新教材2020-2021版高中生物人教版选择性必修三学案+练习：2.2.1 动物细胞培养

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第2节动物细胞工程

一动物细胞培养

必备知识·素养奠基

一、动物细胞培养概念

从动物体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后在适宜的培养条件下,让这些细胞生长和增殖的技术。

二、动物细胞培养的条件

1.营养条件:

(1)合成培养基:将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成。

(2)天然成分:血清等。

(3)一般使用液体培养基,即培养液。

2.无菌、无毒的环境:

(1)培养液和培养用具灭菌处理。

(2)无菌环境下操作。

(3)培养液定期更换的目的:清除代谢物,防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。

3.温度、pH和渗透压:

(1)适宜的温度:哺乳动物多以36.5±0.5℃为宜。

(2)适宜的pH:多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。

(3)适宜的渗透压。

动物细胞培养能否体现动物体细胞的全能性?说明你的理由。

提示:不能。动物细胞培养只是细胞的增殖,没有体现细胞的全能性。

4.气体环境:95%空气和5%CO2。

(1)O2作用:细胞代谢所必需的。

(2)CO2的主要作用:维持培养液的pH。

三、动物细胞培养的过程

填一填:基于动物细胞培养的过程,完成下面的问题:

(1)过程①处理方法有:机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法。

(2)过程②为原代培养,培养的动物细胞有两类:

①悬浮在培养液中生长增殖;

②贴附于某些基质表面生长增殖。

(3)进行过程③时,悬浮培养的细胞直接用离心法收集;贴壁细胞需要

使用胰蛋白酶等处理,然后用离心法收集。

(4)过程③为传代培养,进行过程③的原因主要有:细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏和接触抑制等。

四、干细胞培养及其应用

1.干细胞分布:早期胚胎、骨髓和脐带等。

2.种类:胚胎干细胞和成体干细胞。

3.判一判:基于干细胞的类型和应用,判断下列说法的正误。

(1)胚胎干细胞和成体干细胞都具有形成机体的所有组织和器官,甚至个体的潜能。(×)

提示:成体干细胞具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织,不

具有发育成完整个体的能力。

(2)造血干细胞是发现最早、研究最多、应用最为成熟的一种成体干细胞。(√)

(3)iPS细胞称为诱导多能干细胞,与胚胎干细胞类似,也需从胚胎中获取。(×)

提示:iPS细胞来源于自身的体细胞诱导,无须从胚胎中获取。

(4)不同类型的干细胞分化能力不同,胚胎干细胞的分化能力最强。

(√)

(5)干细胞将在再生医学、药物安全性、有效性检测、疾病治疗等领域发挥重要作用。 (√)

关键能力·素养形成

知识点动物细胞培养过程

1.动物细胞培养过程:

2.动物细胞培养过程中酶的处理:

(1)用酶“两次”处理的目的:第一次使用的目的是使组织细胞分散开;第二次使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来,便于分散后继续培养。

(2)使细胞分散开的原因:一是能保证细胞所需要的营养供应;二是能保证细胞内有害代谢物的及时排出。

(3)不能用胃蛋白酶处理:由于大多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4,而胃蛋白酶发挥作用的最适pH为2.0左右,因此不能用胃蛋白酶使细胞分散开。

3.有关动物细胞培养知识点可归纳为4个“2”:

(1)培养材料为“2”:即动物胚胎、幼龄动物的组织和器官。

(2)培养过程为“2”:即原代培养、传代培养。

(3)

胰蛋白酶使用“2”次:即原代培养和传代培养中均使用,目的是使

细胞分散开。

(4)细胞生长特点有“2”个:即贴壁生长和接触抑制。

4.植物组织培养与动物细胞培养的比较:

项目植物组织培养动物细胞培养原理植物细胞的全能性细胞增殖培养基(半)固体培养基液体培养基

过程

外植体

↓脱分化

愈伤组织

↓再分化

胚状体

↓

植物体

动物的组织

↓机械法或酶

细胞悬液

↓

原代培养

↓胰蛋白酶

传代培养

结果新的植株新的细胞

相同点①两技术手段培养过程中都进行有丝分裂,都是无性繁殖,都可称为“克隆”,都不涉及减数分裂

②均需要无菌操作、无菌培养,需要适宜的温度、pH等条件

如图所示是某动物细胞培养时,培养液中活细胞和死亡细胞密度统计结果,下列相关叙述错误的是( )

A.实验中要控制胰蛋白酶溶液浓度和处理时间,以免损伤细胞

B.培养液中应适当加入青霉素、链霉素,以避免杂菌污染

C.曲线bc段变化的主要原因是培养液中营养物质不足及有害代谢物积累等

D.培养至第6 d时,新产生的细胞数等于死细胞数

【解题导引】

【解析】选D。实验中要控制胰蛋白酶溶液浓度和处理时间,以免损伤细胞,A正确;培养液中应适当加入青霉素、链霉素等一定量的抗生素,以避免杂菌污染,B正确;曲线bc段表示活细胞密度减少,而此时间段内死细胞密度增加,产生这种变化的主要原因是培养液中营养物质不足及有害代谢物积累等,C正确;培养至第6 d时,活细胞数等于死细胞数,D错误。

【素养·探究——母题追问】

(1)科学探究——结果的交流与讨论

实验过程中用胰蛋白酶溶液处理时间过长或过短,会出现什么结果?

提示:处理时间过长,胰蛋白酶会破坏细胞膜,即损伤细胞。处理时间过短,组织细胞不能充分分散开。

(2)科学思维——演绎与推理

上题曲线ab段产生的原因是什么?

提示:营养物质相对充足,有害代谢物较少。

【素养·迁移】

2020年初,荷兰某研究所利用蛇干细胞培养出可分泌毒液的蛇毒腺微型组织,让毒素的获取途径更加安全和简单。下列叙述正确的是( )

A.培养蛇干细胞时O2的作用是维持培养液pH的稳定

B.蛇毒腺微型组织基因的表达与蛇干细胞不完全相同

C.利用蛇干细胞的大量增殖即可获得大量分泌毒液的细胞

D.培养蛇毒腺微型组织与哺乳动物细胞培养的条件完全相同

【解析】选B。培养蛇干细胞时,二氧化碳的作用是维持培养液pH的稳定,A错误;蛇毒腺微型组织已经分化,具有特定的形态,与蛇干细胞的一些基因的表达相同,如呼吸酶基因,与一些特定基因的表达不同,如与毒素合成有关的基因的表达,B正确;蛇干细胞没有分化成腺细胞,不能合成大量毒素,不能增殖得到大量分泌毒液的细胞,C错误;蛇属于变温动物,培养时需要的温度低于哺乳动物,D错误。

【补偿训练】

下列关于动物细胞培养的叙述中,不正确的是( )

A.传代培养时需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞

B.细胞的癌变发生于原代培养向传代培养的过渡过程中

C.癌细胞在培养瓶中不会出现接触抑制现象

D.动物细胞培养一般需要使用CO2培养箱

【解析】选B。由原代培养分瓶进行传代培养时,需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理贴壁生长的细胞,A项正确;细胞的癌变一般发生于50代后的细胞培养过程中,B项错误;癌细胞膜上糖蛋白减少,细胞间的黏着性降低,失去了接触抑制,容易扩散和转移,C项正确;动物细胞培养的场所是CO2培养箱,培养箱内含有95%的空气和5%的CO2的混合气体,为动物细胞提供适宜的气体环境,D项正确。

【课堂回眸】

课堂检测·素养达标

【概念·诊断】

1.动物细胞培养是动物细胞工程的基础,下列有关动物细胞培养的描述合理的是________。

①动物细胞培养要定期更换培养液,其目的是便于清除代谢物,防止代谢物积累。

②多数动物细胞培养过程中其培养液所需的适宜pH为6.8～7.0。

③培养动物细胞的第一代(即第一次细胞增殖)被称为原代培养。

④动物细胞培养过程中需要充足的氧气环境,二氧化碳可有可无,影响不大。

⑤培养瓶中的细胞通常需要定期使用胰蛋白酶处理,分瓶后继续培养。【解析】选①⑤。动物细胞培养要定期更换培养液,其目的是便于清除代谢物,防止代谢物积累对细胞的毒害,①正确;多数动物细胞培养过程中其培养液所需的适宜pH为7.2～7.4,②错误;细胞分裂多次后,细胞数目增多出现接触抑制,停止增殖然后进行分瓶,分瓶处理前的培养为原代培养,③错误;动物细胞培养需要氧气和二氧化碳,④错误;培养瓶中的细胞通常需要定期使用胰蛋白酶处理,分瓶后继续培养才能保持继续增殖,⑤正确。

2.在动物细胞工程中,最基础的一项技术是( )

A.动物细胞培养技术

B.细胞核移植技术

C.动物细胞融合技术

D.干细胞的培养

【解析】选A。动物细胞培养是动物细胞工程的基础。

3.下列动物细胞培养过程中,属于原代培养的是 ( )

A.用胰蛋白酶使组织分散成单个细胞的过程

B.从机体取得细胞后立即进行培养的过程

C.出现接触抑制现象后接下来的细胞培养过程

D.哺乳动物细胞在培养基中的悬浮生长过程

【解析】选B。在原代培养和传代培养细胞过程中,都会用到胰蛋白酶,使组织分散成单个细胞,A错误;从机体取得细胞后立即进行培养的过

程是原代培养,B正确;出现接触抑制现象后,接下来的细胞的培养过程是传代培养,C错误;无论是原代培养还是传代培养,细胞都有在培养基中的悬浮生长过程,D错误。

4.培养动物细胞时将动物组织分散成单个细胞,宜采用( )

A.盐酸酒精混合液

B.胃蛋白酶溶液

C.胶原蛋白酶溶液

D.纤维素酶溶液

【解析】选C。在培养动物细胞时从健康动物体内取出组织块,剪碎,用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间,这样动物组织就会分散成单个细胞,C正确。

5.动植物体的体细胞进行离体培养,下列叙述正确的是( )

A.都需用CO2培养箱

B.都需用液体培养基

C.都要在无菌条件下进行

D.都可体现细胞的全能性

【解析】选C。动物细胞培养需要用CO2培养箱,但植物细胞培养不需要用CO2培养箱,A错误。动物细胞培养需用液体培养基,而植物细胞培养需要用固体培养基,B错误。动植物细胞培养都要在严格的无菌条件下进行,C正确。植物细胞培养能体现细胞的全能性,而动物细胞培养的原理是细胞增殖,不能体现细胞的全能性,D错误。

【思维·跃迁】

6.图1是培养小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)的示意图,图2是在用MEF 细胞制成的饲养层上培养胚胎干细胞(ES细胞)的示意图。回答下列问题:

(1)如图1所示,制备细胞悬液时,常用________处理剪碎的组织块,MEF 细胞培养的适宜温度为________℃。当MEF细胞分裂生长到细胞表面相互接触时就停止分裂,这种现象称为细胞的________。

(2)目前使用的或冷冻保存的MEF细胞通常为________代以内,以保持细胞正常的________核型。

(3)在培养液中单独培养ES细胞时,ES细胞容易发生分化,结合图2可推知MEF细胞的作用是________________________________。

【解析】(1)如图1所示,制备细胞悬液时,常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶来处理剪碎的组织块;动物细胞培养的温度为36.5±0.5℃;当MEF细胞分裂生长到细胞表面相互接触时就停止分裂,这种现象称为细胞的接触抑制。(2)为保证细胞正常的二倍体核型,目前使用的或冷冻保存的MEF细胞通常为10代以内的细胞。(3)在培养液中单独培养ES细胞时,ES细胞容易发生分化,结合图2可知加入MEF细胞后ES细胞可以只增殖不分化,故可推知MEF细胞的作用是抑制ES细胞分化。

答案:(1)胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)36.5±0.5接触抑制(2)10

二倍体(3)抑制ES细胞分化

【拓展·探究】

7.2019年11月18日上午,中国诞生了第一块“人造肉”,即“细胞培养肉”。如图是“细胞培养肉”生物制造流程图,请结合所学知识回答下列问题:

(1)生物制造“细胞培养肉”的第一步,就是要获取肌肉干细胞,所谓的“干细胞”是指动物和人体内仍保留着少数具有________能力的细胞。

(2)“细胞培养肉”生物制造的关键技术是动物细胞培养技术,下列有关动物细胞培养叙述不正确的是( )

A.动物细胞培养需要在无菌、无毒的条件下进行

B.在适宜环境中培养,细胞悬液中的细胞很快贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁

C.在适宜条件下,培养瓶中的细胞进行有丝分裂,数量不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖

D.细胞培养肉在上市前不需要进行安全性检测

(3)一般的动物细胞培养需要向培养基中添加一定量的血清,以保证

________________________。

(4)“细胞培养肉”生物制造过程中,肌肉细胞培养需要利用合适的支架体系,请推测其原

因: ____________________________________________________

____________________________________________________________

_____。【解析】(1)动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞,这些细胞叫做干细胞。(2)保证被培养的细胞处于无菌、无毒的环境,即对培养液和所有培养工具进行无菌处理,A正确;在适宜环境中培养,细胞很快贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁,B正确;当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制,C正确;通过细胞工程生产的食品需要进行安全性检测才能上市,D 错误。(3)一般的动物细胞培养需要向培养基中添加一定量的血清,以保证细胞顺利地生长增殖;还需要添加一定量的抗生素,以防止培养过程中被杂菌污染。(4)“细胞培养肉”最终目标是要得到类似于从动物组织中取得的“肌肉”,这就要求细胞生长的环境也跟体内肌肉生长环境类似。所以采用支架体系主要就是模拟体内肌肉生长环境,辅助形成细胞组织的三维结构。

答案:(1)分裂和分化(2)D(3)细胞顺利地生长增殖(4)模拟体内肌肉生长环境,辅助形成细胞组织的三维结构

七动物细胞培养

(20分钟·70分)

一、选择题(共7小题,每小题5分,共35分)

1.某研究小组对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行培养,下列叙述正确的是( )

A.制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织,再用胃蛋白酶处理

B.肝细胞培养过程中向培养液中通入5%的CO2刺激细胞呼吸

C.为了防止培养过程中杂菌的污染,可向培养液中加入适量的干扰素

D.甲、乙细胞在持续的原代培养过程中,乙细胞会出现停止增殖的现象【解析】选D。制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织,再用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理,使组织细胞分散开,选项A错误;肝细胞培养过程中向培养液中通入5%的CO2的目的是维持培养液的pH,而不是刺激细胞呼吸,选项B错误;为了防止培养过程中杂菌的污染,可向培养液中加入适量的抗生素,选项C错误;甲(肝肿瘤细胞)不发生接触抑制现象,而乙(正常肝细胞)具有接触抑制现象,因此甲、乙细胞在持续的原代培养过程中,乙细胞会出现停止增殖的现象,选项D正确。

2.皮肤基底层细胞(干细胞)能通过如图所示的方式修补破损的皮肤。据图判断干细胞的功能是( )

①自我更新②细胞分裂③细胞分化

A.①②

B.①③

C.②③

D.①②③

【解析】选D。由题图可知,干细胞首先通过分裂方式增殖和自我更新,其次通过分化形成组织细胞来修补破损的皮肤。

3.南京农业大学的科研人员用动物干细胞研发出我国第一块肌肉干细胞培养肉,该团队使用第六代猪肌肉干细胞,经过约20天培养得到重达5克的培养肉。下列相关叙述不正确的是( )

A.用胃蛋白酶处理肌肉组织,可以获得分裂能力强的肌肉母细胞

B.生物反应器内应控制温度适宜,并充入一定量的CO2保证培养液的pH 相对稳定

C.培养液中的支架提供了更多的细胞附着面积,有利于细胞贴壁生长

D.“培养肉”的培养有利于工厂化生产

【解析】选A。用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理肌肉组织,可以获得分裂能力强的肌肉母细胞,A错误;动物细胞培养需控制适宜温度,并充入一定量的CO2来维持培养液的pH,B正确;动物细胞培养会出现贴壁生长的特点,培养液中的支架可提供更多的细胞附着面积,C正确;动物细胞培养有利于工厂化生产,D正确。

4.实验小鼠皮肤细胞培养的基本过程如图所示。下列叙述错误的是

( )

A.甲过程需要对实验小鼠进行消毒

B.乙过程对皮肤组织可用胰蛋白酶处理

C.丙过程得到的细胞大多具有异常二倍体核型

D.丁过程得到的部分细胞失去贴壁黏附性

【解析】选C。甲过程表示获取实验小鼠的组织细胞,需要对实验小鼠进行消毒处理,选项A正确;乙表示用胰蛋白酶处理皮肤组织,使其分散

成单个皮肤细胞,选项B正确;丙过程表示原代培养,形成的细胞株遗传物质没有发生改变,具有正常的二倍体核型,选项C错误;丁是传代培养过程,该过程部分细胞遗传物质发生了变化而失去贴壁黏附性,选项D 正确。

【互动探究】

(1)丙、丁过程中通常要向培养箱中通入5%的CO2的目的是什么?

提示:维持培养液的pH。

(2)图示过程中除乙过程需用到胰蛋白酶处理外,还有哪一过程需用胰蛋白酶处理?处理的是什么?

提示:丙过程。处理原代培养时贴壁生长的细胞。

5.在将动物组织块分散成单个细胞时,可以使用胰蛋白酶。由此判断以下推测不合理的是( )

A.动物细胞之间可能依靠蛋白质相互联系

B.一定要注意处理时间、加酶量

C.胰蛋白酶一定不会对动物细胞造成损伤

D.动物细胞培养液的pH应与胰蛋白酶作用的适宜pH基本一致

【解析】选C。胰蛋白酶可使蛋白质分解,由胰蛋白酶可破坏动物细胞之间的联系,可推测动物细胞之间可能依靠蛋白质相互联系;细胞膜中含有蛋白质成分,所以一定要注意处理的时间和酶的用量,以防止对动物细胞造成损伤;酶促反应需要适宜的pH,所以培养液的pH应与胰蛋白酶作用的适宜pH基本一致。

6.有研究表明渐冻症是由于突变的基因导致神经元合成了某种毒蛋白,从而阻碍了轴突内营养物质的流动;也有最新研究结果表明,利用诱导多能干细胞(iPS细胞)制作前驱细胞,然后移植给渐冻症实验鼠,能延长其寿命。下列相关描述错误的是( )

A.诱导多能干细胞分化的实质是基因的选择性表达,细胞种类增多

B.诱导多能干细胞分化成的多种细胞中遗传物质相同,蛋白质不完全

相同

C.诱导多能干细胞分化成多种细胞的过程中核遗传物质逐渐减少

D.植入神经干细胞,使受损的运动功能得到恢复,可以在一定程度上改善“渐冻症”

【解析】选C。诱导多能干细胞分化的实质是基因的选择性表达,细胞分化使细胞种类增多,A正确;诱导多能干细胞分化成的多种细胞中遗传物质相同,蛋白质不完全相同,B正确;诱导多能干细胞分化成多种细胞的过程中核遗传物质不发生改变,C错误;由“有最新研究结果表明,利用诱导多能干细胞(iPS细胞)制作前驱细胞,然后移植给渐冻症实验鼠,能延长其寿命”可推测植入神经干细胞,使受损的运动功能得到恢复,可以在一定程度上改善“渐冻症”,D正确。

7.哈佛大学的科学家从怀孕妇女胎盘的羊水中提取了干细胞,并在实

验室培养后生成了多种人体组织和器官,如骨骼、肌肉、肝脏等。下列有关叙述错误的是( )

A.该研究说明提取的干细胞是全能干细胞

B.这些干细胞与由其生成的肌肉细胞的染色体组成相同

C.这些干细胞在器官移植上将有较好的医学用途

D.这些骨骼、肌肉的形成与细胞分裂和分化有关而与细胞凋亡无关【解析】选D。干细胞在实验室培养后能生成多种人体组织和器官,这说明干细胞具有发育的全能性,A正确;细胞分化的实质是基因的选择性表达,细胞中的染色体数目不变,因此干细胞与由其生成的肌肉细胞的染色体组成相同,B正确;这些干细胞能培养形成人体组织和器官,在器官移植上将有较好的医学用途,C正确;这些骨骼、肌肉等的形成与细胞分裂和分化有关,与细胞凋亡也有关,D错误。

二、非选择题(共2小题,共35分)

8.(18分)下图所示为人类“治疗性克隆”的大概过程,回答下列问题:

(1)在培养体细胞时需要创造无菌无毒的环境,“无菌无毒环境”中的“毒”是指________。对培养液进行____________(举两项)操作,可创造无菌无毒的环境。

(2)植物组织培养有一项应用是培育“脱毒苗”,脱毒苗中的“毒”是指________,此过程常常选取茎尖作为外植体,其依据是

__________________。

(3)若将上述结果用于白血病患者的骨髓移植,如果图中患者是A型血,提供卵细胞的女性是AB型血,则骨髓移植成功后患者的血型是

________型。按上述方法克隆的器官在移植方面的主要优点是

______________。

【解析】(1)“无菌无毒环境”中的“毒”是指代谢废物。在培养液中添加一定量的抗生素,可以防止杂菌污染;定期更换培养液,可以清除代谢废物,防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害,进而创造无菌无毒的环境。(2)脱毒苗中的“毒”是指病毒,由于茎尖的病毒极少,甚至无病毒,故此过程常常选取茎尖作为外植体。(3)若将上述结果用于白血病患者的骨髓移植,如果图中患者是A型血,提供卵细胞的女性是AB型血,由于细胞核中的遗传物质仍来自患者,故骨髓移植成功后患者的血型仍为A型。按上述方法克隆的器官没有免疫排斥反应,有利于移植器官的存活。

答案:(1)代谢废物灭菌,添加一定量的抗生素、定期更换培养液(写出两项即可)(2)病毒茎尖的病毒极少,甚至无病毒(3)A没有免疫排斥反应

9.(17分)某生物兴趣小组对一种抗癌新药进行实验时,以动物肝癌细胞为材料,测定抗癌药物对体外培养细胞增殖的影响。请回答下列有关动物细胞培养的问题。

(1)在动物细胞培养时,将细胞所需的营养物质按其种类和所需量严格配制而成的培养基称为________培养基。通常在培养基中还需要加入适量____________________等一些天然成分。细胞培养应在含5% CO2

的恒温培养箱中进行,另外,还应该保证被培养的细胞处于

__________、________的环境。

(2)在细胞生长过程中,当细胞贴壁生长到一定程度时,其生长会受到

抑制,这种现象称为

__________________________________________。

(3)为了防止细胞培养过程中细菌的污染,可向培养液中加入适量的

____________。

(4)请你帮助兴趣小组的同学分析本实验,实验的自变量是________

________________________,实验组和对照组除了自变量不同外,其他处理均应该相同,这是遵循实验设计的________原则。

【解析】(1)将动物细胞所需要的各种营养物质按其种类和所需量严格配制而成的培养基,称为合成培养基。由于对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚,因此,在使用合成培养基时,还要加入一些动物血清等

天然成分。被培养的细胞必须处于无菌、无毒的环境中,才能保证细胞正常地生长增殖。(2)动物细胞在分裂、生长过程中有接触抑制的现象。

(3)抗生素能杀死培养基中的微生物,保证无菌无毒环境。(4)要测定抗癌药物对体外培养细胞增殖的影响,实验的自变量为抗癌药物的有无,其他无关变量应该相同,否则会干扰实验结果,这种设计遵循的是实验的单一变量原则。

答案:(1)合成血清无菌无毒(2)接触抑制(3)抗生素(4)

是否加入抗癌药物单一变量

(10分钟·30分)