特殊显微镜的使用
实验二 特殊显微镜的使用 相差显微镜
实验二特殊显微镜的使用相差显微镜实验二特殊显微镜的使用-相差显微镜实验二特殊显微镜的使用实验2.1差距显微镜一、实验目的掌控差距显微镜的原理、结构及其采用方法。
二、实验原理相差显微镜（phase-contrastmicroscope）是由p.zernike于1932年发明的，p.zernike于1953年获诺贝尔物理奖。
相差显微镜最大的特点就是可以用于观察未经染色的标本和活细胞。
人们在光学显微镜下观测被检标本时，只有在反射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质存有变化时，方能够看见被检样品的结构。
活细胞近似于无色透明化，光波通过时，借由或反射光的波长和振幅都不出现发生改变，所以用普通光学显微镜难以分清活体的结构。
通常对于浓淡对照不大的样品，多借助紧固和染色等化学方法，并使样品和背景的散射或反射光在波长和振幅上发生变化，即为在颜色和亮度上有所差异，就可以辨识。
但有些样品一经染色就可以引发变形，染色也可以并使存有生命的样品丧生。
我们可以利用差距显微镜去展开观测。
差距显微镜利用衍射的干涉现象，将人眼不容辨别的相位差变成可以辨别的振幅高，因此它就是一种应用领域在染色困难或无法染色的新鲜标本上赢得低对照图像的新型显微镜。
相差方法应用于生物学上的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。
染色给活体以有害的影响，甚至失真。
由此，才使相差法显得异常重要。
差距就是指同一光线经过折射率相同的介质其增益发生变化并产生的差异。
增益就是所指在某一时间上，光的波动所达至的边线。
差距同意于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等同于折射率与厚度的乘积之差（即为光程之差），介质越薄或折射率越大，光波失速也越大。
为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板（phaseplate）。
在圆形相扳平面上，有一圈与周围（里外）相扳厚度不同的或凸或凹的圆环。
相板分两部分：图1-10差距显微镜光路图共轭面（conjugatearea）：通常为环状，是通过直射光的部分。
实验一特殊显微镜的工作原理和使用
实验一特殊显微镜的工作原理和使用特殊显微镜是一种能够观察微观尺度物体的仪器，它通过利用光学、电子、声波等原理来放大和显示样品的细节。
特殊显微镜在科学研究、医学诊断、材料分析等领域起着重要的作用。
本文将重点介绍光学、电子和声学显微镜的工作原理和使用。
一、光学显微镜光学显微镜是一种利用可见光作为照明源的显微镜，其主要由物镜、目镜、调焦机构和光源构成。
它的工作原理是通过物镜将样品上的光聚焦到目镜上形成放大的影像。
光学显微镜的使用步骤如下：1.确保显微镜放置在平稳的台面上，并保持垂直。
2.调节光源亮度，使其能够提供足够的照明。
3.将样品放在载物台上，并使用样品夹夹紧。
4.用粗调焦机构将物镜与样品靠近，然后用细调焦机构调节焦距，直到看到清晰的影像。
5.调节目镜，使影像更为清晰。
6.根据需要，可以使用滤光片或偏振片来改变光的属性。
7.使用目镜检查样品，并调节焦距和目镜，如有需要。
光学显微镜的优点是成本较低、易于操作，并且可以观察到样品的活体细胞。
缺点是分辨率有限，仅能观察到大约200-300纳米的细节。
二、电子显微镜电子显微镜是一种利用电子束取代可见光来照射样品的显微镜，它可以提供比光学显微镜更高的分辨率和放大倍数。
电子显微镜的工作原理是通过电子束的散射、透射和反射来获得样品的影像。
具体而言，电子束通过电子枪产生，然后经过准直系统和电子透镜聚焦。
在样品中穿透或被散射后，电子束最终落在屏幕或探测器上生成影像。
电子显微镜的使用步骤如下：1.准备样品，通常需要制备薄片并清洁表面。
2.打开电子显微镜，等待其预热。
3.将样品放置在样品台上，并将其安装在显微镜中。
4.调节电子束的对焦，使其尽可能锐利。
5.对样品进行调节，以便获得所需的放大倍数和分辨率。
6.观察和记录样品的影像，可以使用照相机或电子影像探测器。
电子显微镜的优点是具有更高的分辨率和放大倍数，可以观察到更小的细节，如原子尺度。
缺点是设备复杂、操作困难，并且样品必须处于真空环境中才能进行观察。
实验二 特殊显微镜的使用 相差显微镜
实验二特殊显微镜的使用相差显微镜实验二特殊显微镜的使用-相差显微镜实验二特殊显微镜的使用实验2.1相差显微镜一、实验目的掌握相差显微镜的原理、构造及其使用方法。
二、实验原理相衬显微镜是P.Zernike在1932年发明的。
泽尼克于1953年获得诺贝尔物理学奖。
相衬显微镜最大的特点是可以用来观察未染色的标本和活细胞。
人们在光学显微镜下观察被检标本时，只有在反射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，方能看到被检样品的结构。
活细胞近于无色透明，光波通过时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。
一般对于明暗对比很小的样品，多借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，才能识别。
但有些样品一经染色就会引起变形，染色也可使有生命的样品死亡。
我们可以利用相差显微镜来进行观察。
相差显微镜利用了光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，因此它是一种应用在染色困难或不能染色的新鲜标本上获得高对比图像的新型显微镜。
相位差法在生物学中的主要价值在于，它可以直接观察透明的活体，而不需要杀死细胞的固定和染色方法。
染色对活体有有害影响，甚至会造成变形。
因此，相位差法非常重要。
相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。
相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。
相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差），介质越厚或折射率越大，光波减速也越大。
为了获得相位差效果，在相位差显微镜的物镜中安装了一块由光学玻璃制成的相位板。
在圆形相位板的平面上，有一圈凸面或凹面环，其厚度与周围（内、外）相位板的厚度不同。
相位板分为两部分：图1-10相差显微镜光路图共轭面积：通常为环形，即通过直射光的部分。
环是凸的或凹的。
振幅改变，从而达到不同的目的与观察效果。
利用相板把光波相位推迟，振幅改变。
实验一 特殊显微镜使用方法
倒置显微镜的使用方法：1.将亮度调节柄调至最小位置，接通电源，打开开关，再将亮度调节柄调至适中位置。
2.将样品置于载物台上，调节载物台纵横移动手轮，确定观察目标的位置。
3.将10X物镜置入光路，通过目镜观察，粗调焦使成像清晰。
将高倍物镜置入光路，右目镜观察，微调焦使成像清晰。
用左目镜观察，调整其上的视度调节圈，使成像清晰。
4.双手握左右相对转动，调整瞳距（双像重合）。
5.调节灯丝成像居中，然后观察样品。
相差显微镜的使用方法：1.将相差聚光镜转盘转至“0”标记处。
2.将亮度调节柄调至最小位置，接通电源，打开开关，再将亮度调节柄调至适中位置。
3.将样品置于载物台上，调节载物台纵横移动手轮，确定观察目标的位置。
4.把绿色滤色镜放入镜座的视场光阑转圈上。
5.将10X物镜置入光路，通过目镜观察，粗调焦使成像清晰。
将高倍物镜置入光路，右目镜观察，微调焦使成像清晰。
用左目镜观察，调整其上的视度调节圈，使成像清晰。
6.双手握左右相对转动，调整瞳距（双像重合）。
7.将相差聚光镜转盘转至“10”标记处，并将10X相差物镜置入光路。
（更换物镜倍数时，相差聚光镜转盘要转至匹配的数值）8.取下目镜，换上对中目镜（CT望远镜），旋松对中目镜上的螺钉并轴向抽动，使相板圆环和光阑圆环清晰，锁紧对中目镜上的螺钉。
9.调节相差聚光镜转盘两侧的调节扳手，左右推动，直至相板圆环和光阑圆环重合。
10.取下对中目镜（CT望远镜），换上目镜进行相差观察。
荧光显微镜的使用方法：1.将滤片转换拉杆拉至“E”位置，然后按倒置显微镜的使用方法中1－4步骤调整一起，作明场观察。
2.将汞灯电源箱上的电源接通，关闭荧光落射装置上的视场光阑拉杆，关闭显微镜右侧底座电源开关，开启汞灯电源开关，10分钟后，汞灯点燃至稳定状态，方可开始使用。
3.将25X荧光物镜置入光路，将滤片转换拉杆拉至所需位置，即蓝光（B）获绿光（G）的位置上。
4.将荧光落射装置上的视场光阑拉杆开至最大，粗调焦使成像清晰，观察荧光。
偏光显微镜用途
偏光显微镜用途一、引言偏光显微镜是一种特殊的显微镜，它具有许多其他类型的显微镜所不具备的特殊性能。
偏光显微镜主要用于材料科学、地质学、生物学等领域。
本文将详细介绍偏光显微镜的用途。
二、材料科学中的应用1. 晶体结构分析偏光显微镜可以通过观察晶体在不同方向上通过偏振器和分析器时的颜色变化来确定晶体结构。
这种方法被称为波尔法（Brewster法）或尼古拉斯法（Nicols法）。
这种方法可以帮助材料科学家确定晶体中原子排列方式和晶格参数。
2. 晶体缺陷研究偏光显微镜还可以用于研究晶体中的缺陷，如位错和空位。
这些缺陷会导致晶格畸变，从而影响材料性能。
使用偏光显微镜可以直接观察到位错和空位，并测量它们的密度和形态。
3. 热处理过程研究在材料制备过程中，经常需要进行热处理。
使用偏光显微镜可以观察材料在不同温度下的结构变化，并确定热处理过程中的相变温度和相变类型。
三、地质学中的应用1. 岩石组分鉴定偏光显微镜可以用于鉴定岩石中的不同矿物组分。
不同的矿物在偏光显微镜下具有不同的颜色和形态特征。
通过观察这些特征，地质学家可以确定岩石中的主要成分和含量。
2. 地质样品形态观察使用偏光显微镜可以观察地质样品中微小结构和颗粒的形态。
这对于确定样品来源、成因以及古环境等方面具有重要意义。
3. 矿物晶体结构研究与材料科学类似，偏光显微镜也可以用于地质学中对晶体结构的分析。
通过观察晶体在不同方向上通过偏振器和分析器时的颜色变化，可以确定晶体结构和晶格参数。
四、生物学中的应用1. 细胞形态观察生物学家可以使用偏光显微镜观察细胞的形态和结构。
偏光显微镜可以显示细胞中的各种结构，如细胞膜、细胞核、细胞质等。
2. 组织学研究偏光显微镜可以用于组织学研究。
通过观察组织切片在不同方向上通过偏振器和分析器时的颜色变化，可以确定组织中不同成分的分布情况。
3. 荧光物质检测许多生物荧光物质具有特殊的偏振性。
使用偏光显微镜可以检测这些荧光物质，并确定它们的分布情况和数量。
超景深显微镜使用技巧
超景深显微镜使用技巧超景深显微镜是一种先进的显微镜技术，通过使用特殊的光学系统和算法，可以获得非常高的景深，使显微镜成像更加清晰和详细。
在使用超景深显微镜时，掌握一些技巧和注意事项可以提高观察效果和准确性。
本文将介绍一些超景深显微镜的使用技巧，以帮助读者更好地使用这一先进的显微镜技术。
1. 调整焦距：超景深显微镜的景深非常高，所以在观察样品时，可以适当调整焦距，以获得更清晰的图像。
通过细微调整焦距，可以将样品上下的微小结构都呈现出来，避免只关注样品表面的现象。
2. 控制光源：超景深显微镜对光源要求较高，光源的亮度和均匀性都会影响成像效果。
在使用超景深显微镜时，确保光源亮度适中，不要太亮或太暗，以免影响成像质量。
此外，还应注意光源的均匀性，避免出现亮度不均匀的情况。
3. 适当调整观察角度：使用超景深显微镜观察样品时，可以适当调整观察角度，以获得更多的细节信息。
有时候，从不同的角度观察样品会呈现不同的结构和形态，这有助于全面了解样品的特征和性质。
4. 针对不同样品使用不同参数：不同的样品可能需要不同的参数设置才能获得最佳成像效果。
在使用超景深显微镜时，根据样品的特点和需求，合理选择放大倍数、光源强度、对比度等参数，以获得更好的成像效果。
5. 注意样品的准备和处理：样品的准备和处理对于超景深显微镜的成像效果非常重要。
在观察样品前，应确保样品表面干净，没有灰尘和污渍。
对于某些需要特殊处理的样品，如生物样品或薄膜样品，应根据需要进行相应的处理，以获得清晰的成像结果。
6. 注意镜头清洁：超景深显微镜的镜头非常精密和敏感，因此在使用前后应注意保持镜头的清洁。
使用干净的棉纱或专用镜头纸轻轻擦拭镜头表面，避免使用化学溶液或粗糙的材料，以免刮伤镜头或影响成像质量。
7. 学习和掌握软件操作：超景深显微镜通常配备了专用的软件，用于控制仪器和处理成像数据。
学习和掌握软件的操作可以帮助用户更好地使用超景深显微镜，调整参数和处理图像，以获得更准确和清晰的成像结果。
普通和几种特殊光学显微镜的结构及使用
二、荧光显微镜的两种滤光片各起什么作用?
主要用于观察具有荧光特性的细胞结构或被荧光染料着色的 细胞结构和化学成分。
结构特点：普通光学显微镜加上一些附件 荧光光源 （超高压汞灯） 激发滤片 阻断滤片
按光路分两种： 1．透射式荧光显微镜 2．落射式荧光显微镜
（二）使用方法
1．打开灯源，预热几分钟。 2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤
轻擦拭，切勿用手指、手帕和绸布等擦摸。机械部分可用布 擦拭。
5. 显微镜使用完毕后，转动粗调上升镜筒或下降载物台，取下
标本，转动转换器使物镜离开通光孔，下降镜筒或上升载物 台，使接近物镜，垂直反光镜，下降集光器，关闭虹彩光阑
二、暗视野显微镜 (一) 原理和结构特点
原理:利用光学上的丁达尔现象设计的。 结构特点:
荧光显微镜照片（微管呈绿色、DNA蓝色）
五、倒置显微镜
光学原理与普通光学显微镜原理基本相同，主要差别是 倒置显微镜的光源安装在标本的上方，物镜装在标本的 下方，因此可以用来观察生长在培养皿底部的细胞状态。 它与相差装置配合，可以用来观察培养的活细胞。
倒置相差显微镜观察人脐静脉内皮细胞
[作业]
（二）显微镜的使用方法 显微镜在使用前，应先检查一下它的各个部件是否
完整和正常，并进行必要的清洁工作，然后将显微镜放置 在自己左肩前方的实验台上，离桌子边缘3—6cm为宜，以 便观察。
1. 低倍镜的使用方法
1）对光 2）放置玻片标本 3）调节焦距
2.高倍镜的使用方法
1）一定要先在低倍镜下找到要观察的标本物像后，再把需要放 大的部分移至视野正中，并把物像调节到最清晰的程度。
实验一特殊显微镜的工作原理和使用
滤色系统
➢ 荧光光源的采用超高压汞灯，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有 一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片〔一般有紫外、紫色、 蓝色和绿色激发滤片〕，仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其 他光都吸收掉。
➢ 这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也 易识别，敏感性高，主要用于细胞构造和功能 以及化学成分等的研究。
荧光显微镜构造特点
➢ 荧光显微镜的根本构造是由普通光学显微镜加 上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束 别离器和阻断滤片等)的根底上组成的。
光源
➢ 现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形， 内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅 速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约 需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和复原过 程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物 质，因此，为荧光显微镜普遍采用。
环状光圈的大小由不同大小的环状 孔控制。环状光阑的直径和孔宽是 与不同的物镜相匹配的。其作用是 将直射光所形成的像从一些衍射旁 像中分出来。
相差环
➢ 相差物镜是在物镜的后焦点处加一环状相板。 ➢ 相板由光学玻璃制成，安装在物镜的后焦面处，相板装有
吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，具有改变相位的 作用。 ➢ 它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使 亮度发生变化的作用。放大倍数不同的物镜，其相板也不 同。
➢ 每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。 荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面 需加阻断(或压制)滤光片。用强光灯照明。光线暗那么物像不清晰。
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• 5.用柯勒照明法调节聚光器：①将视场光阑关到
最小；②用聚光器升降调节螺旋，调节聚光器的 上下位置，直至在目镜中观察到视场光阑像的边
缘清楚；③调节聚光器的调中螺旋，使视场光阑
的像移至视场中央（调中聚光器）；④打开视场
光阑，使其边缘与目镜中的视场同样大小。柯勒
照明是调好相差像的关键之一。
• 6.观察物镜后焦面，调节仪器使聚光器中环状光阑的 像和相差物镜中相板的圆环互相吻合，这一步是调好
胞图（3~5个细胞），并比较暗视野和相差 显微镜下洋葱内表皮细胞的差别？ 2.明视野和相差显微镜成像原理有哪些区 别？相差显微镜的特殊组件是什么？
细胞生物学实验
生命科学学院 生物技术与工程实验中心
实验一 特殊显微镜的原理及其使用
I 暗视野显微镜
一、实验目的
• 了解暗视野显微镜观察活细胞的基本原理； • 了解暗视野显微镜的特殊组件和位置；
• 掌握调节暗视野显微镜的基本步骤。
二、原理和结构特点
1.原理
根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观
(A) bright-field microscopy.(B) phase-contrast microscopy (C) differential-interference-contrast microscopy. (D) dark-field microscopy.
作业
1.绘制口腔粘膜上皮细胞、洋葱内表皮细
相差最重要的步骤。具体方法是：取下一个目镜，插
入一个聚焦望远镜或肉眼直接观察，如果环状光阑的 明亮光圈与圆形相板不吻合，可以通过调节聚光器上 的调中螺旋使之吻合。调节吻合后，插入目镜，就可 在目镜中观察到一个清晰的口腔上皮细胞的相差像。
• 7.如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍
相差物镜的聚光器环状光阑进行观察。
在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。
2.2相板
位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域， 直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部 分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常 以“Ph”字样标在物镜外壳上。
相差物镜剖面图
转盘聚光器构造图
• 二、实验步骤
• 1.样品制备：在一张清洁无痕的载玻片上滴一滴生 理盐水，用牙签刮自己的口腔粘膜少许或用镊子撕 洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀， 盖上清洁的盖玻片，用滤纸条吸取盖片周围多余的 水分，用指甲油封片（或不封片）。 • 2.将10x相差物镜旋入光路。 • 3.将相应于10x相差物镜的相差聚光器的环状光阑移 入光路中，完全打开聚光器的孔径光阑。 • 4.将样品置于载物台上，用聚焦螺旋聚焦样品。
察被检物体的显微镜。 不让直射光线进入物镜的镜头，而是先让直射光线经 过暗视野聚光器后改变途径，使其斜向射向被检物体。 能观察到明视野下看不到的极其微小的物体，可判断 物质颗粒的存在与否。最高分辨率可达0.004微米 主要用于微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本
观察等。
2 .结构特点 使用中央遮光板或暗 视野聚光器（常用的是抛 物面聚光器），使光源的 中央光束被阻挡。不能由 下而上地通过标本进入物 镜。从而使光线改变途径， 倾斜地照射在观察的标本 上，标本遇光发生反射或 散射，散射的光线投入物 镜内，因而整个视野是黑 暗的。
1 原理
• 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间
上光的波动所能达到的位置)的不同。 • 当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才 能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道 理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结
构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并
2.结构特点
• 相差显微镜与普通显微 镜的主要不同之处是： 用环状光阑代替可变光 阑，用带相位板的物镜 (通常标有PH的标记)代 替普通物镜，并带有一 个合轴调节用的望远镜。
2.1环状光阑
具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上， 光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并
有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。
三、实验步骤 1.样品制备：在一张无划痕、清洁的载玻片上滴一 滴生理盐水，用牙签取牙垢或用镊子撕洋葱内表 皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上盖 玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，镜检。 2.将暗视野聚光器安装在显微镜上，调强照明光。 3.在聚光器透镜的上表面滴上镜头油。向上缓慢调升 聚光镜，使镜头油与载玻片下表面缓缓接触。只 有在油滴与载玻片的底面相接触后，光线才能射 向标本。 4.将标本置于载物台上，插入10x物镜，用调焦螺旋 聚焦样品。
不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相位差)， 而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显
微镜下难以观察到。
相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并
且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅
差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线，以 增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未 染色标本。
作
细胞）
业
1.绘制暗视野内洋葱内表皮细胞图（3~5个 2.明视野和暗视野像的主要区别是什么？暗 视野显微镜的特殊组件是什么？
II.相差显微镜的原理和使用
一、实验目的
• 了解相差显微镜观察活细胞的基本原理； • 了解相差显微镜的特殊组件和Байду номын сангаас置； • 掌握调节相差显微镜的基本步骤。
二、原理和结构特点