层析法导论
层析法
硅胶吸附柱色谱技术实际应用色谱法，又称层析法.是一种以分配平衡为机理的分配方法.色谱体系包含两个相,一个是固定相,一个是流动相.当两相相对运动时,反复多次的利用混合物中所含各组分分配平衡性质的差异,最后达到彼此分离的目的.色谱法从发明到现在已有八十多年的历史.它是纯化和分离有机或无机物的一种方法.色谱法按固定相的状态可分为柱色谱.平板色谱和棒色谱三种而实验室中最常用的是柱层析和薄层层析,以及它们之间的配合应用.[1]柱层析[2]1 吸附色谱地原理在一定条件下,硅胶与被分离物质之间产生作用,这种作用主要是物理和化学作用两种.物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间的范德华力.化学作用主要是硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢键作用.2操作步骤2.1 硅胶准备[3]硅胶一般选用250-400目(即40-63μm直径的硅胶颗粒),根据ΔRf选用硅胶的用量.2.2 实验仪器准备一支玻璃色谱柱,一个铁架台,烧杯,锥形瓶,径口直径较大的玻璃漏斗,一支玻璃棒,2.3 装柱[4]2.3.1 吸附剂的加入①干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞，加入适量的流动相，旋开活塞使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。
操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。
②湿法：将吸附剂与流动相混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱管中，然后再加入流动相，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整。
俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下，液面将柱表面相平时，即加试样溶液.2.3.2试样的加入①将试样溶于层析时使用的流动相中，再沿色谱管壁缓缓加入。
注意勿使吸附剂翻起。
或将试样溶于适当的溶剂中。
与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状；将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。
如试样在常用溶剂中不溶解，可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。
层析分离技术导论
目录
? 柱层析分离的基本概念及其特点 ? 柱层析分离的分类和基本原理 ? 硅胶柱层析的应用
1. 柱层析分离的基本概念 :
? 柱层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分 混合物中各组分的 物理化学性质的差异 ，使各组
分以不同程度分布在两个相 （固定相和流动相）
中。
? 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物 理化学性质的差异，在固定相和流动相之间经过 多次分配 （吸附 -解吸-再吸附 -再解吸 …… ）以 不同的速率移动 ，从而达到分离的目的。
? V0——凝胶颗粒之间空隙的总体积 （即外水体积） ； ? Vi——凝胶颗粒内部空隙的总体积 （即内水体积） ； ? Vm——凝胶颗粒基质本身所占体积。
? 某溶质分子充满层析柱的体积（即洗脱容积Ve）为：
Ve=V0+ Kd Vi → Kd=(Ve-V0)/Vi
? Ve——被测分子的保留体积（见层析曲线） ? V0——可采用一个分子量远超过凝胶排阻极限的有色分子来测定，此时
柱层析的基本原理
利用待分离物质中各组分与固定相和流动 相的相互作用不同，通过多次相互作用将 不同组分逐渐分离。
柱层析的基本原理
1.吸附层析
? 原理：混合物随流动相通过固定相（吸附剂） 时，由于固定相对不同物质的 吸附力不同 而使 混合物得到分离。
? 传统吸附剂： 氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙 等。
? 在凝胶层析中衍生出 分配常数Kd
1．分配系数
分配系数 K
? 在分配层析中 ，分配系数：类似于溶剂萃
取中的分配系数 K=cs/cm
? cs、cm分别为溶质在固定相和流动相中的浓度， ? K为分配系数。
? 在一定温度下，当溶质的浓度较低时， K为常数——线性 色谱；
层析理论及技术
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Biochemistry experiment 8
2012-7-7
凝胶柱的选择
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Biochemistry experiment 8
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凝胶的前处理
a. 溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水 浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去 上层悬浮物及蒸馏水。 b. 碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。 c. 酸洗：用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。 d. 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液 pH与起始缓冲液相同。
根据层析分离机制
根据操作形式不同
4
按层析过程的机理分类：
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Biochemistry experiment 8
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离子交换层析法原理
利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同。 特点：利用带有相反电荷的颗粒之间具有 引力作用 固定相：带有大量电荷的离子交换剂 流动相：具有一定pH值和一定离子强度的 电解质溶液 常采用柱层析 洗脱方法：增加离子强度、改变pH值。
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上柱、洗脱、收集
a. 如图装好层析装置，打开下端出 口，使溶液流出至刚好达到凝胶 胶面 b. 沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下 端出口，使样品溶液流出至刚好 达到凝胶胶面，再取少量起始缓 冲液洗涤柱壁。 c. 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 d. 用自动部分收集器自动或手动收 集，合并同一高峰各管。
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装柱
a. 将层析柱垂直固定，加入适 量溶剂排走空气。 b. 将平衡好的凝胶搅匀，连续 倾入柱中，待其自然沉降至 1/4~1/3高时打开下端出口， 让溶剂慢慢流出，继续侵入 凝胶至沉降到所需高度。装 柱时要注意操作压。 c. 用3-5倍柱床体积的起始缓冲 液走柱，使交换剂充分平衡， 柱床稳定。
蛋白质化学中的层析技术
1、盐析法
盐离子与水分子作用，原来溶液中大部 分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降 低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破 坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋 白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。
2、等电点沉淀
在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白 质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉 淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子 散开，溶入水中。
大颗粒
低
短
快
2、离子交换剂的处理
膨化
将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙 增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。
水悬浮
去除杂质和细小颗粒
酸碱浸泡
进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子， 一般阳离子交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用 酸HCl处理。
3、缓冲液的选择
二、层析的分类
按固定相基质的形式： 柱层析、纸层析和薄层层析
根据流动相的形式： 液相层析、气相层析
凝胶过滤
离子交换
疏水层析
原理
亲和层析
吸附层析
分配层析
三、层析前蛋白质处理
主要是利用盐析法、等电点沉 淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的 蛋白与其它较大量的杂蛋白分开， 这些方法的特点是简便、处理量大、 既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白 质，但分辨率低。
弱碱性、阴离子交 换剂
DEAE+
Cl—
3.5±0.5
弱碱性、阴离子交 换剂
QAE+
Cl—
3.0±0.4
CM-A- sephadex 25
CM- sephadex A-50 SP- sephadex A-25 SP- sephadex A-50
弱碱性、阳离子交 换剂
纸层析法原理
纸层析法原理纸层析法（paper chromatography）是一种用于分离和分析物质混合物中不同成分的分析方法。
它基于物质在固定相（纸张）和移动相（溶剂）之间的分配系数差异，通过将溶液在纸上上升的方式实现对物质混合物的分离。
纸层析法的原理基于两个基本概念：吸附和分配。
纸张作为固定相，其纤维结构提供了大量的表面积，能够吸附物质分子。
不同物质在纸上的吸附程度不同，具有不同的极性特性的物质通常会更强烈地吸附在纸上。
溶剂作为移动相，通过一种被称为毛细作用的现象，沿纸张上升。
物质分子会在溶剂和纸之间相互分配，根据其在两相之间的亲疏水性质和互相作用力的差异，以不同速度通过纸层。
在进行纸层析前，需要将待测试的样品溶解在适当的溶剂中，制备成试样溶液。
通常情况下，试样溶液会被滴在纸张的一端，然后将纸的一端浸入移动相中。
随着溶剂的上升，各个组分会在纸层上逐渐分离。
当溶剂上升到一定高度时，纸层析过程结束。
纸纤维上形成的带状物质分离区域被称为“色带”。
根据样品中的不同成分相对于溶剂的运动速度差异，色带会出现分离，不同的成分会呈现不同的颜色。
在分析过程中，可以利用标准物质进行比较，通过测量色带的长短和相对迁移距离，可以确定待测样品中各个成分的相对含量。
此外，可以根据不同色带的颜色和相对迁移距离，与已知物质的对照进行比对，推断待测样品中的化合物类型。
纸层析法是一种简单、快速、经济的分析方法，广泛应用于化学、生物化学、医学、食品分析等领域。
它不仅可以对有机物和无机物进行分离和分析，还可以进行某些药物的纯度检验、饮料中添加物的检测等。
然而，纸层析法在分离效果和分析准确度上相对其他分离技术有一定的局限性，因此需要在具体应用中选择适当的实验条件和纸张种类。
层析法-理论ppt课件
方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。
学习指导层析技术
学习指导——层析技术层析技术概述层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。
层析技术操作简便，样品可多可少，既可用于实验室的研究工作，又可用于工业生产，还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。
1.层析的基本概念（1）固定相固定相是层析的一个基质。
它可以是固体物质(如吸附剂，凝胶，离子交换剂等)，也可以是液体物质(如固定在硅胶或纤维素上的溶液)，这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。
它对层析的效果起着关键的作用。
（2）流动相在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。
柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
它也是层析分离中的重要影响因素之一。
（3）分配系数及迁移率(或比移值)分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量(浓度)的比值，常用K 来表示。
分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。
K = C s / C m其中C s：固定相中的浓度，C m：流动相中的浓度迁移率(或比移值)是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。
常用R f来表示。
(R f 大于或等于1)可以看出：K 增加，R f减少；反之，K减少，R f 增加。
实验中我们还常用相对迁移率的概念。
相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。
它可以小于等于1，也可以大于1。
用Rx 来表示。
不同物质的分配系数或迁移率是不同的。
分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。
很显然，差异越大，分离效果越理想。
分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。
层析(色谱)技术课程讲义(45页)
层 析 仪 器
层 析 仪 器
紫外检测器
记录仪
泵
收集器
层析柱
第一节 概 述
有关历史和专有名词
色谱法是一种物理或物理化学的分 离分析方法．它的分离原理是：混合物 中各组分在两相间进行分配，其中一相 是不动的，称为固定相 (stationaryphase)；另一相是携带混 合物流过固定相的，称为流动相 (mobilephase)。
位。
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HPLC方法，多采用紫外检测器，若使 用荧光检测器或电化学检测器，可使灵敏 度提高2～3个数量级．对剂量较小、体内 浓度较低的药物可使用荧光或电化学检测 器，但不是所有的物质都有荧光，不能产 生荧光的药物可经衍生化作用形成带荧光 化合物，再用荧光检测器检测，电化学检 测器只能检测具有氧化还原性的药物．
薄层色谱法能合理选择固定相，这种方 法 是 在 1938 年 由 Izmailov 和 Shraiber 首 先 使 用的，50年代末Stahl首次提出薄层色谱法这 个名词。
4
1941 年 Martin 和 Synge 因 对 色 谱 法 的 贡献而获得诺贝尔奖 。1952年Martin 和 James 发 表 了 第 一 篇 气 相 色 谱 法 的 论 文 。 从1952年到60年代，气相色谱法发展很快。
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三、按实验操作形式分类
1．柱色谱法 将固定相装于柱管内构成色谱柱，色谱过程 在柱内进行。按色谱柱的不同又可分为填充 柱、毛细管柱及微填充柱色谱。气相色谱法、 高效液相色谱法均属于柱色谱范围。
2．纸色谱法 用纸作为支持物(固定相)，点样后，用流动 相展开，以达到分离检测的目的。
3．薄层色谱法 将固定相涂铺在玻璃板上，按纸色谱法操作。
第七章 层析分离技术(7)反相层析
本章内容
7.1 层析技术导论 7.2 凝胶过滤层析 7.3 离子交换层析 7.4 亲和层析 7.5 固定金属离子亲和层析 7.6 疏水作用层析 7.7 反相层析
7.7 反相层析
一、基本原理 二、反相介质的种类 三、特点及用途 四、影响因素 五、高效液相色谱简介
7.7 反相层析
五、高效液相色谱简介
1. 基本原理
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）与经典的色谱法 （或层析法）的分离机制类似——混合物在 流动相和固定相之间的分配系数不同，在两 相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解 吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大 的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出。
5. HPLC在蛋白分离中的应用及操作规程
（1）色谱柱的选择：根据被分离蛋白的性质，选择适当的分离模式和不 同规格和性能色谱柱。
凝胶色谱 反相色谱
样品制备步骤：取材→匀浆→预分离→浓缩→溶解 保持蛋白活性的措施：低温操作、添加蛋白酶抑制剂等 提高蛋白溶解性的措施：适当加入表面活性剂、变性剂等 在进样之前最好用0.45μm/0.22 μm膜过滤。
层析介质（如硅胶）在高pH下不稳定； 很多组分在低pH下具有较好的溶解性； 低pH抑制了样品组分中酸性基团及硅胶上硅醇基的解离； 为了使流动相保持在低pH下，在流动相中加入酸（如三氟乙酸
（TFA））。
2. 洗脱模式
由于溶质中不同组分的疏水性强弱不同，与固定相 结合的牢固程度不同，在起始条件下，极性很强的 组分不能结合在固定相上面直接被洗脱，其余组分 结合在固定相表面，为了将这些组分洗脱下来，必 须降低流动相的极性，即增加流动相中有机溶剂的 比例。因此，反相层析的洗脱过程中流动相的组成 随时间而变化。
层析法概述
第五章 层析法5.1 层析法概述5.2 柱层析5.3 平面层析 5.1 层析法概述前述各种分离方法，都属于经典分离法。
如前所述，这些方法利用被分离组分的某种差异，在许多情况下，可以收到很好的分离效果，然而它们有一个严重的局限性：被分离组分之间必须具有质的差异（例如，溶解与不溶解，吸附与不吸附……等等）；如果仅是量的差异（例如，溶解度大与溶解度小，吸附性强与吸附性弱……等），这些方法常常难以收效。
而层析法则是一类与上述经典分离方法具有本质差异的分离手段，它尤其适用于彼此性质差异较小的混合组分的分离，并能获得高效分离结果。
在层析法中通常具有固定相和流动相，进行分离时，该二相处于相对运动状态；被分离的各组分，由于其结构性质的差异，导致它们对上述两相的亲和力各不相同，由此也导致它们在两相中的迁移速度产生差别；当这些组分在相对运动的两相中反复分配时，其迁移速度的差异，经反复累积，必然使其相互间的距离不断扩大，从而导致最终实现分离；如果该层析是在层析柱中进行，则可见到被分离各组分所形成的层析谱带，处于层析柱中由上到下的不同位置（下图A ），如果是在某层析平面上进行，也可见到它们处于平面中的前后不同位置（下图B ），因而达到分离目的。
图A 柱层析示意图： 图B 平面层析示意图：常规方法难以分离的成分，常可借层析法得以分离，一般能够得到单体成分；甚至同分异构体，有时也能获得很好地分离。
欲获得某种高纯度的天然药物成分，而常规方法又难以实现时，层析法不失为一种值得考虑的有效方法，尤其是在天然产物混合成分的检测分析中，该法更为有效和实用。
层析法按流动相不同，可分为气相层析和液相层析：气相层析（GC ），流动相为气体； 液相层析（LC ），流动相为液体。
液相层析分类如下页表1所示。
表1 液 相 层 析 法 分 类分离前分离后 -------------------------分离前 分离后5.2 柱层析5.2.1 吸附层析5.2.2 分配层析5.2.3 离子交换层析5.2.4 凝胶层析5.2.5 层析法的选择应用5.2.1 吸附层析5.２.1.1基本原理 3 个5.２.1.2基本操作 6 个主要步骤5.２.1.3 常用方法 4 种5.2.1.1基本原理一、吸附层析3 原理1. 利用（被分离成分间的）吸附性差异进行分离。
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-
H 3N Na
+
+
H 3N
+
+
COO
-
H
+
OH
-
=H
2O
COO
-
pH4.5
SO 3 Na
pH4.5
5
分子篩選層析
• 分 子 篩 選 層 析 (size(size-exclusion chromatography ； SEC)：此一技術的特點為 使用具有特定立體網狀孔隙大小的膠體顆粒 （ 圖 10-10 ）， 或高 分子聚合 凝膠作為 固定 相，適用於較大分子量（約2 kDa以上）試樣 的層析。若固定相膠體為疏水性質，稱為膠 體滲透層析 (gel permeation chromatography； GPC)；相對的，親水性者則稱作膠體過濾層 析(gel filtration chromatography；GFC)。移動 相一般為液體，若層析時需要外加電壓產生 電場，則稱電泳(electrophoresis)。
第十章 層析法導論
Principles of Chromatography
前言
色層分析法簡稱層析法 (chromatography)，是一種物理 或物理化學分離分析方法。根據希臘字 chroma-意指顏色 color， graphy-意指 writing(書寫 )-而命名之。 從本世紀初起，特別是在近 50年中，由於氣相層析法、 高效液相層析法及薄層色層分析法的飛速發展，而形成一 門專門的科學 —層析學。色層分析法已廣泛應用於各個領 域，成為多組分混合物的最重要的分析方法，在各學科中 有著重要作用。 歷史上曾有兩次諾貝爾化學獎是授予層析研究工作者 的： 1948 年瑞典科學家 Tiselins因電泳和吸附分析的研究 而獲獎， 1952年英國的 Martin和 Synge因發展了分配層析 而獲獎；此外在 1937～ l972年期間有 12次諾貝爾獎的研究 中，色層分析法都起了關鍵的作用。
• Tswett 在 1906 年發表的論文 中 稱 此 分 離 技 術 為 chromatography （ 直 譯 為 「色層分析 色層分析 」），而色帶則 稱為 chromatogram（直譯為 「色層圖譜 色層圖譜」）
1.基本原理 1.基本原理
後來不僅用於分離有色物質，還用於分離無色物質，並出現 了種類繁多的各種層析法。許多氣體、液體和固體樣品都能找 到合適的層析法進行分離和分析。 目前層析法已廣泛應用於許多領域，成為十分重要的分離分 析手段。但不管屬於哪一類層析法，其共同的基本特點是具備 兩個相：不動的一相，稱一為固定相 (stationary phase)；另一 相是攜帶樣品流過固定相的流動體，稱為流 (移 )動相 (mobile phase)。 當流動相中樣品混合物經過固定相時，就會與固定相發生作 用，由於各組成分在性質和結構上的差異，與固定相相互作用 的類型、強弱也也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同 組成分在固定相滯留時間長短不同，從而按先後不同的次序從 固定相中流出。
+ + + + + +
儀器分析 張永鍾、林志城 編著
儀器分析 張永鍾、林志城 編著
MECHANISM OF IONION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS
pH2
Chromatography of Amino Acids
Stationary Phase
3 +
儀器分析 張永鍾、林志城 編著
儀器分析 張永鍾、林志城 編著
4
•液液分配層析的分離原理 分離原理 基本與液液萃取相同，都是 根據物質在兩種互不相溶的 液體中溶解度的不同，具有 不同的分配係數。所不同的 不同的分配係數 是液液層析的分配是在柱中 液液層析的分配是在柱中 進行的，使這種分配平衡可 反復多次進行，造成各組分 的差速遷移，提高了分離效 率，從而能分離各種複雜組 分。
3
儀器分析 張永鍾、林志城 編著
分配層析
• 分配層析(partition chromatography)的分離作用力來自分析 分離作用力來自分析 成分在二相之間的溶解度分布平衡，因此固定相必須為無移 無移 成分在二相之間的溶解度分布平衡 動性的 (immobilized)液體 ，通常是固體支撐物表面上或者毛 細管柱內壁上的一層薄膜（圖 10-7）。此外，也可由正相透 過 化學性鍵結衍生而得 ，如：矽膠表面的高極性矽醇基 (silanol group， Si-OH)，以氯化二甲基矽烷(alkyl dimethyl silyl chloride)衍生成低極性二甲基矽烷基 (Si-O-Si (CH3)2R)，此種固定相則稱為逆相 逆相 (reverse phase)（圖 10-8）。使 用 這 種 逆 相 的 分 配 層 析 屬 於 結 合 相 層 析 (bonded(bonded-phase chromatography) ， 是 目 前 高 效 能 液 相 層 析 (high performance liquid chromatography； HPLC)系統最常用的 管柱類型，例如： RP矽膠表面鍵結衍生為二甲 RP-18管柱 ，即矽膠表面鍵結衍生為二甲 基矽十八烷基的逆相管柱，液體或氣體的移動相在分配層析 基矽十八烷基的逆相管柱 均可使用，技術上為移動、固定二相必須不互溶且極性相反 為宜，液－液相層析就因固定相溶解問題而使得應用上多所 限制，但液－鍵結相層析即無此缺點，因此成為應用主流。
以超臨界流體 超臨界流體 為流動相的層析稱為超臨界流體層析 （supercritical-fluid chromatography, SFC）。
C．按分離機制分類
1. 利用組成分在吸附劑（固定相） 吸附劑（固定相）上的吸附能力強弱不同而得 以 分 離 的 方 法 ， 稱 為 吸 附 層 析 法 (adsorption chromatography) chromatography) ，又稱液-固層析。 2. 利用組成分在惰性固體上的液體（固定相） 惰性固體上的液體（固定相）中溶解度不同 (即在二不互溶液體間之分配係數的差異 )，以萃取法而達到分 離的稱為分配層析法 分配層析法(partition chromatography) chromatography) ，又稱液-液 層析。 層析 3. 利用組成分在離子交換樹脂（固定相） 離子交換樹脂（固定相）上的親和力大小不同 而 達 到 分 離 的 方 法 ， 稱 為 離 子 交 換 層 析 法 (ion(ion-exchange chromatography) chromatography 。 4. 利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透 多孔固定相中的選擇滲透而達到分離 的方法，稱為凝膠滲透層析法或尺寸排阻層析法 凝膠滲透層析法或尺寸排阻層析法或分子篩層析 分子篩層析 法 (gel-permeation chromatography; size exclusion chromatography)。 5. 最近，又有一種新分離技術，利用不同組成分與固定相（固 定化分子）的高專屬性親和力進行分離的技術稱為親和層析法 親和層析法 (affinity chromatography) ，常用於蛋白質的分離。
1
• 因此層析的組成要件有三個，分別 為：樣品、固定相與移動相 樣品、固定相與移動相，三者間 關係如圖 10-2所示，也就是說，固定 相與移動相競爭樣品中各成分物質， 但固定相與移動相間則不能有交互作 用。所以層析原理是利用試樣混合物 中各成分受到固定相與移動相不同作 用力而分離(separation)，達到層析之 目的。
儀器分析 張永鍾、林志城 編著
3.層析法的特點
（1）分離效率高 （2） 靈敏度高 可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至 ng.g-1(10-9)級的物質量。 （3） 分析速度快 一般在幾分鐘或幾十分鐘內可以完成一個試樣的分析。 （4） 應用範圍廣 氣相層析：沸點低於400℃的各種有機或無機試樣的分析。 液相層析：高沸點、熱不穩定、生物試樣的分離分析。
層 析 分 離 法 原 理 ex.TLC ( 薄 層 層 析 法 , Thin Layer Chromatography ) 1.2
平板(面)層析
管柱層析
B．按兩相狀態分類
氣體為流動相的層析稱為氣相層析（GC），根據固定相是固 體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機化合物液 體），又可分為： 氣-固層析（gas-solid chromatography: GSC） 氣-液層析（gas-liquid chromatography: GLC） 氣-鍵結相層析（gas-bonded phase chromatography） 固定相為鍵結在固體表面上的有機物種，其平衡類型為試料 成分在氣體和鍵結相表面之間分配。 液體為流動相的層析稱液相層析（LC）。同理，液相層析亦 可分為： 液-固層析（liquid-solid chromatography: LSC） 液-液層析（liquid-liquid chromatography: LLC） 液-鍵結相層析（liquid-bonded phase chromatography）
二、分配層析分離 過程
當試樣由移動相攜帶進入管 柱與固定相接觸時，被固定相 溶解或吸附; 隨著移動相的不斷通入，被 溶解或吸附的組成分又從固定 相中溶出或脫附; 溶出或脫附下的組成分隨著 移動相向前移動時又再次被固 定相溶解或吸附; 隨著移動相的流動，溶解、 揮發，或吸附、脫附的過程反 復地進行。
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緣起
1906年俄國植物學家茨維特 (Michael Tswett)分離植物 色素時首次採用。
碳酸鈣
一、 層析法的特點、分類和作用
概述 混合物最有效的分離、分析方法。 俄國植物學家茨維特在1906年使用的裝置 層析原型裝置，如圖。 試樣混合物的分離過程：也就是試樣中 各組成分在稱之為層析分離柱中的兩相間 ，不斷進行著的分配過程。 其 中 的 一 相 固 定 不 動 ， 稱 為 固 定 相 (Stationary phase) ；另一相是攜帶試樣混 合物流過此固定相的流體（氣體或液體） ，稱為流 流(移)動相(mobile phase)。