定量荧光资料
荧光定量PCR基础知识
内参-校准生物学误差
• 内参用于校准实验过程对定量结果的影响核酸提取时通常以重量或体积 为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源 于等量细胞（或基因组）
1. 用DNase酶处理样本 2. 检测no-RT对照（不进
行逆转录的样本）
+RT 和–RT 应该至少 相差6-7 Cts
(大约1% 信号由DNA 产生).
+RT -RT
4 阳性对照-监控系统故障
• 内参(管家基因) – 标准品线性范围 – 灵敏度 – 扩增效率
• 外源阳性内对照 – 来源PCR产物 – 质粒 – 阳性样本
3’端的前4个碱基不能有3个以上的G
避免重复序列：避免序列中4个以上的G或连续6个A
选择C比G多的链当探针
5‘端第一个碱基不能为G，如为FAM，则第二个碱 基 也 不 能 是 G。5" 端染料最好连接在T或C碱基上 。
Primer PCR产物大小建议50-150bp
Tm值:58-60℃ Primer长度： 20bp
RNA降解（小量等份分装）
两步法
• 先将RNA逆转录成cDNAs
• 将cDNAs 1:2 – 1:10 稀释
• 加入反应板中，实时扩增 cDNA，或-20º C储存（稳定保 存数周）
– 优势：cDNA远比RNA稳定， 可以反复冻融多次
– 不足：和一步法相比，需要更 多的加样步骤
预扩增
传统的基因表达分析
• 原始光谱视图（Raw Date ） : 显示PCR反应中荧光信号的软件视图 • 背景组分: 仪器基座的背景“噪音”。
背景噪音影响反应的灵敏度。 背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除
纯荧光校正
(完整)PPT荧光定量PCR精品PPT资料精品PPT资料
简介
定量PCR：检测PCR反应指数期某一点的PCR产物数量，由此 确定初始模板的数量。
荧光定量PCR （real-time Q-PCR）：是指在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后 通过标准曲线或内参基因对未知模板进行定量分析的方法。
1996年由 Applied Biosystems公司推出该技术 实现了PCR从定性到定量的飞跃 特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点
熔解曲线分析引物二聚体
Product of Interest Primer dimers
TaqMan探针法
➢ 5’端标记有报告基因（Reporter，R），如FAM、VIC等 ➢ 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） ➢ 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与
Q分开，发荧光 ➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光定量PCR的优点
❖ 荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增 ❖ 灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量 ❖ 既能用于定性，判断一段DNA序列的有无，
也可用于定量，确定起始DNA拷贝数
荧光定量PCR扩增曲线
✓ 荧 光 定 量 PCR扩 增 曲线并非标准的指 数曲线，而是S形曲 线，并可分为反应 早期、指数期和线 性期和平台期。
每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步
TaqMan探针法
荧光标记物的选择
不同定量方法的比较
定量方法
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未 知的样本的量，绝对定量则需要使用标准曲线 确定样本中基因的拷贝数或浓度
相对定量：在一定样本中靶序列相对于另一参 照样本的量的变化，相对定量常见于比较两个 样本中基因表达水平的高低变化
荧光定量简介
标准品的制备---质粒或纯化后的PCR产物
这一步骤一般在预实验时完成，严格意义上的操作要求将PCR产物切胶后进行胶回收， 并进行质粒的连接、转化到感受态大肠杆菌中，质粒在大肠杆菌中增值后提取质 粒，并用分光光度计测定含有PCR产物的质粒的OD值，借此来确定质粒的摩尔量， 将已知摩尔量的质粒做5倍或10倍的连续梯度稀释，做成质粒标准品，这是准确 测定样品中目的基因模板量的定量基础。 现在也有的不做质粒，直接测定纯化后的PCR产物的摩尔量，然后梯度稀释PCR产物， 以此来作为标准品。 一般做四个标准品左右
加样时的操作
所有的加样操作要围绕着尽量使反应体系均一化为目的，除了样品外，其他试剂都 要进行预混，预混后分装到各个PCR管中，最后加样品，移液器要尽量准确，因 为这一步的操作可以说是差之毫厘，谬以千里。
熔解曲线分析
熔解曲线（melt分析）是指定量PCR反应结束后让样品继续升温直到PCR产物的双链 全部打开，这时由于双链打开，荧光染料不发荧光，这样荧光值会有一个陡然的 突降，借以检测PCR产物的特异性，相当于进行电泳检测。因为不同的PCR产物片 段其TM值不同，单一的双链DNA其荧光陡降的温度一致，加入含有非特异性扩增 产物，那么其荧光陡降的温度不止一个（两个或更多或杂乱无章）。如图：
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值 越小
Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出 样品中所含的模板量
定量PCR引物及探针的合成
定量PCR所扩增的片段长度一般都不超过300bp，这样才能确保结果更准确；染 料法对引物的特异性要求较高，探针法对引物的特异性要求不高，探针法所扩增 的片段长度更短，一般都在200bp以下。引物和探针都要进行Blast分析，以避免 非特异性扩增。
荧光定量PCR之绝对定量分析
荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制1.绝对定量定义绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。
将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。
以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
______________ _____ _♦ Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系CT值，就可以计算出样品中所含的模板量♦由样品厂闻w I it 厂Of”他 *标准品的一些标准*必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同♦标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）*标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）*在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值 _____标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA,也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DMA,甚至cDNA,但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。
3.标准品的制备RNA-cDNAPCR<一般一条标准曲线取四到五个点，浓度围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。
一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复 的次数。
倍比梯度稀释方法：1V 原液(标准品i) +9v 稀释缓冲液，得标准品ii lv 标准品ii+9v 稀释缓冲液，得标准品iii lv 标准品iii+9v 稀释缓冲液，得标准品iv lv 标准品iv+9v 稀释缓冲液，得标准品v 依次倍比稀释拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算4. ________________________________________________________________________ 实例 ________________________________________________________________________________ 标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700测得其拷贝数1.55X 108copy /ul 标准曲线的绘制(lcycle=lmin)设置对照：浓度为 1.55X107, 1.55X106、1.55X105, 1.55X104、1.55X103, 1.55X 102. 1.55X101的标准样品各一个，设空白对照PCR 反应：以不同浓度标准品作为模板标准品的扩增曲线半学半 g 购hi 上fola&kLdn 丄胡叶.型 _LLii?并吃 I 025SD0 4IK4 D.2Q51F oo )wo- MSI”?.8 门&&2 0592D1 WWb♦ ・bioask +cn+山5"叽6)， J-n-sspdocs)' —HFi —-HrH空白対腮训3叽cnB 1512 i<1« 2D 22 Z< 2623 JD 12 洌 3(- J8 -It 农仏僱伦 W %54 M 5B W<yii»标准品的溶解曲线n>o o o o*J.1 t 9 |L 广 制.T_ 1玉 75£s £s s £7.寰57養45.S 92M .S SM SJ a J 201.S Zo.nBRD ・i583s君a £22s£s須34.293.23 代5 M S I593650O b -・6 2・8s 5・2 6」7・6 ogunma- copyrulmbera^rw勢盖扩增效率(E)计算E二10-1/斜率=10-1/-3. 23-2. 04, E%= (2. 04-1) X100%= 104%若未知样本的CT值为19.11,将CT值代入线性方程: 即19. 11=34.29-3. 23X,所以X=(19. 11-34. 29)/(-3. 23)-4. 7 Quantityunknow-104. 7-50118 copies。
定量荧光资料
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50 油性指数
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
解释图版
其中ic为孔隙度。Ic测量方法：如岩屑不碾磨前测得含油浓度C1 檫干后 碾磨测得含油浓度C2 则 IC=C1/（C1+C2）
解释图版解释图版1定量荧光解释图版1101001000100000051152253354455556油性指数相当油含量mgl轻质区中质区重质区油区油区油区油水区油水区油水区水区水区水区解释图版图版2轻质油对比级油性指数关系图000200400600800100012001400000050100150200250300350400450500油性指数对比级油层油水同层水层干层气层解释图版其中ic为孔隙度
1.消除钻井液污染，有效识别油层 2.有利于发现轻质油，特别适合探井微量显示的轻 质 油层 3.对油气层进行评价 4.为油源评价提供新的解释资料 5.有效区分不同层系的含油性质 6.为现场施工决策提供及时依据 7.储层评定 8.对低阻油藏的认识有所提高
定量荧光分析技术的发展过程
随着定量荧光分析仪的大量应用，我们也发现了不少 缺点，针对用户在现场发现的问题及反馈回来的意见我们 对软件和硬件进行升级，使其性能更加稳定，更适应现场 不同的环境。主要包括以下几方面： 1.对二维分析仪的光源进行了改造,降低光源的散热量. 2.对二维分析软件进行了升级，加入了自动扣除背景,可调 基线,自动保存,手动设定抓峰范围,油性指数的自动计算,积 分面积的计算等,并且图谱以数据库的格式进行保存,操作 界面更加简洁明了,软件的操作更方便快捷 。 3.由于以往三维分析仪的扫描周期太长，扫描一个样品大 约需18分钟左右，不适合现场的使用。我们引入了CCD技 术，极大的缩短了扫描周期。改造后扫描周期为1.5分钟。
整理)荧光定量PCR
荧光定量PCR（qPCR）一、所需试剂1、模版DNA（一般为RTPCR产物）2、引物：详见引物设计（需要内参和目的基因的引物）3、（RR820A试剂盒，4℃避光6个月保存，-80℃长期）①SYBR® Premix Ex Taq II（TliRNaseH Plus）（2×Conc.）：含有以下成分（1）Ex Taq HS：一种耐热性DNA聚合酶，具有3′→5′核酸外切酶活性（校正活性）；PCR 产物3′端附有一个“A”碱基。
（2）dNTP Mixture：扩增的原材料（3）Mg2+：影响聚合酶的活性，增加扩增效率；影响引物复性和解链温度；浓度太高却会降低特异性（4）TliRNaseH：抑制cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用（5）SYBR® Green I：与双链DNA结合后发出荧光。
检测PCR产物扩增量的目的②ROX Reference Dye（50×Conc.）使用仪器：Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System、StepOnePlusTM③ROX Reference Dye II（50×Conc.）：浓度比②低使用仪器：Applied Biosystems7500 Real-Time PCR System和 7500 Fast Real-Time PCR System、ABI QuantStadio DX用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，无需使用②/③的仪器：Thermal Cycler Dice Real Time System II、LightCycler®/ LightCycler®480 System(Roche Diagnostics) 或CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)二、操作步骤（冰上进行）1、反应体系构建（）(除DNA模版外，同一基因的其他试剂配成总管*1通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。
荧光定量PCR手册
荧光定量PCR手册一、什么是荧光定量 PCR荧光定量 PCR（Quantitative Realtime PCR，qPCR）是一种在 DNA 扩增反应中，通过荧光信号的实时监测来定量分析特定核酸序列的技术。
简单来说，它能告诉我们样本中特定基因的数量有多少。
这一技术在生物学、医学、农学等众多领域都发挥着重要作用。
比如，在医学诊断中，能检测病毒或细菌的感染量；在基因研究中，可分析基因的表达水平。
二、荧光定量 PCR 的原理荧光定量 PCR 的原理基于传统的 PCR 技术，但增加了荧光检测的环节。
在 PCR 反应中，DNA 会被不断复制。
我们会在反应体系中加入一种特殊的荧光探针或荧光染料。
这些荧光物质的荧光强度会随着 PCR 反应的进行而发生变化。
当 PCR 反应开始时，荧光信号很弱。
随着反应的进行，DNA 不断扩增，荧光信号逐渐增强。
通过检测荧光信号的强度变化，我们就能实时了解 PCR 反应的进程，并计算出初始样本中目标 DNA 的含量。
三、荧光定量 PCR 的实验流程（一）样本准备首先，需要从待检测的生物样本（如血液、组织、细胞等）中提取出 DNA 或 RNA。
提取的质量和纯度对后续实验结果至关重要。
（二）引物和探针设计设计合适的引物和探针是关键步骤。
引物是一小段能与目标 DNA 序列特异性结合的寡核苷酸，它们决定了 PCR 反应扩增的区域。
探针则用于检测扩增产物，通常带有荧光标记。
（三）PCR 反应体系配置将提取的核酸模板、引物、探针、酶、缓冲液、dNTPs 等试剂按照一定的比例混合，配置成 PCR 反应体系。
（四）PCR 反应将配置好的反应体系放入荧光定量 PCR 仪中，设置好反应程序，进行 PCR 反应。
（五）数据分析PCR 反应结束后，仪器会给出荧光信号的变化曲线。
通过对这些曲线进行分析，可以得出目标基因的初始含量。
四、荧光定量 PCR 的关键要素（一）引物和探针的设计引物和探针的特异性、长度、GC 含量等都会影响 PCR 反应的效率和特异性。
荧光定量PCRPPT课件
仪器设备
确保PCR仪、荧光检测器 等设备正常运行，并按照 实验要求进行参数设置。
实验设计
根据研究目的和样本特性， 设计合理的荧光定量PCR 实验方案。
样本处理
样本收集
采集具有代表性的样本， 并妥善保存以备后续实验。
样本处理
将样本进行适当的处理， 如细胞分离、DNA/RNA 提取等，以获得足够的核 酸模板。
荧光信号检测
在PCR循环过程中，实时监测荧光 信号的变化，收集数据以供后续分 析。
结果分析
数据处理
结果应用
对荧光定量PCR实验数据进行处理， 如阈值设定、循环阈值（Ct值）计算 等。
将荧光定量PCR实验结果应用于后续 的研究或实际应用中，如基因表达分 析、病原体检测等。
结果解读
根据实验目的和预期结果，对荧光定 量PCR实验结果进行解读，并评估其 可靠性。
02
该技术利用荧光染料或荧光探针 标记特异性检测目标，通过荧光 信号的累积和检测，实现对目标 序列的实时定量分析。
荧光定量PCR技术的原理
在PCR反应过程中，随着DNA 的合成，荧光染料或荧光探针与
DNA结合，产生荧光信号。
随着DNA的扩增，荧光信号也 相应增强，通过实时监测荧光信 号的变化，可以计算出目标序列
基因突变检测
总结词
荧光定量PCR技术可用于检测基因突变，通过对基因序列的变异进行分析，有助于遗传性疾病的诊断、药物疗效 评估和个性化治疗。
详细描述
荧光定量PCR能够高特异性地检测基因序列的变异，包括点突变、插入和缺失等。通过比较正常组织和病变组织 的基因突变差异，有助于了解疾病的发生和发展机制，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。同时，基因突变检 测还可用于药物疗效评估和个性化治疗方案的制定。
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二维石油荧光分析仪图谱
定量荧光分析技术的发展过程
三维石油荧光分析仪
2000年左右国内录井界开始关注三维荧 光分析仪，先后石油大学开发了PDQFL2001三维分析仪和美国德士古的TSF全三 维扫描仪器。它的激发波长可变，形成样 品的指纹图和立体图，对样品进行精细分 析，尤其对添加剂的区分比较明显。但仪 器精密、结构复杂，更适合室内应用，增 加了现场应用和解释的难度。
1.消除钻井液污染，有效识别油层 2.有利于发现轻质油，特别适合探井微量显示的轻
质 油层 3.对油气层进行评价 4.为油源评价提供新的解释资料 5.有效区分不同层系的含油性质 6.为现场施工决策提供及时依据 7.储层评定 8.对低阻油藏的认识有所提高
定量荧光分析技术的发展过程
随着定量荧光分析仪的大量应用，我们也发现了不少 缺点，针对用户在现场发现的问题及反馈回来的意见我们 对软件和硬件进行升级，使其性能更加稳定，更适应现场 不同的环境。主要包括以下几方面：
定量荧光分析技术的发展过程
石油组成中的油质、沥青质等在紫外光的 照射下，能发出一种特殊光亮的现象，称 为石油的荧光性。这是石油的特性，而不 同石油的这一特性又往往表现在亮度及颜 色的差别上。根据荧光的亮度可测定石油 的含量，根据发光的颜色可测定石油的组 成成分。这就是荧光录井的基本原理。
定量荧光分析技术的发展过程
紫外灯
常规荧光录井方法起源于二十世 纪三十年代，我国的荧光录井方法 是50年代初从苏联引进的，在荧 光灯下肉眼观察岩屑颜色和强弱 , 定性的给出荧光级别。
定量荧光分析技术的发展过程
常规荧光录井的局限性主要表现在： （1）常规荧光灯是用波长365nm的紫外光照射石油，不能 充分激发轻质油的荧光。 （2）用肉眼观察只能看到可见光，而轻质油、煤成油、凝 析油发出的荧光多为波长小于400nm的不可见光，因此常 规荧光录井容易漏掉轻质油、煤成油和凝析油显示层。 （3）常规荧光录井用氯仿或四氯化碳浸泡进行系列对比， 而氯仿对人体健康有害，四氯化碳对荧光有猝灭作用，降低 检测灵敏度。 （4）常规荧光录井不能消除泥浆中荧光类有机添加剂的荧 光干扰，在特殊施工井中影响地质资料的准确录取。
二维定量荧光分析仪硬件的升级
以前定量荧光分析仪的光源采用的是氙 灯，氙灯的优点是寿命长，发出光的能量 强。但是也有很多缺点： 1.氙灯产生的热量很大，运行一段时间后仪 器内部温度较高，对滤光片及电路部分的 影响很大。 2.灯的能量不够稳定，灯光的强度在慢慢的 衰减，每次开机需要预热半小时，影响标 定曲线的准确性。
新软件操作界面
二维软件操作界面
基线处理功能
1.基线处理
自动保存和自动扣背景功能
2.自动扣除背景:将选定的图谱作为背景值,每 次扫描结束后都将选定的图谱自动扣除.设 置如下:
自动计算油性指数
旧版本软件的油性需要人工计算,在新 软件中我们加入了油性指数的自动计算.设 置好主次峰范围后,自动算出油性指数.
定量荧光分析技术的发展过程
一维石油荧光分析仪
90年代初美国德士古公司开发了QFT荧 光分析仪，既所谓的一维型仪器。国内很 多家录井公司开始引进此仪器。同时上海 润辰公司也开发了LYC型一维仪器，它解决 了轻质油荧光肉眼观测不到的难题，使得 轻质油层不易丢失。但它的缺点是单点激 发单点接收，不能体现各种油质的图谱特 征。
二维定量荧光分析仪硬件的升级
与氙灯相比，改造后的光源具有以下优点： 1.散热量小,降低仪器内部电路和滤光片的老
化速度,增强仪器的使用寿命,降低仪器的故 障率. 2.光的强度稳定,确保标定曲线的准确性 3.光源寿命较长
二维定量荧光分析仪软件的升级
新软件主要加入了以下功能。 1.基线处理 2.自动扣除背景值 3.自动保存 4.手动设定抓峰范围 5.油性指数的计算 6.计算积分面积
积分面积的计算
积分面积:可以计算出设定波长范围内的峰 面积.用面积计算有时比单点得出的数据误 差更小.
三维定量荧光分析仪硬件的升级
三维定量荧光分析仪的升级主要针对分析周 期较长，引入了CCD 阵列光谱仪技术。
以往扫描方式为一个激发波长进行一次波长段 扫描，所以一个分析周期是由二十多个波长段扫 描组成的。一个波长段的扫描时间为一分钟左右， 导致扫描周期时间很长，不适合现场大工作量时 使用。采用CCD 阵列光谱技术后，一个激发波长 几秒钟就可以得出该激发波长下的曲线，这样扫 描时间大约只有1.5分钟。
三维石油荧光分析仪图谱
三维立体图
指纹图
定量荧光分析技术的发展过程
目前，国内油田应用的主流仪器是二维 定量荧光分析仪,其在消除钻井液污染，有 效识别轻质油等方面发挥了较大作用。油 田系统采用定量荧光分析技术，自1998年 初至今，取得了可喜的应用效果。主要析技术的发展过程
二维石油荧光分析仪
1997年中国石油天然气集团公司立项开始研制具有图谱 特征的二维荧光分析仪，也就是OFA荧光分析仪的诞生。 它是中石油自我保护具有独立知识产权，中石油新技术推 广中指定探井使用的产品，是中国石油天然气股份公司石 油工业油田化学质量监督检验中心检测各类钻井液添加剂 荧光类的指定设备。它的特点是：克服紫外灯观察不到轻 质油这一缺陷，使得轻质油层不易漏失；采用正己烷做为 萃取液替代QFT的异丙醇和常规录井的氯仿和四氯化碳， 使荧光分析灵敏度提高10－35倍；自动扣除钻井液添加 剂的荧光干扰；以图谱的形式比较全面的反映了各种油质 和添加剂的全貌。它的直观、简单耐用，在全国各油田、 研究单位迅速得到推广应用。
1.对二维分析仪的光源进行了改造,降低光源的散热量. 2.对二维分析软件进行了升级，加入了自动扣除背景,可调 基线,自动保存,手动设定抓峰范围,油性指数的自动计算,积 分面积的计算等,并且图谱以数据库的格式进行保存,操作
界面更加简洁明了,软件的操作更方便快捷 。
3.由于以往三维分析仪的扫描周期太长，扫描一个样品大 约需18分钟左右，不适合现场的使用。我们引入了CCD技 术，极大的缩短了扫描周期。改造后扫描周期为1.5分钟。