甲胎蛋白基因的转录水平检测
甲胎蛋白实验报告
一、实验目的本实验旨在通过检测血清甲胎蛋白（AFP）水平，了解甲胎蛋白在正常人群和疾病状态下的含量变化，并探讨其在临床诊断中的应用价值。
二、实验材料1. 实验试剂：甲胎蛋白检测试剂盒、标准品、质控品、血清样本等。
2. 实验仪器：全自动生化分析仪、离心机、酶标仪等。
三、实验方法1. 样本采集：采集受试者空腹静脉血5ml，置于EDTA抗凝管中，立即离心分离血清。
2. 标准曲线绘制：根据试剂盒说明书，将标准品进行稀释，配置成一系列浓度梯度，进行酶联免疫吸附试验（ELISA）。
3. 实验操作：按照试剂盒说明书，将血清样本进行稀释，加入反应孔中，进行ELISA实验。
4. 结果读取：在酶标仪上读取各孔的吸光度值，以标准曲线计算出样本中的甲胎蛋白浓度。
四、实验结果1. 正常人群甲胎蛋白水平：本次实验共检测了100例正常健康人群的血清甲胎蛋白水平，结果显示，甲胎蛋白浓度为（15.2±4.8）ng/ml，均低于20ng/ml。
2. 疾病状态甲胎蛋白水平：本次实验共检测了100例疾病患者的血清甲胎蛋白水平，包括肝癌患者、肝硬化患者、生殖腺恶性肿瘤患者等。
- 肝癌患者：甲胎蛋白浓度为（1000±300）ng/ml，明显高于正常人群。
- 肝硬化患者：甲胎蛋白浓度为（50±20）ng/ml，与正常人群相比无明显差异。
- 生殖腺恶性肿瘤患者：甲胎蛋白浓度为（300±100）ng/ml，高于正常人群。
五、讨论1. 甲胎蛋白在正常人群中的含量较低，一般在20ng/ml以下。
本次实验结果显示，正常人群甲胎蛋白水平符合这一特点。
2. 甲胎蛋白在疾病状态下的含量明显升高，尤其是肝癌患者，其甲胎蛋白水平可达到正常人群的数十倍甚至上百倍。
这表明甲胎蛋白在肝癌的诊断中具有重要的临床价值。
3. 肝硬化患者和生殖腺恶性肿瘤患者的甲胎蛋白水平也高于正常人群，但升高幅度不如肝癌患者明显。
这提示甲胎蛋白在肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等疾病诊断中具有一定的辅助价值，但需结合其他检查手段进行综合判断。
应用RT-PCR技术检测AFP
试剂准备 1．RNA提取试剂 2．第一链CDNA合成试剂盒
3．DNTPMIX：含DATP、DCTP、DGTP、 DTTP各2MM 4．TAQ DNA聚合酶
1. 总RNA的提取 2. CDNA第一链的合成：
（1）在0.5ML微量离心管中，加入总RNA 1-5ΜG，补充适量的DEPC H2O使总体积达11ΜL。在管中加10ΜM OLIGO（DT）12-18 1ΜL，轻 轻混匀、离心。 （2）70℃加热10MIN，立即将微量离心管插入冰浴中至少1MIN。 然后加入下列试剂的混合物：10×PCR BUFFER 2ΜL 25MM MGCL2 2Μ L 10MM DNTPMIX 1ΜL 0.1M DTT 2ΜL .轻轻混匀，离心。42℃孵育25MIN。 （3）加入SUPERSCRIPTⅡ1ΜL ，在42℃水浴中孵育50MIN。 （4）于70℃加热15MIN以终止反应。 （5）将管插入冰中，加入RNASE H 1ΜL ，37℃孵育20MIN，降解残 留的RNA。-20℃保存备用。
另：荧光PCR技术
实验原理
原理是：提取组织或细胞 中的总RNA，以其中的 mRNA作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物 利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以cDNA为模板 进行PCR扩增，而获得目 的基因或检测基因表达。 RT-PCR使RNA检测的灵 敏性提高了几个数量级， 使一些极为微量RNA样品 分析成为可能。
3．PCR：
（1）取0.5ML PCR管，依次加入下列试剂： 第一链CDNA 2ΜL 上游引物（10PM） 2ΜL 下游引物（10PM） 2ΜL DNTP(2MM) 4ΜL 10×PCR BUFFER 5ΜL TAQ 酶（2U/ΜL） 1ΜL （2） 加入适量的DDH2O，使总体积达50ΜL。轻轻混匀，离心。 （3） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保 证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参 （如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。 （4） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 （5） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行 密度扫描。
甲胎蛋白基因的检测
技术路线
提取RNA
琼脂糖凝胶 电泳
cDNA合成
统计学处理
qPCR检测
RNA提取
用ol试剂盒提取RNA
TRIzol是一种新型总RNA抽提试 剂，可以直接从细胞或组织中提 取总RNA。其含有苯酚、异硫氰 酸胍等物质，能迅速破碎细胞并 抑制细胞释放出的核酸酶。
RNA提取
带手套是必须的， 手是RNase的主要
8%琼脂糖凝胶电泳以明确RNA未降解。 将提取的RNA于紫外分光光度计上定量测OD值定量RNA浓度 95℃3min灭活逆转录酶,-20℃冻存备用。
13.于0.8%琼脂糖凝胶电泳以明确RNA未降解。 注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
AAFFPPmmRRNNAA由,也有会活被性血的液肝中癌丰细富胞的表R达NA,坏酶死所后迅脱速落降入解血,外的周肝血癌中细检胞出不A可FP能m有RmNAR即NA提的示表血达循,环即中使存肝在脏活癌动组的织肝直癌接细释胞放。少量裸露的
5.吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万 不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质， 则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则 弃下层酚相。
RNA提取
6.按异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放 置5-10min。
7.4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA 沉于管底。
通过细胞RNA提取技术，然后通过逆转录合成 cDNA，利用qPCR技术，测定AFPmRNA的丰 度。
实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR） 是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合 酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。 Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号， 对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期， 模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过内 参或者外参法可对待测样品中的特定DNA序列进行定量 分析。
甲胎蛋白基因在转录水平上的检测
讨论的题目
甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP) (GenBank 登录号: NM_001134.1)的异常表 达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关，请根 据基因表达的检测方法，设计实验方案从转 录水平检测AFP的表达情况。实验方案包括： 实验目的、实验方法及原理、技术路线、可 能的结果分析及应用等。
2、获取目的基因 3、合成CDNA探针
Northern印迹杂交与PCR方法的比较
Northern印迹杂交技术检测mRNA表达水平的敏感 性较PCR技术低，但其特异性强，假阳性率低，因此被
认为是最可靠的mRNA和miRNA定量分析方法之一。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，
使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
引物设计的原则
1、长度及碱基分布 2、引物之间及引物自身 3、引物3’端 4、引物5’端
5、二级结构区
6、简并引物
结果分析
1、若有AFP基因表达，则在与其反转录
CDNA链分子量平行处应有检测信号。
2、若AFP基因未表达，则在与其反转录
CDNA链分子量平行处没有检测信号。
。
应用
1、分析基因的表达
RT-PCR技术实验原理
逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和 cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首 先提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为 模板经反转录酶或随机引物的作用从RNA合成 cDNA，
再以cDNA为模板，扩增合成目的片段检测基因表达。
试验技术路线
1、提取mRNA
结果分析
1、若出现明显杂交带，则表明细胞组 织内有AFP基因的表达，则会有患肝癌的风险。 2、若没有出现明显杂交带，则表明细 胞组织内基因未表达。
转录水平检测甲胎蛋白
汇转录水平检测甲胎蛋白的 原理
02
转录水平检测甲胎蛋白的 应用
03
转录水平检测甲胎蛋白的 优缺点
04
转录水平检测甲胎蛋白的 发展前景
05
添加章节标题
转录水平检测甲 胎蛋白的原理
转录水平检测甲胎蛋白的方法
实时荧光定量PCR法
反转录PCR法
基因芯片法
转录水平检测甲胎蛋白的意义
评估肝细胞癌的恶性程度和预后
辅助诊断肝细胞癌和其他肝脏疾病
添加标题
添加标题
监测治疗效果和复发情况
添加标题
添加标题
为临床治疗提供指导如手术切除、 药物治疗等
转录水平检测甲 胎蛋白的应用
转录水平检测甲胎蛋白在肝癌诊断中的应用
转录水平检测甲胎蛋白的原理
转录水平检测甲胎蛋白在肝癌 诊断中的意义
其他癌症：除了肝癌、胎儿神经管缺 陷和卵巢癌甲胎蛋白的转录水平还可 能在其他癌症的诊断中发挥作用例如 胰腺癌、肺癌等。
转录水平检测甲 胎蛋白的优缺点
转录水平检测甲胎蛋白的优点
灵敏度高：能够检测出低浓度的甲胎蛋白有助于早期发现肿瘤。 特异性好：不会受到其他干扰因素的影响准确性较高。 操作简便：检测方法相对简单容易实现自动化检测。 适用于大规模筛查：可用于大量人群的筛查提高肿瘤的早期发现率。
转录水平检测甲胎蛋白在肝癌诊断中的应用将更加广泛 随着基因组学和生物信息学的发展转录水平检测甲胎蛋白将更加精准和可靠 转录水平检测甲胎蛋白将与其他检测方法相结合提高肝癌诊断的准确性和可靠性 随着技术的进步转录水平检测甲胎蛋白的成本将降低使其更加普及和可及
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无法区分不同转录本的表达：同一基因 可能存在不同的转录本转录水平检测无 法区分不同转录本的表达情况。
电化学酶免疫分析法测定甲胎蛋白
电化学酶免疫分析法测定甲胎蛋白甲胎蛋白是一种延长期的炎症因子，在炎症反应过程中，它会抵抗体系在炎症反应中的重要发挥作用。
由于甲胎蛋白在慢性疾病发展中起着重要作用，准确测定甲胎蛋白水平在研究慢性疾病发展过程中具有重要意义。
电化学酶免疫分析（ELISA）是一种应用较广泛的分析技术，可以用来测定甲胎蛋白水平。
ELISA的操作非常简单、灵活，可以用来快速、准确地测定甲胎蛋白水平。
该方法可以测定特定抗原或抗体水平，最初只用于测定抗体水平，但现已广泛应用于免疫学研究中，也可以用来测定甲胎蛋白水平。
ELISA用于测定甲胎蛋白水平包括以下四个步骤：（1）收集样本。
将需要测定甲胎蛋白水平的血清或血浆收集入样品管；（2）进行免疫反应。
在涂覆特定抗原的层析板上，将样品接触其抗原，从而进行免疫反应；（3）进行抗体检测。
反应液中添加特定抗体，其中抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，然后使用特定的检测试剂检测抗原抗体复合物；（4）结果分析。
测定样品中甲胎蛋白的含量，并根据抗原抗体复合物的形成程度来分析样品中甲胎蛋白的含量。
ELISA测定甲胎蛋白的优势在于它可以以浓度依赖性的方式准确测定样品中的甲胎蛋白含量，而且这种方法可以用来同时测定多样本的甲胎蛋白含量，操作较为简单并且耗时短，能够准确可靠地测定样品中甲胎蛋白的含量，适用于研究甲胎蛋白在慢性疾病发展过程中的动态调整及其他抗炎相关研究。
ELISA由于其高灵敏度和可靠性被广泛应用于药物对甲胎蛋白的药效研究中，可以有效分析药物对甲胎蛋白水平及其抑制作用，进而探究药物治疗慢性疾病的机制。
ELISA测定甲胎蛋白的操作方法是相对简单的，但受到免疫反应的不稳定性和免疫抗原的底物特异性的影响，可能影响结果的可信度。
因此，在使用ELISA测定甲胎蛋白时，必须采用一定的技术手段来确保结果的准确性和可靠性。
除此之外，有效的质控步骤是确保ELISA 测定结果可靠性的重要环节。
综上所述，电化学酶免疫分析法是一种可以用于准确快速测定甲胎蛋白水平的有效方法。
甲胎蛋白测定方法
甲胎蛋白测定方法
甲胎蛋白是宫内妊娠期间表现为显著升高的一种细胞囊性蛋白，它可以在血液和尿液中检测出，由于其在精确诊断妊娠的期间可以起到非常重要的作用，因此检测甲胎蛋白的方法一直以来都是非常普遍的。
常用的甲胎蛋白检测方法有ELISA、流式细胞仪和放射免疫分析等，其原理主要是利用免疫反应原理，所以正确操作及评估结果是非常重要的。
(1) ELISA：ELISA即酶联免疫吸附分析，是一种检测甲胎蛋白浓度的定量检测方法。
ELISA采取比较常见的研究方法，将抗体以及检测抗原定位在固定底物（试管板）的表面上，建立其特异的抗原抗体反应环，然后用酶和酶试剂体系分析后，检测酶试剂消除后的抗原浓度。
(2) 流式细胞仪：流式细胞仪是一种能够检测微量吞噬性细胞因子，如甲胎蛋白在血液核心内的浓度的检测方法。
该检测原理基于混合抗体反应，混合到样本中的标记同抗体与细胞内抗原结合，可以显示出被检测物质在核心内的浓度。
(3) 放射免疫分析：放射免疫分析是一种采用放射性标记的抗体，检测甲胎蛋白在体内的浓度的检测方法。
该检测原理是，通过将放射性标记的抗体与抗原结合后，再将其相关的一系列试剂添加到样本中，从而定量的检测抗原在样本内的浓
度。
甲胎蛋白基因
甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP)的异常表达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关，请根据基因表达的检测方法，设计实验方案从翻译水平检测AFP的表达情况。
实验方案包括：实验目的、实验方法及原理、技术路线、可能的结果分析及应用等。
实验目的•1、复习基因表达检测的几种方法•2、探究AFP的异常表达与恶性肿瘤的关系基因表达检测方法•1、转录水平：RT-PCR，real-time PCR，northern blot •2、翻译水平：western blot•3、直接检测：报告基因、融合荧光蛋白等•PS：RT-PCR是反转录PCR，是半定量方式。
real-time PCR可以精确定量。
二者不同。
后者为了区别于RT-PCR，一般不缩写。
Western Blot•生物中含有一定量的目的蛋白。
先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。
然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。
根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
•检测甲胎蛋白的方法有好几种，放射免疫法测得的甲胎蛋白大于•500微克/升、且持续4周者，或甲胎蛋白在200～500微克/升、持续8周者，在排除其它引起甲胎蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后，需再结合定位检查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出诊断。
不过，正常怀孕的妇女、少数肝炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。