生物分离工程实验.
生物分离工程实验
生物分离工程实验实验一茶多酚标准曲线的测定仪器：紫外分光光度计，比色皿，天平，容量瓶，移液管，pH计、试管药品：没食子酸丙酯或茶多酚，酒石酸钾钠，硫酸亚铁，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾。
方法：A溶液配制没食子酸丙酯标准溶液配制准确称取25mg没食子酸丙酯，蒸馏水溶液，移入25mL容量瓶并稀释至刻度，摇匀，配制成1mg/mL的标准溶液酒石酸亚铁溶液配制准确称取0.1g硫酸亚铁，和0.5g酒石酸钾钠，混合，蒸馏水溶解后移入100mL容量瓶，稀释至刻度，摇匀。
pH7.5磷酸盐缓冲液配制磷酸氢二钠：准确称取分析纯磷酸氢二钠2.969g，蒸馏水稀释溶解，移入250mL容量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，为a液磷酸二氢钾：准确称取分析纯磷酸二氢钾，、2.2695g，蒸馏水溶解，移入250mL容量瓶，定容，B。
取A液体85mL，B液体15mL混合均匀，即成。
B．标准曲线绘制分别吸取0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25mL的没食子酸丙酯标准液于25mL容量瓶中，加入蒸馏水4mL，再加入酒石酸亚铁溶液5mL，用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，分光光度计在540nm处，1cm比色皿，分别测定吸光度。
空白参比操作同上，不加没食子酸丙酯。
以容量瓶中没食子酸丙酯的绝对含量mg为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，做线性回归。
C 样品测定取适量样品加入容量瓶，操作同上，没食子酸丙酯含量乘以换算系数1.5，求得茶多酚。
实验二超声法和回流法提取茶多酚的比较实验仪器：超声提取器、布氏漏斗、抽滤瓶、真空泵、烧瓶、量筒、分光光度计、比色皿、容量瓶等、实验试剂茶叶、纯净水、茶多酚（没食子酸丙酯）、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等操作方法1、材料准备称取一定量的茶叶，研钵粉碎。
备用2、提取A、超声提取法称取5g粉碎后茶叶末，放入烧瓶（塑料袋密封），加入100mL水，于超声提取器，50℃提取20min，抽滤，定容至100mL，待测。
生物分离工程实验
实验一絮凝技术预处理发酵液及其滤饼的质量比阻测定（见教材）实验三PEG/（NH4）2SO4 两水相系统的相图（见教材）实验二利用盐析和等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白1 实验目的掌握盐析和等电点沉淀法的原理和基本操作。
2 实验原理乳蛋白广泛存在于乳制品中，牛奶中主要含有酪蛋白，酪蛋白在pH 4.8是沉淀，乳蛋白素则在pH=3左右才会沉淀。
利用这一性质可以先将降至4.8，或者是在加热至40℃的牛奶中加人硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。
酪蛋白不溶于乙醇，利用乙醇可以除去杂质。
将除掉酪蛋白的溶液pH调至3左右，使乳蛋白素沉淀析出。
可以得到乳蛋白素。
3实验器材烧杯；玻璃试管；离心管；磁力搅拌器；pH计；离心机等。
4试剂和材料⑴试剂与材料脱脂牛乳；无水硫酸钠；HCL；氢氧化钠；滤纸；pH试纸；浓盐酸；乙醇；0.2mol/L pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液。
⑵缓冲溶液的配制0.2mol/L pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液（先配A液与B液）：A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000mL。
B液：0.2mol/L醋酸溶液，取醋酸（含量大于99.8%）12 mL定容至1000mL。
取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.8的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。
5操作步骤1）盐析法制备酪蛋白①将50mL牛乳倒至烧杯中，40℃搅拌；②方法一：在烧杯中缓缓加入10g无水硫酸钠，之后再继续搅拌10min；方法二：在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH 4.8的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.8。
③用细布过滤分别收集沉淀和滤液。
将沉淀放于30mL乙醇中倾倒于布氏漏斗中过滤除去乙醇溶液，抽干。
将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿中展开除去乙醇，干燥后得到酪蛋白。
准确称量。
2）等电点沉淀法制备乳蛋白素将操作1）所得到的滤液置于烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计测量酸度，并用盐酸调整pH至3。
生物分离实验案例
氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为 35g/L，比较稳定，利 水中。两液混匀后，在搅拌下加入 10%NaOH300mL，后用水稀释至 1000mL，
用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。
贮存于塑料瓶中。此液可长期保存，若瓶底出现黑色沉淀则需重新配制。
酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消逝，
弃上清液，收集沉淀。一份沉淀用于“除杂〞步骤，另一份沉淀用 0.1MNaOH 温下反应 30min，测定 540nm 波
溶液溶解并定容至 100mL，用于“酪蛋白含量测定〞步骤。
长处吸光度，查标准曲线，求得酪蛋白质量。平行测定 3 次，求其平
2、除杂
均值，并计算 25mL 牛乳中酪蛋白的质量〔m2〕。
试验一：牛乳中酪蛋白的提取
液中可与铜离子形成紫红色化合物，在 540nm 波长处有最大汲取，其颜色
一、试验目的
深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。
1、把握等电点法提取蛋白的基本原理及基本操作；2、把握双缩脲法
三、材料与试剂
测定蛋白含量的基本原理及基本操作。
市售牛奶
二、试验原理
10mg/mL 酪蛋白标准溶液〔用 0.1MNaOH 配制〕0.1MNaOH 溶液、
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然后在 5000r/min 下，离心 15min，收集上清液得提取液。
自氧化过程中产生有色中间物和 O2-自由基，反应开始后溶液渐渐变成黄
留出 1mL 备用，剩余提取液精确量取体积后进行下步试验。3、除杂 色，在有超氧化物歧化酶存在时，由于它能催化 O2-自由基与+H 结合生成
2、酪蛋白提取得率的计算
生物分离工程实验
生物分离工程实验强调一下：下周一、二下午（3月31日、4月1日）一点半在生物楼411上实验，预习实验一、带讲义、不许迟到。
共5次课，缺席一次就没有成绩。
生物分离工程实验吴国峰郑春英二零一四年三月实验一凝胶色谱法分离蛋白质一、实验目的1. 掌握凝胶色谱的基本原理；2. 掌握凝胶色谱的基本操作；3. 了解物质在色谱柱中的洗脱行为与分配系数的关系。
二、实验原理本实验将蓝葡聚糖2000（分子质量2000kD ）、细胞色素c （分子质量17kD ）和DNFP-甘氨酸（分子质量0.5kD ）的混合物通过交联葡聚糖凝胶G-50（Sephadex G-50）的色谱柱，以蒸馏水为洗脱溶剂进行洗脱。
蓝葡聚糖2000分子量最大，全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，而未进入凝胶颗粒内部，因而洗脱速度最快，最先流出柱，其V e =V o 即K d =0。
DNFP-甘氨酸分子量最小，不被排阻而可完全进入凝胶颗粒内部，洗脱速度最慢，最后流出柱，其V e =V i +V o 即K d =1。
细胞色素c 分子量在上述二者之间，其洗脱速度居中。
可以从蓝、红、黄三种不同颜色直接观察到三种物质分离的情况，并通过洗脱体积计算V i 、V o 和各自的K d 。
d K 与e V 、0V 和i V 的关系见下式：d K 0e iV V V -= 式中 K d ——分配系数，表示其被排阻的程度，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关；V t ——柱体积，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积，在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床；V 0——外水体积，色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积；V i ——内水体积，因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，即分间隙的总和为内水体积，又称定相体积（不包括固体支持物的体积g V ）；V e ——峰洗脱体积，指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积。
通常情况下，0＜K d ＜1，当K d ＞1时，说明凝胶对组分有吸附作用。
生物分离工程实验-实验一
六、注意事项
5、实验过程中一定要记得测定A、B两管的下层水相的体积！ 6、测定吸光值时，注意一定要将溶液装到比色皿高度的2/3左右，不得低
2）原液B （1mg/ml）分别取0.5、1、2、3、4、5ml，用 0.1MKCl的水溶液（pH 7.2）稀释至5ml，配成0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8,、1.0mg/ml的溶液，以稀释液为空白对照， 其他操作同上。
பைடு நூலகம்
五 结果与计算
1、原液A和原液B分别以吸光度值A为纵坐标，牛血清蛋白 量（ mg/ml ）为横坐标作标准曲线图，线性回归，求直线 方程和R2。
2、测吸光度值时，若要进行稀释，则需用相应A原液所用的缓冲液稀释A原 液的水相，用B原液缓冲液稀释B原液的水相。
3、紫外分光光度计：必须使用石英比色皿
4.1、原液A操作中，离心完成后，会形成一种上相油层、中间白色乳浊液层、 下层水相的状态，而且下层水相体积很小，测定该下层溶液光度值时，可以 采用医用针筒抽取出来，并记下其总体积，若针筒长度不够，可以剪去针筒 外端两个突起再吸；然后吸出其水相到干净试管中（注意不要吸入乳浊 液！），并确定其吸出体积， 用0.1MKCl的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释到5ml （计算其稀释倍数），在280nm下测吸光值。
3）KCl ：防止水相乳化，影响萃取物与亲水头部的作用力， 离子浓度越大，萃取率越小。同时影响反胶束的大小。
四、 实验操作
1、萃取：在两只50mL离心管中分别加入10ml原液A和原液B，再分别加 入10ml反胶束相溶液，在旋涡混合器上充分混合5min，达到萃取平衡。
《生化分离工程实验》课件
CHAPTER
04
结果分析与讨论
数据记录与整理
数据记录的准确性
确保实验过程中所有数据都被准确记 录，包括但不限于温度、压力、流量 、重量等。
数据整理的规范性
将实验数据整理成表格或图表，便于 分析和对比。
结果分析
数据对比分析
将实验数据与理论值进行对比，分析 偏差产生的原因。
趋势分析
分析实验数据的变化趋势，预测未来 可能的结果。
根据选择的分离方法，设计合理 的分离流程。
控制分离过程中的温度、pH值 、浓度等参数，确保分离效果。
监测分离过程中的关键指标，如 目标成分的纯度和收率。
产物检测与鉴定
利用生化分析方法（如光谱分析、质谱分析、电泳等）对分离得到的产物进行检测 与鉴定。
比较实验结果与预期目标，评估实验的分离效果。
分析实验误差来源，提出改进措施，优化实验方案。
有机溶剂
用于提取和纯化目标产物 的有机溶剂。
实验器具与设备
发酵罐
用于进行微生物发酵的容器。
离心机
用于分离和纯化目标产物的设备。
层析柱
用于进行色谱分离的柱状设备。
CHAPTER
03
实验方法与步骤
样品处理与制备
样品收集
样品纯化
选择具有代表性的样品，确保样品新 鲜、无污染。
去除样品中的杂质，提高目标生化成 分的纯度。
误差分析
系统误差分析
分析实验过程中由于仪器、设备等因素导致的误差。
随机误差分析
分析实验过程中由于环境、操作等因素导致的误差。
CHAPTER
05
实验结论与总结
实验结论
实验结果分析
对实验过程中收集的数据进行分析，对比实验结果与预期结果的差异，评估实验 的准确性和可靠性。
生物工程下的生物分离工程实验教学
生物工程下的生物分离工程实验教学【摘要】为满足社会对应用型人才的需求，对生物项目专业?生物别离项目实验》课程的教学改革进行探索。
通过改革课程内容、改革实验教学伎俩、改革实验教学模式和以科研促教学等方面的改革，培养学生的创新应用能力，调动学生学习的主观能动性，提高教学效果。
【关键词】生物别离项目；应用型人才；教学改革地方高校的办学宗旨是效劳地方，效劳社会，要到达这一目标，应用型人才培养是其保障。
因此我们在日常教学中应不断总结经验，努力提高教学的效果。
在高等教育过程中，实验教学不仅仅只作为理论教学的补充，在应用型人才培养模式下，作为训练学生实践动手能力的实验教学显得更加突出、更加重要，应该受到更多的重视。
而生物项目专业作为新型交叉学科，加强学生的实践创新能力的培养更是迫在眉睫。
生物别离项目通常也称为生物工业下游技术,现阶段已成为整个生物产业技术中的瓶颈技术，其加工过程主要针对生物工业上游生产过程获得的生物原料，对其中某种有效成分进行别离提取、加工并精制，最终使其成为成型产品的应用型技术。
生物别离项目课程作为生物项目专业的必修课程，课程的目的是让学生了解并掌握生物物质别离所依赖的原理、常用的生物物质别离技术、生物别离的各种过程，以及这些别离技术操作过程的关键点和如何保证实验所采用别离工艺水平的先进性，因此该课程实践性强，应用性强，且与生产结合紧密，但从以往的教学效果看，传统方式培养的学生不足创新意识和创新能力，这显然不合乎应用型人才的培养目标，对生物别离项目课程进行项目实践应用的教学改革势在必行。
进行生物别离项目实验教学改革对于培养具有扎实理论知识和实际应用能力的应用型人才具有重要的意义。
经过对现行的生物别离项目实验课存在的问题进行总结，并通过认真细致的思考，尝试提出下列几点倡议，作为普通地方高校生物别离实验课程教学的参考。
1改革课程内容，加强应用能力的培养任何一门课程，其教学内容的设置都尤为重要，实验课程的教学也如此。
《生物分离工程实验》课程教学大纲
《生物分离工程实验》课程教学大纲总学时：24 学 分：1.5理论学时：0 实验学时：24面向专业：生物工程 课程代码：B4100112先开课程：物理化学、化工原理等 课程性质：必修课执笔人：谭海刚 审定人：宫春波 孙庆杰第一部分：实验教学部分一、说明1、本门课程实验的性质任务、目的与要求本实验课程是对理论教学课程的验证，训练学生掌握生物分离工程最基本的操作技能， 了解生物分离的基本知识，加深理解课堂讲授的某些生物分离理论，同时，通过实验培养学 生观察思考、分析问题和解决问题的能力，培养学生实事求是、严肃认真的科学态度以及勤 俭节约、爱护公物的良好作风，为今后的学习和工作打下坚实的基础。
2、本门课程实验项目设置情况实验类型序号 实验名称学时必开选开验证基本操作综合性、设计性内容提要1 微生物细胞的破碎及分离4 √ √啤酒酵母的培养；超声波破壁（高压匀浆破壁或酶法破壁）；计算细胞破碎率。
2 牛奶中酪蛋白的制备及其等电点的测定4 √ √牛奶中酪蛋白的制备——离心去脂法和加热法；酪蛋白等电点的测定。
3 用 PEG/ （NH4） 2SO4双水相体系萃取糖化酶6 √ √不同比例双水相体系提取糖化酶；次碘酸盐法测定糖化酶活力。
4 糖化酶的分离纯化——分子筛层析脱盐6 √ √糖化酶的浸出； 硫酸铵盐析；分子筛层析脱盐；测定糖化酶活力。
5 离子交换树脂总交换容量的测定6 √ √用静态法和动态法测定阴、阳离子交换树脂的总交换容量。
6 氨基酸的分离鉴定——纸层析法4 √ √配制扩展剂和显色剂； 点样；展开；显色；计算 R f 值。
7 酵母 RNA的提取及 4 √ √ 浓盐法、稀碱法提取酵母定性和定量鉴定 ——浓盐法和稀碱 法 RNA；紫外分光光度计测定 酵母 RNA的含量。
8 薄层层析法分离鉴定糖分4 √ √配制扩展剂和显色剂； 制板；点样；展开；显色；计算 Rf值9用超滤技术分离和浓缩碱性蛋白酶 （糖化酶）8 √ √以碱性蛋白酶（糖化酶）粗品为料液超滤，同时进行超滤性能各项指标的研究，包括膜的水通量、截留率、超滤速度随透出液体积而变化的规律。
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PART B 生物分离工程实验
实验九硅胶色谱法分离甘油三酯
一、实验目的
通过从粗油中分离甘油三酯，学习运用凝胶色谱法分离油脂中各个成分的方法。
二、实验原理
吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。
常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。
硅胶色谱频繁使用在脂质中的单一脂质，糖脂质以及磷脂质的分离。
各种脂质被硅胶吸附，随着洗脱溶液的极性增加，各种极性不同的化合物被分离出来。
三、实验仪器
1. 层析柱(1.5×75cm)
2. 250mL 三角容量瓶
3. 分析天平（0.001g）
4. 真空浓缩装置
5. 搜集瓶
6. 氮气
四、实验材料与试剂
1. 正己烷 200mL
2. 乙醚15mL
3. 蒸馏水 1.3mL
4. 硅胶（100目左右） 25g
五、实验步骤
1. 活化硅胶（110度，6小时干燥）25g中加入5%蒸馏水使其部分钝化并充分混
匀放置30分钟。
加入正己烷至刚好淹没硅胶为止并用超声波脱气3分钟。
2. 层析柱底部放入脱脂棉少许（防止硅胶泄漏），将硅胶放入到层析柱中正己烷
溶液要没过硅胶层表面。
3. 准确称取食用油1±0.001 g加入到硅胶层析柱中用150mL正己烷/乙醚
（87∶13，v/v）洗脱，洗脱速度为2-3滴/min。
洗脱时表面不能干和。
4. 收集的洗脱液用真空浓缩装置浓缩至无有机溶剂气味为止。
5. 准确称取浓缩物质量。
六、回收率计算
回收率= Ws/W×100%
Ws：回收的甘油三酯质量（g）
W：食用油质量（g）
七、思考题
1. 实验中加水的目的是什么？
2. 怎样验证洗脱液中收集的甘油三酯的纯度。