酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定

实验酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定

【课前预习】

1. 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？

2．如何从酵母中提取到较纯的RNA?

3．干扰RNA的提取的物质有哪些并设计排除这些干扰的实验。

4．干扰紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度实验的物质有哪些？

【目的要求】

1. 了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。

2. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。

3. 学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。

【基本原理】

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2. 67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。

核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升溶液中含有1克

原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。

核酸摩尔消光系数及相应光吸收值

ε(P)

含磷量/(%) A260nm

pH7，260nm 1μg/mL RNA 7700-7800 9.5 0.022-0.024 DNA-Na盐6600 9.2 0.02

（小牛胸腺）

蛋白质也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm 与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nmx吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先除去。

【实验用品】

1.试剂

1) 0.04M NaOH溶液；

2) 95%乙醇；1.5M硫酸；

3) 浓氨水；

4) 0.1M硝酸银；

5) 酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl；

6) 三氯化铁浓盐溶液：将2mL 10％三氯化铁（FeCl3· 6H2O）溶液加入400mL浓HCl；

7) 苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95％乙醇100mL。

8) 定磷试剂：

（1） 17％硫酸：将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中；

（2）2.5％鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中；

（3）10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL 水，棕色并保存溶液；

临用时将三种溶液和水按下列比例混合： 17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）。

9) 钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。

10) 5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。

11) 钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。

12) 5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。

2.测试样品

干酵母粉。

3.器材

移液管0.2mL（×1），0.5mL（×2），1mL（×4），2mL（×4）；滴管；容量瓶50mL（×3）；量筒10 mL（×1）；离心机；分光光度计；冰浴；水浴锅。

【方法步骤】

1.酵母RNA提取

称5g干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入10m L酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次。再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算。

2. RNA组份鉴定

取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。

1) 嘌呤碱：取水解液1mL 加入过量浓氨水。然后加入1mL 0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。

2) 核糖：取水解液1mL，三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中1 0min。注意观察核糖是否变成绿色。

3) 磷酸：取水解液1mL，加定磷试剂1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。

3. 紫外吸收法测定核酸的含量

1) 准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01mol/L NaOH调成糊状，再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。

2) 取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min。

3) 在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至5 0mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。

【实验结果】

1.干酵母粉RNA粗品的含量：

2.记录RNA组份鉴定各管的现象；

3.计算干RNA粉中核酸的含量：

式中，为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值；

L──比色杯的厚度，1cm；N为稀释倍数；