡溶解（1M KOH），再

用蒸馏水定容100mL；4℃保存

1 mg/ml

NAA; IAA

100mg样品加稀碱1ml振荡溶解（1M KOH），再

用蒸馏水定容100mL；4℃保存

1 mg/ml

2，4-D 2,4-D 100 mg加少量酒精溶解，再用蒸馏水定容

100mL; 4℃保存

1mg/ml

AS 0.196g AS加10mL二甲基亚砜（DMSO）溶解，

用1.5mleppendorf管分装成小份-20℃贮存。配制

时注意带乳胶手套操作。

100mM

1）抗生素

链霉素（Str）50mg/ml：溶解0.5g链霉素硫酸盐于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。

利福平50mg/ml：溶解0.5g利福平于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存

壮观霉素（Spec）125mg/ml：溶解1.25g壮观霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。

羧苄青霉素（Car）400mg/ml：溶解4g羧苄青霉素二钠盐于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。

头孢霉素400mg/ml：溶解4g头孢霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存

卡那霉素（Kan）50mg/ml：溶解0.5g卡那霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤

灭菌分装成小份-20℃贮存。

二、各类基本培养基成分表：

1）有机母液储存液（4度保存）：

B5 有机工作液为从序号为1、2、3 各取1mL；序号4取10 mL

Ms 有机工作液从序号为1、2各取0.5mL, 3取40μl；4取10ml;5取1ml

N6 有机工作液从序号为1、2各取0.5 ml ,3取100μl；4取10ml;5取1ml

2）铁盐配制（4度保存）：

注：配制顺序如下

1.称取

2.78g FeSO4·7H2O溶解于200ml去离子水中（A）。

2.称取

3.73g Na2-EDTA·2H2O溶解于200 ml去离子水中（B）。

3.将B置于70℃水浴锅中直至溶质完全溶解（C）。

4.将A倒入C中混合，置于70℃水浴锅中保温2h。

5.定容至1L。

三、农杆菌生长的YEP液体培养基配方（每升含量）：

酵母提取物1g

蛋白胨10g

蔗糖5g

MgSO4·7H2O 1.027

pH 7.0-7.4

灭菌结束后加抗生素至终浓度为：利福平50mg/L

壮观霉素（Spec）125mg/L

四AA培养基储存液(室温储存)

微量元素配制中Na2MoO4·2H2O 单独溶解后与其他物质混合后定容到1L,室温保存。

3）水稻苗期水培营养液配方：

注:

1．制备大量元素营养液母液时，各种盐类分别溶解，分别储存，使用时每升营养液加1mL 母液。

2．制备微量元素营养液（除Fe外）时，先放500mL去离子水，称取各种盐类逐一溶解后，入容量瓶加蒸馏水稀释至1L，制成母液，使用时每升营养液加1mL母液。

3．Fe的制备：溶解5.57g FeSO4·7H2O于200 mL蒸馏水，再另溶解7.45g Na2-EDTA 200mL 蒸馏水中，加热Na2-EDTA（大约70度），加入FeSO4·7H2O，不断搅拌，然后于70度恒温箱中螯合2h，冷却定容至1L，储于棕色瓶中，使用时每升营养液加1mL母液。

4．调节pH为5.5。

5．铵营养时，加入硝化抑制剂（双氰胺），每升营养液加2mg双氰胺（终浓度）。

各人配制时，应注意所用的盐类和分子量，检查盐用量准确无误。

五、GUS染色液配方

(1)制备方法：A液：称取NaH2PO4·2H2O3.12g溶于蒸馏水，定容至100ml。B液：称取

Na2HPO4·12H2O7.17g溶于蒸馏水，定容至100ml。

(2)取100ml B液与40ml A液混合（混合后pH值约7.03），用NaH2PO4·2H2O调至pH7.0。

(3)染色液：

说明：

1.除了TritonX-100, 甲醇, X-Gluc不用灭菌外其他的母液都要灭菌.其中K3[Fe(CN)6]和

K4[Fe(CN)6]要用过滤灭菌的方法

2.GUS活性的精确定位需要有亚铁离子。GUS酶水解其底物X-Gluc产生可溶性无色的吲哚基衍生物，它可扩散到其他部位，必须经氧化缩合成二聚体，才能形成不溶性的蓝色沉淀，二聚体化由氧化催化剂(如亚铁氰化钾、过氧化物酶或过氧化氢酶等)催化，若不加Fe2-，则仅形成可溶性中间产物而扩散，加亚铁氰化钾后因吲哚基二聚体化而不扩散，不溶性蓝色沉淀形成越快，GUS酶的定位越精确。

材料准备：

(1) 瞬时表达检测取浸染后的愈伤，稳定表达取分化前的愈伤。

(2) 叶片、幼根等制成徒手切片（或剪成小块、小片）。

直接染色法

将准备好的材料浸泡在染液中，于37℃保温过夜。

六、潮霉素快速检测转基因幼苗的方法

1、检测培养基

成分：0.7% agar，1ml/L的6-BA，200mg/L的Hgy。

方法：先将只含有agar的去离子水煮沸，等冷却至55℃时加相应浓度的6-BA和Hgy，倒至培养皿中。

注：6-BA用于叶片的保鲜，检测培养基的配制无需灭菌处理，但培养皿需要烘干。

2、取样

剪取并收集待检测苗1cm左右长的新鲜绿色叶片（两端均留有切口），平放于培养基上，30℃，16h光/8h暗培养48h,叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死。