GSH-Px活力的测定SOP
生物化学实验谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定一、[实验目的]1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用；2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力；3.学习治疗检测SGPT的方法及原理；4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。
二、[仪器与试剂]1．实验材料动物肝脏2．实验试剂（1）0.9%NaCl溶液（2）海砂（3）1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和）（4）1%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和）（5）0.1%KHCO3溶液（6）0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和）（7）2%乙酸溶液（8）酚的饱和水溶液：将2份酚和2份水（按重量计算）混合，放入分液漏斗中，振荡。
静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。
新配制的酚展层剂可以反复使用1周。
（9）0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液（10）0.1%标准谷氨酸溶液（11）0.1%标准丙氨酸溶液（12）1%KOH溶液谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）一、[实验原理]观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。
通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。
为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。
二、[实验操作]1.谷丙转氨酶提取液制备：2g肝脏+0.9%NaCL 6mL+海砂 200mg，在低温下，研磨成浆，用稀薄的脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）。
2.转氨作用取试管2支，按下表加入试剂，加入试剂的单位为mL加脱脂棉塞，45℃水浴，1.5h，时时振荡内容物沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析3.纸层析操作方法取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆（滤纸不可以折），通过中心将滤纸绘成四等分扇形。
用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm），在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm，取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面，将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触，用大小相同的培养皿盖在滤纸上，溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h），80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显色。
小鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)ELISA检测试剂盒说明书
小鼠谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）ELISA检测试剂盒说明书小鼠谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）ELISA检测试剂盒说明书检测原理试剂盒采纳双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最后的黄色。
颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），计算样品活性。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避开任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞快速当心地分别。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：假如样本收集后不适时检测，请按一次用量分装，冻存于20℃，避开反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.510uL、220uL、20200uL、2001000uL3.37℃恒温箱操作注意事项试剂盒保存在28℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶wan全溶解后再使用。
试验中不用的板条应立刻放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对比或者空白；依照说明书操作时样本已经稀释5倍，最结束果乘以5才是样本实际浓度。
严格依照说明书中标明的时间、加液量及次序进行温育操作。
全部液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒构成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无停止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0S5）浓度依次为：0、30、60、120、240、480U/L试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)试剂盒说明书
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）试剂盒说明书谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择23个预期差别大的样本做猜测定。
测定意义：GSHPx是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的重要酶之一、GSHPx不但能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的损害和加添机体抗辐射等本领。
测定原理：GSHPx催化有机过氧化物氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340nm有特征汲取峰，而NADP+没有；通过测定340nm光汲取减少速率来计算GSHPx活性。
自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调整移液器、酶标仪、96孔板和蒸馏水。
试剂构成和配置：试剂一：液体120mL×1瓶，室温保管。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保管。
试剂三：液体10μL×1支，20℃保管。
试剂四：液体200μL×1瓶，4℃保管。
粗酶液提取：1.组织：依照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：5～10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2.细菌、真菌：依照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500～1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波碎裂细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。
GSHPx测定操作：1.酶标仪预热30min，调整波长到340nm。
2.混合试剂在25℃或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min。
索莱宝 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px GPX）活性检测试剂盒说明书-微量法
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px/GPX ）活性检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC1195规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体60 mL×1瓶4℃保存试剂一粉剂×2瓶4℃保存试剂二液体10 μL×1瓶4℃保存试剂三液体30mL×1瓶4℃保存试剂四液体15 mL×1瓶4℃保存试剂五液体5mL×1瓶4℃保存标准品粉剂×1支 4℃保存稀释液液体20 mL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、试剂一：临用前加入3.3 mL 稀释液，充分溶解；2、试剂二：临用前按2 μL 试剂二：10 mL 蒸馏水的比例稀释试剂二，现用现配；3、试剂三：瓶底若有结晶可50℃水浴溶解，此溶液为饱和溶液，若底部最终还有结晶，吸取上清使用即可；4、标准品：10 mg 还原型谷胱甘肽。
临用前加入0.405 mL 稀释液溶解为80 μmol/mL 的标准溶液备用。
产品说明：谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px 或GPX ）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。
GPX能够催化还原型谷胱甘肽（GSH ）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG ），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。
GPX 催化H 2O 2氧化GSH ，产生GSSG ，GSH 能与DTNB 生成在412nm 处有特征吸收峰的化合物，412nm 下吸光度的下降即可反应GPX 的活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、天平、台式离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管。
谷胱甘肽 S-转移酶(GST)活性检测试剂盒说明书__ 微量法UPLC-MS-4497
谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性检测试剂盒说明书货号：UPLC-MS-4497微量法规格：100T/96S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称规格保存条件试剂一液体100mL×1瓶4℃保存试剂二液体22mL×1瓶4℃保存试剂三粉剂×1瓶4℃保存溶液配制：试剂三：临用前加2mL蒸馏水溶解。
产品说明：GST是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。
GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与GSH的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。
因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。
此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。
注意，GST催化的反应减少GSH含量，但是不增加GSSG含量。
GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外-可见分光光度计/酶标仪、研钵/匀浆器、微量石英比色皿/96孔UV 板和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
氧化型谷胱甘肽含量测定试剂盒说明书
氧化型谷胱甘肽含量测定试剂盒说明书分光光度法50管/48样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：GSH/GSSG是细胞内最重要的氧化还原对之一。
因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态，也是谷胱甘肽氧化还原循环的主要指标之一。
测定原理：利用2-VP法测GSSG含量。
自备仪器和用品：可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配置：试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体300μL×1支，4℃保存。
试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：液体30μL×1瓶，-20℃保存。
临用前加入0.6 mL试剂三稀释，4℃保存。
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入40 mL试剂三溶解，现配现用。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清液（如上清不清澈，再离心3min）待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；8000g 4℃离心10min，取上清液（如上清不清澈，再离心3min）的蒸馏水混匀待测。
3. 血清等液体：直接测定。
测定操作:1. 分光光度计预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中保温30min。
3. 测定管：取1 mL EP管，加入100 μ L上清液，5μ L试剂二，盖紧后混匀，置于37℃水浴30min；依次加入100 μ L试剂四，10 μ L试剂五，700 μ L试剂六，迅速混匀后，立即测定30 s和150 s光吸收A1和A2，计算ΔA=A2-A1。
谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性检测试剂盒说明书 微量法
谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
货号：BC0355规格：100T/96S产品内容：试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体22mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加2mL蒸馏水溶解。
产品说明：GST是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。
GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与GSH的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。
因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。
此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。
注意，GST催化的反应减少GSH含量，但是不增加GSSG含量。
GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。
自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外-可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板和蒸馏水。
操作步骤：一、粗酶液提取：1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。
二、测定：1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm，用蒸馏水调零。
牛乳中GSH—Px、GST及其热稳定性研究
蛋白组 ，室温组测定结果也极显著或显著高于巴氏消
具 有 重要意 义 。
３ 目前 ， ． ２ 在附红细胞体病的诊断中， 镜检法是常用的 方法（ 通过镜检来发现病原体） 。但 实际上要确诊则不
３ 讨论
能单以发现病原体为依据 ， 因镜检法有许多缺陷 ， 如血
液悬滴镜检时 ，容易把压片造成的红细胞变形误认为
３１本试验结果表 明， ． 当奶牛感染 Ｅｗ ｎｏｉ ， ．ｅｙｎ 后 随着 感染强度 的增加 ，血 液学指标 发生 了明显变化 ， 即
年黑 白花奶 牛 。
测定结果均极显著或显著高于巴氏消毒组 （＜ ． 或 ＰＯ １ Ｏ ＰＯ ５。 ＜ ． ）温度升至 ７ ￣￣热 １ｓ ， ０ ５Ｃ １ ５ 后 酶活力大致降到原
有 的 ２％；８ 煮沸消毒 ｌ ｉ 后 酶活性全部丧失 ， ０ ９￣ Ｃ ｍｎ 可
见在一定温度和时间范围内该酶有一定耐热性 ，温度
摘要 ： 用去蛋 白和不去蛋 白两种处理方法对 ８ 头成年黑 白花乳牛的乳中 Ｇ Ｈ Ｐ 和 Ｇ Ｔ的活性进行 了测定 ； Ｓ —ｘ Ｓ 并研
究 了这两种酶的热稳 定性。结果表 明：新鲜乳和 ７ ℃消毒 １ｓ９ ℃煮沸 ｌ ｉ 后的乳 中 Ｇ Ｈ Ｐ 的活性分别为 ５ ５、８ ｍｎ Ｓ —ｘ
１８ ６ ９． 、５ ７ ２ ． ， （ Ｓ Ｐ 活 力单位 ）Ｇ Ｔ的活性 分别为 ５ ． ＋ ０ ６２ ． ＋ ８ ９ １． ￣ ． （ ／ １． ＋ ７ ８２ ． ＋ ３ ９０ Ｇ Ｈ— ｘ ５ ０ ６ １ ；Ｓ ２ １ ２． 、５８ １． ，５ ６ ６ ８ ｕ ７ ４ ５ ５ ７ ５ ｍ ） Ｓ 有更高的耐热性 ； Ｌ 。Ｇ Ｔ 去蛋 白和不去蛋 白两种处理方法对两种酶活性无显著影响（＞ ． ） Ｐ０ ５。 ０ 关键词 ： 牛乳； Ｓ — ｘ Ｇ Ｔ 热稳定性 Ｇ Ｈ Ｐ ；Ｓ ； 谷胱甘肽过氧化物酶（ Ｓ — ｘ是 １５ 年 由 Ｍ ｌ Ｇ Ｈ Ｐ） ９７ ｉｓ ｌ 从牛红细胞 中发现的 ， 分子结构 中含硒 ， 故又名硒谷胱 现组织中还存在一种不含硒的 Ｇ Ｈ Ｐ ， Ｓ — ｘ命名为谷胱甘
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主要目的：
——测定物质谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）活力。
主要原理：
——谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）可以促使过氧化氢（H 2O 2）与还原性谷胱甘肽（GSH ）反应生成H 2O 及氧化性谷胱甘肽（GSSG ）,谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。
H 2O 22O+GSSG
GSH-Px 的活力以催化GSH 的反应速度来表示，由于这两个底物在没有酶的条件下，也能进行氧化还原反应（称为非酶促反应），所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应引起的GSH 减少的部分。
而GSH 含量的测定可以跟据GSH 和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412nm 处测其吸光度即可计算出
实验室签章
一、试剂
——谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒（南京建成生物研究所）
二、仪器设备
——96孔酶标板
——UV-Vis可见多功能酶标仪
——旋涡混匀器
——离心机
——水浴锅
——移液枪及其相应量程枪头
三、实验方法
根据试剂盒说明书具体操作步骤如下:
1. 非酶管和酶管各加入1 mmol/LGSH 0.2 mL ，酶管加入稀释后的待测血清和组织匀浆液0.2 mL ，37 ºC 水浴预温5分钟，酶管和非酶管分别加入试剂一应用液0.1 mL ，37 ºC 水浴准确反应5分钟，酶管和非酶管分别加入试剂二应用液2 mL ，同时非酶管加入待测细胞上清液0.2 mL 。
混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1 mL 作显色反应。
2. 空白管加入1 mL GSH 标准品溶剂应用液，标准管加入1 mL 20 μmol/LGSH 标准液，非酶管和酶管各加入上一步骤1 mL 上清液，然后空白管、标准管、非酶管和酶管各加入1 mL 试剂三应用液，0.25 mL 试剂四应用液和0.05 mL 试剂五应用液。
3. 混匀，室温静置15分钟后，在412 nm 处将酶标板空板进行扫描，准确吸取 0.2 mL 各管反应液加入到新的96孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（OD 值）。
4. 血清中GSH-Px 活力计算公式
GSH-Px 活力（U/mgprot ）--OD =
非酶管值酶管OD 值标准管OD 值空白管OD 值
×标准品浓度（20 μmol/L ）×稀释倍数
组织中GSH-Px 活力计算公式
GSH-Px 活力（U/mgprot ） --OD =非酶管值酶管OD 值标准管OD 值空白管OD 值×标准品浓度×min 稀释倍数（5）反应时间（5)
÷[取样量（0.2 mL ）×待测组织蛋白浓度（mgprot/ mL ）]
参考文献
Oliveira Lazarin M, Ishii-Iwamoto E L, Yamamoto N S, et al. Liver mitochondrial
function and redox status in an experimental model of non-alcoholic fatty liver disease induced by monosodium L-glutamate in rats [J]. Experimental and molecular pathology, 2011, 91(3): 687-694.。