基因诊断
基因诊断技术简介
基因诊断的特点
直接针对治病基因进行检测，揭示疾病形 成或发展的根本原因。
特异性强、灵敏度高、稳定的结果、快 速…….最重要的一点：还没发病，就可以 预测发病！----基因型与表型。
遗传病基因诊断流程
1. 需要临床医师与实验室技师的密切配合。 2. 接诊患者，遗传咨询，疾病初步诊断。 3. 详细记录病史、画家系图、记录电话地址…. 4. 选用适当的基因诊断项目（尽量将现有技术用
3. 我中心现在选用45CA、 49CA、50CA 、Dys-II和Dystrophin基 因3’CA等位点进行连锁分析，这些连锁位点与Dystrophin基因 是高度连锁的，但是仍然存在STR位点与致病基因之间偶然发 生基因重组的可能性，如果重组不幸发生，STR位点连锁分析 的结论不可避免地会出现错误，受检者需要自己承担因为基因 重组而导致结论错误的风险。
基因诊断技术简介
基因
基因：负责编码一条多肽链的所有核酸序列。 编码区和调控区; DNA和RNA; 外显子和内含子； STR
“基因诊断”概念中的基因是广义的基因概念， 病毒、细菌、人…的核酸序列及功能。
什么是基因诊断？
基因诊断主要是应用分子生物学技术，检 测人体某些基因结构或表达的变化，或者 检测病原体基因组在人体的存在，从而达 到诊断疾病或监控疾病的目的。
单基因遗传病之一：DMD/BMD
缺失分析（直接诊断）步骤
1. 取患者外周血2mL。 2. 盐析法提取外周血中有核细胞基因组DNA。 3. 多重PCR分两组各扩增患者Dystrophin基因9个外显子（共18
个外显子，分别为外显子1、3、4、6、8、12、13、17、19、 43、44、45、47、48、50、51、52、60），聚丙烯酰胺电泳 检测产物。共18个基因位点），扩增中设置阴阳性对照及内 对照。 4. PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染观察，设置 100bp分子量标记判断扩增片段大小。 5. 如发现缺失，单独扩增验证。 性别鉴定。绝大部分的DMD患者为男性，但是仍然有极少 数女性患DMD的报告。受检者需要自己承担女性胎儿患病 风险。
基因诊断的名词解释
基因诊断的名词解释
基因诊断是一种现代生物学技术，用以识别和分析某一特定体内的致病基因突变或变异位点，以及检测人类基因型，以便确定个体对特定疾病的易感性。
它也被用于生殖医学，包括诊断胎儿携带遗传疾病的风险。
基因诊断的最终目的，是帮助临床医生确定最佳的治疗方案，并且能够提前发现可能出现的疾病，以预防和控制它们的发展。
基因诊断是一个复杂的、跨学科的技术，具体的步骤需要借助基因技术和全面的基因测序，以及先进的计算机技术和统计学。
疾病基因诊断通常从先前发现的致病基因突变为基础，然后用携带突变的体确定个体是否易于某种遗传病，或者是否携带特定病因因子。
在这方面，病历记录、家系病史和临床表现也会被结合起来用于判断。
在生殖诊断中，基因诊断也可以用来检测男性和女性在排卵和受精过程中的基因变化。
这可以帮助医生给出准确的诊断，以及相应的治疗建议。
染色体分析也是用来检查胚胎携带的体细胞染色体缺失的重要工具。
基因诊断是一项涉及复杂的技术，其关键在于以正确的方法对表达型和变异数据进行确认，以及总结出有意义的结论。
在实施这一技术时，需要严格遵守道德原则，有效地保护患者的隐私。
基因技术正在不断发展，开发出更多先进的基因诊断技术，更好的了解遗传和性状的相互关系。
总而言之，基因诊断不仅有助于疾病的早期识别和预防，而且还有助于更准确地识别疾病以及有效治疗和管理有关疾病，从而改善患
者的生活状况。
临床医生可以通过基因诊断更精确地识别病人可能遭受的风险，从而改善治疗与管理病人的结果，并使他们受益。
基因诊断
RFLP分析法 限制酶酶切图谱直接分析法 RFLP间接分析法
（1）限制酶酶切图谱直接分析法
① 限制酶酶切—Southern印迹杂交。 ② PCR—限制酶酶切
应用RFLP诊断镰刀状红细胞性贫血
正常人珠蛋白基因
正常人珠蛋白mRNA 6 CTC GAG Glu 6 CAC
正常人珠蛋白肽链
HbS的珠蛋白基因
HbS的珠蛋白mRNA
HbS的珠蛋白肽链
GUG Val
MstⅡ酶切位点 CCTNAGG A T替换
MstⅡ酶 CCTNTGG
HbA ---------CCT GAG GAG-------
MstⅡ 1.1kb
HbS
MstⅡMstⅡ 0.2kb
---------CCT GTG GAG-------
• 2、聚合酶链反应的发明 • 直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外 无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA 的体内 复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种 合适条件。开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段 来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此， 每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多 份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA 聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus 公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成 为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金。
第一节
基因诊断 的技术方法
一、基因诊断中常用的分子生物 学技术 （一）核酸分子杂交 （二）聚合酶链反应（PCR） （三）单链构象多态性检测 （四）限制酶酶谱分析 （五）DNA序列测定 （六）DNA芯片技术
基因诊断的名词解释_分类_举例_的基本原理
基因诊断的名词解释_分类_举例_的基本原理基因诊断的名词解释基因诊断可分为基因直接诊断和基因间接诊断。
核酸分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。
基因诊断技术它的基本原理是互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。
限制性核酸内切酶是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。
它们的发现和应用为从基因组中分离目的基因提供了必要的手段。
基因诊断的分类基因诊断可分为两类：基因直接诊断直接检查致病基因本身的异常。
它通常使用基因本身或紧邻的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，以探查基因无突变、缺失等异常及其性质，这称为直接基因诊断，它适用已知基因异常的疾病;基因间接诊断当致病基因虽然已知但其异常尚属未知时，或致病基因本身尚属未知时，也可以通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。
连锁分析是基于紧密连锁的基因或遗传标记通常一起传给子代，因而考察相邻DNA是否传递给了子代，可以间接地判断致病基因是否传递给子代。
连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。
RFLP、VNTR、SSCP、AMP-FLP等技术均可用于连锁分析。
遗传病的基因诊断举例1.基因缺失型遗传的诊断(1)α地贫的基因诊断：α地贫主要是由于基因缺失引起的，缺失的基因可以由1-4个。
正常基因组用BamHⅠ切割，可以得到一个14kb的片段，而缺失一个α基因时切点向5’端移位，得到一条10kb的片段。
因此，当用α基因探针与基因组DNA 进行Southern杂交时(图13-8)，在α地贫2可见一条14kb和一条10kb的带，在正常人可见一条双份的14kb的带，而在α地贫1则见一条单拷贝的14kb带，血红蛋白H病时只有一条10kb的带的，而在Barts水肿胎时，则无任何杂交带。
一种较简便的方法是直接用α探针进行斑点杂交，自显影后根据斑点深浅的不同也可以对α地贫作出诊断。
基因诊断技术及其在医学中的应用
基因诊断技术及其在医学中的应用随着基因科技的快速发展，基因诊断技术的应用越来越广泛。
基因诊断技术是指通过检测人体基因组中的特定基因或基因组变异，确定该个体是否患有某种疾病或其患病风险程度。
它与传统的诊断方法相比，具有更为准确、迅速、可靠和可持续的特点，已成为现代医学领域不可或缺的一种诊断手段。
基因诊断技术通常包括基因测序、基因芯片、多态性分析、PCR技术等多种方法。
其中，基因测序是最基础、最直接的一种方式，也是目前最为先进的一种方法。
基因测序可以通过对DNA序列的高通量测序，快速而准确地诊断出某些疾病。
此外，基因芯片技术是另一种重要的基因诊断技术。
基因芯片技术利用微型芯片技术、生物学的基本原理以及计算机技术，可以同时检测几百个基因，具有高通量、高效性和高灵敏度等特点。
基因诊断技术在医学中的应用广泛，包括疾病预测、疾病诊断、疾病监测、药物研发等等。
其中，疾病预测是应用最为广泛的一种应用。
通过基因诊断技术，可以预测个体患某种疾病的风险程度，为家庭和个人提供有效的健康管理方案。
对于遗传性疾病、癌症等临床疾病的预测，基因诊断技术可以帮助人们控制风险、进行个性化治疗和调整生活方式等。
另外，基因诊断技术还可以被用于提高疾病的诊断准确性和效率。
通过检测某些基因的变异，可以确定某些疾病的诊断，避免可能的误诊。
例如，通过基因诊断技术，可以在早期发现乳腺癌、肺癌、结肠癌等多种癌症。
对于这类疾病，早期发现和治疗至关重要。
同时，基因诊断技术可以帮助诊断某些不易确定的疾病，如神经系统疾病、免疫系统疾病等等。
此外，基因诊断技术在药物研发领域也有着重要的应用。
药物研发是一个漫长和耗时的过程。
基因诊断技术可以帮助研发人员确定感染病毒的株型，快速筛选可能的治疗方案，提高药物研发效率和成功率。
同时，基因诊断技术还可以帮助确定药物毒副作用，优化用药方案。
尽管基因诊断技术在医学领域中有许多潜在的应用，但这种诊断技术还需面临许多挑战。
首先，基因诊断技术需要高度专业的人才和技术。
基因诊断名词解释
基因诊断名词解释基因诊断是通过对个体的基因进行检测和分析，以确定其在某些遗传病、肿瘤等方面的发病风险、病因等相关信息的方法。
基因诊断是利用分子生物学技术和遗传学原理，根据个体基因组中的变异和突变来判断某些疾病的遗传风险和病因，为医学诊断、预防、治疗提供科学依据。
1. 单基因病：由单一基因突变引起的遗传病，如囊泡性纤维化、血友病等。
单基因病的基因诊断主要通过对特定基因进行测序和变异分析，寻找突变位点来确定患病风险和病因。
2. 多基因病：由多个基因共同作用引起的遗传病，如某些遗传性肿瘤、心血管病等。
多基因病的诊断需要对多个与疾病相关的基因进行检测和分析，综合考虑各基因的变异情况来判断患病风险。
3. 遗传突变：指基因组中发生的与正常序列相比有明显差异的变异，包括基因缺失、插入、缺失、替换等。
遗传突变是基因诊断的重要依据，通过分析基因组中的突变情况可以判断某些疾病的遗传风险和病因。
4. 突变检测：对个体基因组中的突变进行检测和分析的方法，包括测序、杂交等多种技术手段。
突变检测是基因诊断的核心内容，通过检测个体基因组中的突变，可以确定某些疾病的遗传风险和病因。
5. 家系分析：通过对家族成员的基因检测和分析，了解某些疾病在家族中的遗传规律和风险。
家系分析是基因诊断的重要方法之一，通过分析家族中的基因变异情况，可以预测家族成员的患病风险和病因。
6. 预测分析：依据已知的遗传变异和突变信息，利用统计学方法预测个体在某些疾病方面的遗传风险和患病可能性。
预测分析是基因诊断的一种重要手段，可以根据个体基因组中的变异情况，预测其在某些疾病方面的遗传风险。
基因诊断在预防、诊断和治疗疾病方面具有重要意义。
通过对个体基因组的分析，可以准确判断个体在某些疾病方面的遗传风险和患病可能性，为个体提供个体化的医学干预措施，从而有效预防和治疗疾病，提高生活质量和健康水平。
基因诊断与基因治疗
突变型探针．在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目 的DNA片段，再分别与上述探针杂交．
PCR-ASO
ASO1 ASO2
N
H M
N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因
（三）单链构象多态性分析
（single-strand conformation polymorphism, SSCP）
repeats, STRs ,mini- satellites ) 1990s 单核苷酸多态性 (single-
nucleotide polymor-phisms SNPs)
RFLPs
• 由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的 酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消 化时产生不同长度或不同数量的片段。
（一）核酸分子杂交
（二） PCR在基因诊断中的应用
• RT-PCR • 荧光定量PCR • 多重-PCR • PCR-ASO • AS-PCR • PCR-SSCP • PCR-RFLP
PCR-ASO
Allele specific oligonucleotide, ASO 等位基因特异性寡核苷酸分子杂交
• 主要用于一些基因较大且突变类型不清楚 的单击因遗传病的诊断。
PCR-RFLP
镰状红细胞贫血的间接基因诊断
——β-珠蛋白RFLP标记的连锁分析
NH
7.6kb
正 常 HapⅠ
13kb
患 者 HapⅠ
HapⅠ
HapⅠ
P 13kb 7.6kb
Southern印迹杂交
N：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针
• 以SNP单倍型（多位点SNP 分析）为遗传标志，结合
基因诊断和基因治疗
5´
3´
(CCT GTG G)
×
正常基因
5´
3´
突变基因
镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析
目录
正常人 突变携带者 患者 镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析
目录
PCR-SSCP技术检测DNA突变
传染病的基因诊断
Gene Diagnosis of Infectious Diseases
一、病毒性疾病
SNP与RFLP和STR标记的主要不同之处在于，它 不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接 以序列变异作为标记。
三、人类疾病与基因密切相关
1、基因结构改变导致蛋白质的结构或数量发 生变化导致疾病
2、基因表达异常 3、病原生物基因入侵导致疾病 4、可遗传的基因组变异导致人类疾病易感性
包装。
反转录病毒载体的特点
1）反转录病毒包膜上糖蛋白，能够被许多哺 乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使 反转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细 胞。
2)前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中， 有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。
3) 病毒颗粒以出芽的方式分泌至辅助细胞培 养的上清液中，易于分离制备。
定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基 因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒 性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而 达到清除肿瘤细胞的目的。
应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。
自杀基因的作用机制
（五）基因免疫治疗
通过将抗癌免疫增强的细胞因子或 MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微 环境中的抗癌免疫反应。
定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过 定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原 有的缺陷基因。
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probe probe
核酸杂交的关键要素
probe DNA target DNA signal detection
核酸杂交方法分类
按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交 两种类型。
固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固 体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。 液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液 中。
固相杂交分类
Southern 印记杂交 Northern 印记杂交 斑点杂交 原位杂交
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Southern blot
扩增产物294bp
引物1
MstⅡ酶切位点 (CCTNAGG)
CCT GAG GAG
103bp
191bp 294bp
引物1
CCT GTG GAG
引物2 引物2
镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析
294bp
﹣
191bp
103bp
+
正常人 突变携带着 患者
镰状细胞贫血的基因诊断方法
RT-PCR/序列分析
二、镰状细胞贫血
血红蛋白病（异常血红蛋白病） 红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫 血。 患者多在成年以前死亡
（一）镰状红细胞贫血分子机制
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)
5´
3´
1.15kb
×
56 7
正常基因
--Pro Glu Glu—
--CCT GAG GAG--
5´
3´
1.35kb
56 7
高特异性 高灵敏度 获得稳定的结果 早期快速 适用性强，应用范围广
第二节 遗传病的基因诊断
一、概述
人类的遗传病达数千种 地中海贫血在意大利等国家发病率达10％ 镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14％
我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异 常血红蛋白病和血友病。 有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛 查，产前早期诊断，降低发病率。
0.2kb
+
正常人 突变携带着 患者
镰状细胞贫血的基因诊断方法
PCR/限制性内切酶 设计引物→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶
切→电泳→EB染色→直接观察
例： 引物1：5’-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3’ 引物2：5’-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3’
寡核苷酸杂交分析 SNP和等位基因特 异寡核苷酸杂交 （ASO）#
（三） DNA序列测定
DNA序列测定是进行基因突变检测的 最直接、最准确的方法，可以确定突 变的部位，突变的性质。
（四 ） DNA芯片技术
应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变 多态性，对基因表达的情况进行分析。
二 基因诊断的特点
直接采用PCR进行基因诊断 采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCRRFLPs）进行基因诊断 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO） 斑点杂交进行基因诊断 * 通过PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断 采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基 因诊断
采用PCR技术对靶核酸进行定量分析
采集制备血液RNA→RT-PCR→产物测序→推 测氨基酸序列→进行诊断
二、β－地中海贫血 (β－Thalassaemia,简写βthal或βT)
β珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少 （β＋）或完全缺失（β0）
β珠蛋白合成速率降低，导致β链和α链合成的不 平衡→多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上→改变 了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。 高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人； 中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发 病率最高。 缺乏有效治疗措施。
原位杂交
（Colony in situ hybridization）
可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾 病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序 列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的 具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可 检出基因和基因产物的亚细胞定位。
（二）利用PCR及结合其他技术进行 基因诊断
突变基因
--Pro Ala Glu—
--CCT GTG GAG--
（二）镰状细胞贫血的基因诊断方 法
限制性内切酶/Southern blot
采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电 泳→转膜→32P标记的β 珠蛋白cDNA杂交→ 放射自显影
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
﹣
1.35kb 1.15kb
（一） β地贫病的分子基础
β珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子 （IVS－I和IVS-II），3个外显子。 目前发现突变有百余种，中国人群发现约 20种； 一般对特定种族来说，90%的β地贫基因仅 由4～6种突变组成。
（二） β地中海贫血的基因诊断
PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和 580bp，分别包含14种和1种可能突变）→ 合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（4～6对， 分别标记） →制备DNA样品 →PCR扩增 →斑点印迹杂交 RFLP分析法
三α地中海贫血的基因诊断
左侧缺失型 基因序列
•PCR扩增法——定性分析
正常基 因序列
左侧缺失4.2kb
a
α1
b
ac扩增0.4kb ab无扩增片段
α2 c
右侧缺失 a
α1
b
右侧缺失型 基因序列
是最经典的基因分析方法，不但能检出特异 的DNA片段，而且能进行定量和测定分子 量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变 分析等。
Northern杂交
用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA进行定性和定量分析。
斑点杂交（Dot blot）
可用基因组中特定基因及其表达的定性及定 量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量 少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量， 特异性不高，有一定比例的假阳性。
第一节 基因诊断的概念 及常用技术
一、基本概念
基因诊断—利用分子生物学技术， 从DNA/RNA水平检测基因的存在, 分析基因的结构变异和表达状态， 从而对疾病作出诊断。
二、基因诊断常用方法
㈠ 核酸分子杂交 ㈡ PCR ㈢ DNA序列测定 ㈣ DNA芯片技术
(一) 核酸杂交
基本原理-------核酸变性和复性理论