藻胆蛋白生物合成与光谱分析
藻胆蛋白质的提取纯化与生物活性研究进展
上述的各种细胞破碎的方法 都有一定的局限
性 , 实际生产中 , 上述几种方法经常混合使用 , 以最 大的限度破碎藻体细胞 , 使藻胆蛋白溶出 。 1.3 提取方法 1.3.1 盐析法 将大量盐加到蛋白质溶液中 , 蛋白 质胶粒凝结并沉淀析出 , 因此向细胞破碎液中加入 盐溶液使蛋白质沉 淀析出 。 Ｓｉｅｇｅｌｍａ等 [ 22] 研 究表 明用 25%硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出 , 用 30%硫酸 铵可将藻蓝蛋白沉淀出 , 再用 50%硫酸铵可将别藻 蓝蛋白沉淀出 ;而也有研究者 [ 7] 认为 30%和 50%硫 酸铵盐析出的沉淀物中 , 藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的 比例几乎一样 , 即无法用硫酸铵盐析将藻蓝蛋白和 别藻蓝蛋白分开 。 陈芳等[ 19] 用 50%的硫酸铵盐析 条斑紫菜中的藻胆蛋白 。 该法使用简单方便 , 但不 利于以后的分离纯化 。 1.3.2 等电点沉淀法 汤朝晖等 [ 18] 用该法沉淀得 到了混有 3种藻胆蛋白的混合物 , 并研究了藻胆蛋 白在不同 ｐＨ值下的稳定性 , 认为藻胆蛋白对 ｐＨ值 较敏感 。 藻胆蛋白对 ｐＨ敏感 , 使 用该法时需注意 ｐＨ引起藻胆蛋白的变性 。 1.3.3 超滤法 运用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液 , 获得藻胆蛋白粗制品 。 用 ＮａＮＯ3高渗 -超滤法分离 提纯藻胆蛋白 , 超滤时选用聚砜膜 , 在超滤过程中 , 无机盐和小分子蛋白质 , 包括小分子的藻毒素透过 滤膜而去掉 , 特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒 , 提高产品的安全性 。 ＮａＮＯ3高渗 -超滤法是 提取藻 胆蛋白的简单易行的方法 [ 22, 23] 。 用此法提 取的藻 胆蛋白是安全无毒的 , 且易于纯化 , 脱水方便 , 产品 易于干燥 。
藻胆体与藻胆蛋白研究进展
藻胆体与藻胆蛋白研究进展摘要：蓝藻和红藻中的藻胆蛋白通过连接多肤将不同类型的藻胆蛋白按照一定的次序组合在一起,形成高度有序的超分子复合体-藻胆体,存在于光合膜的表面,作为光合作用能量吸收与传递的功能单位。
藻胆体分子量的范围介于7x106至15×106道尔顿之间, 形状及大小与藻的种类密切相关。
【1】外藻胆蛋白的分离纯化主要包括提取原料、细胞破碎法和分离纯化3个方面。
藻胆蛋白其生物活性主要表现在: 抗肿瘤活性、抗病毒活性、抗氧化和消炎活性, 提高免疫活性。
关键词：藻胆体，藻胆蛋白，分离纯化，超分子结构，能量传递，藻胆体-类囊体膜的天然架构，能量耗散机制1简介：1.1藻胆体藻胆体是由多种藻胆蛋白和连接蛋白组成的超分子蛋白复合物，含有数百个开链四吡咯发色团，分子量高达几百万道尔顿。
【2】藻胆体是红藻及蓝藻中的主要捕光天线，蓝藻和红藻通过附着在类囊体膜表面的藻胆体作为捕光复合物捕获光能并将其传递到光反应中心。
藻胆体主要有半球形和半椭圆形两种。
捕获光能并高效的传递给光反应中心PS2，种种传递给中心PS1。
PS1,PS2,PBS都在类囊体膜上，其形式与高等植物不同，光合作用过程，特别是光反应过程，是由类囊体膜上的超分子复合物实现的。
【3】藻胆体可以分为两部分：核心部分－主要由别藻蓝蛋白(APC)构成；杆状复合物－主要由藻蓝蛋白(PC)和藻红蛋白(PE)或藻红蓝蛋白构成。
【8】1.2藻胆蛋白藻胆蛋白主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中,其主要功能是作为光合作用的捕光色素复合体。
细菌、藻类和高等植物的光合作用的共同特征是具有很多"天线分子"，这些"天线分子"吸收光能并通过非放射性过程将激发能传递到含有叶绿素的"反应中心"，在红藻、蓝绿藻和隐藻中，藻胆蛋白就充当这种"天线分子"的角色。
因此，最初的藻胆蛋白研究主要集中在探讨其光合作用意义。
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度谭一心一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。
二、实验原理1冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。
2盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。
3DEAE—纤维素：二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基，弱碱性阴离子交换剂。
原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换，性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。
1.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。
装柱的方法分干装和湿装两种。
干装是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。
湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。
2.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（体积越小越有利于提高分辨率）。
3.洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（5cm），并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。
同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。
4.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-2
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-23.结果分析:实验测得的藻蓝蛋白纯度只有0.509，比较我们班其他组的结果相差不算太大，但其他班有的组测得藻蓝蛋白得纯度可达到 1.7左右，相对于这个纯度，我们所提取得藻蓝蛋白纯度时偏低的，影响藻蓝蛋白纯度的原因主要有以下几个：1)冻融次数:本实验时采用冻融法破碎细胞，冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中，细胞内外的液态水形成冰晶体，造成体积膨大，对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通透性加大，内容物流出。
藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始，然后冰晶体逐渐变大，向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破，压破。
每次冻融最容易生成细小冰晶体的地方是不一样的，即在细胞内外形成冰晶的部位是不同的，这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏，因而多次冻融能使破碎效果提高。
冻融时间增加随能使冰晶体变大，但由于受细胞内外水分含量的限制，冰晶的长大使有限度的，因而对细胞壁和细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏，破坏区域较少，效果较差，所以冻融时间对冻融效果影响不大。
可见，在冻融法中次数对藻蓝蛋白得率得影响比时间对它得影响大，多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。
我们自己只冻融了一次，其余是老师整体冻融的，所以我们冻融方面应与其他组没有多大区别。
2)不同饱和度硫酸铵的盐析效果：实验过程中，饱和度在20％时，没有明显的沉淀，查资料得知，当饱和度在25％以下时，没有明显的沉淀，在25％以上后，随着硫酸铵饱和度的增加，提取率逐步升高。
从纯度看，随着饱和度的升高，纯度先降后升。
实验测得的结果偏低，可能是加入硫酸铵过程中，随着饱和度的增大，杂蛋白，藻红蛋白和别藻蓝蛋白沉淀出的量都在增大，藻蓝蛋白所占的比例减小，所以纯度减小。
由于我们过柱时取的样不是我们组的，所以无法考证是这两种原因引起我们结果偏低，只能说这两种原因对我们所得的藻蓝蛋白纯度会有影响。
太湖水体中藻蓝蛋白的紫外-可见 吸收光谱特征分析
藻蓝蛋白的分光光度法定量主要依据藻蓝蛋白在500~700nm 的吸收光谱特性。Bennett公式中藻蓝蛋白的特征波长为 615nm，别藻蓝蛋白为652nm；abelson公式中分别为620和 650nm。图3（a）和（b）中，无峰Ⅰ和无峰Ⅱ光谱在 500~700nm的吸收平缓，615与620nm和652与650nm的吸收 无可分性。显然，在此情况下使用上述公式对无峰型样品 进行定量具有局限性。图3（d）中，双峰型光谱620nm附近 的藻蓝蛋白吸收特征明显，但由于待测溶液中叶绿素复合 蛋白的影响，670nm附近还具有吸收峰，且该吸收峰与藻蓝 蛋白、别藻蓝蛋白的吸收峰重叠。因此，今后还需要开展 更多的对比实验工作来分析叶绿素复合蛋白对太湖藻蓝蛋 白浓度测定的影响，以进一步提高水体藻蓝蛋白浓度测定 的准确性。
方法 太湖水样和铜绿微囊藻、鱼腥藻的藻蓝蛋白提 取使用反复冻融法。首先用GF/C玻璃纤维滤膜 过滤样品，将附着藻体的滤膜放入冻存管中， 同时加入0.05mol· L-1磷酸盐缓冲液于低温冰箱 冷冻，然后室温避光解冻，如此反复冻融７次 。解冻的样品以12000r· min-1速度离心10min ，取离心后的上清液作为待测液。以磷酸盐缓 冲液作为空白对照，使用岛津 UV 2450/UV 2550分光光度计测量吸光度。
实验部分
1 2
样品采集 于2011年5月19日、7月30日、8月20日、9月3日 、11月12日在太湖布设采样点位开展野外调查，共采 集75个水样用于实验分析。 铜绿微囊藻、鱼腥藻藻种来源于中国科学院水生生 物研究所，在江苏省环境演变与生态建设重点实验室 的无菌实验室进行培养。取对数生长期的铜绿微囊藻 、鱼腥藻样品进行实验。 藻蓝蛋白标准品（p6161）购自美国sigma公司， 提纯于螺旋藻。
藻蓝蛋白别藻蓝蛋白
（3）环境监测：藻体内藻红蛋白及其它色素的不同种类及含量可通过其不同光学特征而得到区分，因而可在水体中直接检测水花，赤潮，如Cowle等报道，用一种光度计可直接探测水体中含藻红蛋白的浮游植物。
（4）在医药中的应用：螺旋藻藻蓝蛋白能显著提高机体的体液免疫和细胞免疫的能力，特别是小鼠受氢化可的松损伤后，藻蓝蛋白对其免疫功能有一定的恢复作用，因此藻蓝蛋白有望成为肿瘤放化治疗中并用的生物反应修饰剂应用于临床。藻蓝蛋白和藻红蛋白具有抗肿瘤活性，如坛紫菜藻蓝蛋白对HL-60细胞生长具有抑制作用[34];螺旋藻藻蓝蛋白对人血癌细胞株HL-60、K-562和U937这三种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用最强；R-藻红蛋白介导的光敏反应能通过诱导肿瘤细胞出现凋亡，从而有效地杀伤肿瘤细胞，是一种很有前景地光动力药物。Iijima等（1982）的研究发现藻蓝蛋白能促进免疫系统以抵抗各种疾病。哈佛医学院的Schwartz和Shklar（1986）也研究发现螺旋藻藻蓝蛋白对一些癌细胞有抑制作用。1988年，Morcos等的试验和1995年蔡心涵等的研究也证明藻蓝蛋白有光敏作用和良好的抑癌作用。张成武1995年的研究证明藻蓝蛋白对骨髓造血具有刺激作用，可用于临床辅助治疗各种血液疾病。藻胆蛋白具有性质稳定、荧光量子产率高、背景干扰小、易于同生物素抗体和糖蛋白等大分子交联等特点，作为新一代的荧光探针在临床诊断、免疫学、细胞生物学、组织化学、分子生物学等方面可代替同位素和酶作标记物。
万东华-藻蛋白的分离纯化及光谱性质研究
藻蛋白的分离纯化及光谱性质研究Isolation, purification of phycobiliprotein from Porphyra and itsspectroscopic properties一、实验目的和要求1. 了解藻蛋白的生理意义和功能，藻蛋白一般的纯化方法；2. 掌握盐析和凝胶层析的实验技术；3. 掌握紫外可见光谱仪检测蛋白的方法；4. 了解藻蛋白的荧光发射特性。
二、实验原理藻蛋白是藻类特有的捕光色素蛋白，参与光合作用的能量吸收和传递，主要存在于红藻、蓝绿藻和隐藻的藻胆体中。
藻蛋白主要包括藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白三类。
藻蛋白在藻类中的含量可达细胞干重的25%～28%, 除了作为荧光探针用于医学诊断、免疫学和细胞学研究之外，藻胆蛋白具有抗氧化、提高机体免疫力和抗肿瘤等重要药理功能，在功能食品、化妆品和药品中有广泛的应用前景。
我国藻类资源十分丰富，是世界上最大的紫菜生产大国，是获取藻蛋白的理想资源。
选用紫菜提取藻红蛋白，具有成本低、得率高的优点，具有较好的利用价值。
1．蛋白质的盐析沉淀盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。
2．葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。
单个凝胶珠本身象“筛子”。
不同类型凝胶的筛孔的大小不同。
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。
藻胆蛋白的生物合成与光谱分析
藻胆蛋白生物合成与光谱分析Biosynthesis and Spectral Analysis ofPhycobiliprotein藻胆蛋白生物合成与光谱分析摘要：藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类捕光色素蛋白，可分为藻红蛋白(简称PE)，藻蓝蛋白(简称PC)，别藻蓝蛋白(简称APC)和藻红蓝蛋白(简称PEC)。
重组有藻胆蛋白（本实验只做藻蓝蛋白）基因的E. coli BL21，在含有kana（24 µg/ml）和氯霉素（40.8µg/ml）的LB培养基中培养。
当OD600达到0.5-0.6时，用终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养2.5小时。
加超声缓冲液后用超声破壁离心取上清，得到藻蓝蛋白粗提液。
通过镍-亲和层析对起进行纯化。
关键词：藻胆蛋白生物合成光谱分析Biosynthesis and Spectral Analysis of Phycobiliprotein Abstract：Phycobiliprotein is a kind of light-harvesting chromoprotein existing in blue-green gae, red alga and cryptophyta, which includes phycoarythrin(short form PE), phycocyanin(short form PC), allphycocyanin(short formAPC), phycoerythrocyanin(short form PEC). E. coli BL21 which containsrecombinant phycobiliprotein（only phycocyanin was required in thisexperiment）gene was grown in LB medium containing kanamycin (Finalconcentration: 24μg/mL) and `chloromycetin(Final concentration:40.8μg/mL). When absorbance at 600 nm value was between 0.5 with 0.6,isopropyl β-D-thiogalactopyranoside was added to 1mM（Finalconcentration）and the incubation was continued an addition 2.5 h. Thecell was broken and centrifugated, then the crude cell extract( supernatant)was harvested. Furthermore it was purified by Ni-affinity chromatography. Key words：phycobiliprotein biosynthesis spectral analysis主要符号对照表PE 藻红蛋白PEC 藻红蓝蛋白APC 别藻蓝蛋白PC 藻蓝蛋白PCB 藻蓝胆素PEB 藻红胆素PUB 藻尿胆素PVB 藻紫胆素E.coli 大肠杆菌OD 光吸收值IPTG 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷KPP 磷酸钾缓冲液min 分钟h 小时藻胆蛋白生物合成与光谱分析1引言1.1藻胆蛋白藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类捕光色素蛋白，可分为藻红蛋白(简称PE)，藻蓝蛋白(简称PC)，别藻蓝蛋白(简称APC)和藻红蓝蛋白(简称PEC)。
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E.coli BL21
实验步骤
1．活化菌种 2．扩大培养 3．生物合成 4．提取纯化 5．电泳检测 6．光谱分析
实验结果:提纯产物
Apo-proteins
CpcA
PecA
Lyases
CpcE/F
PecE/F
实验结果:电泳图谱与光谱
150
0.10
ption [a.u.]
0.08 0.06 0.04
T-型
藻胆蛋白生物合成步骤
Ho1
Heme
PcyA
PCB (phycocyanobilin)
PCB +
Lyase Phycobiliprotein subunit
Apophycobiliprotein
藻胆蛋白生物合成模型
pCDFDuet-lyase or pETDuetபைடு நூலகம்lyase pCOLADuet-apoprotein pACYCDuet-ho1-pcyA
实验项目
藻胆蛋白生物合成与光谱分析
Contents
1. 实验原理
2. 实验步骤 3. 实验结果 4. 注意事项
实验原理:藻胆体结构
Phycoerythrin(PE) or Phycoerythrocyanin(PEC)
Allophycocyanin(APC) Phycocyanin(PC)
藻胆蛋白三聚体与亚基结构
100
scence [a.u.]
注意事项 1．藻胆蛋白生物合成过程必须在低温、 避光条 件下进行。 2．超声波破壁时必需在冰上进行，否则因升温导 致藻胆蛋白的失活，影响最终的光谱。
a-Subunit
b-Subunit
藻胆色素生物合成途径
藻胆蛋白裂合酶催化类型
裂合酶类型 E/F-型 催化产物 PCB-CpcA， PVB-PecA
S/U-型
CpcB-C84-PCB，PecB-C84-PCB， CpeA-C84-PEB，CpeB-C84-PEB ApcA,B,D,F-PCB
CpcB-C155-PCB ，PecB-C155-PCB