Sanger法测序
sanger法测序的原理
sanger法测序的原理
Sanger法测序是由威廉·Sander教授领导的英国剑桥大学团队于1977年研制成功的，是一种以dideoxy nucleotides作为核苷酸测序试剂的方法，是现今最常用的DNA测序方法。
Sanger法测序的原理很简单，主要是两个步骤：
1. 引物延伸：
每个DNA片段围绕引物都会发生DNA聚合反应，形成一种叫做DNA复制产物（DNA replicant）的单链DNA 分子。
在这种反应过程中，除了DNA复制酶以外，还要使用一种叫做dideoxy nucleotides （ddNTP）的特殊核苷酸，这种核苷酸可以终止DNA合成过程，即当DNA复制酶将其作为一个核苷酸的替代品时，ddNTP会使DNA复制酶与被复制片段分离，从而终止后续字符的产生。
2. 核苷酸分离：
使用ddNTP合成的DNA复制产物可以应用凝胶电泳的方法，由于不同大小的DNA复制产物，在特定电场中移动的速度也不一样，通过对比应用不同dnTPs的产物，可以在凝胶上获得待测序片段的测序图谱，从而确定其DNA序列。
Sanger法测序的原理就是这样，各种不同大小的DNA复制物在凝胶上按照其大小被分离，形成一条测序图谱，从而可以确定其DNA 序列。
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第一代测序技术原理
第一代测序技术原理第一代测序技术是指Sanger测序法，是20世纪70年代末期至80年代初期发展起来的一种测序技术。
它的原理是通过DNA聚合酶在DNA模板上合成一条新的DNA链，这条新链与模板DNA链互补配对，但在其合成过程中，加入了一种特殊的二进制核苷酸，即二进制脱氧核苷酸三磷酸酯，当新链中遇到这种特殊的核苷酸时，DNA聚合酶会停止合成。
通过测定这些停止的位置，就可以确定DNA序列。
Sanger测序法的原理可以简单概括为四个步骤，首先，将要测序的DNA片段进行复制，得到多个相同的DNA片段。
然后，在DNA复制的过程中，加入一种特殊的二进制脱氧核苷酸三磷酸酯，这种核苷酸会随机地停止DNA链的合成。
接着，将停止合成的DNA片段进行分离，通过凝胶电泳等方法，可以将不同长度的DNA片段分开。
最后，通过X射线或荧光染料等方法，可以测定每个DNA片段的长度，从而确定DNA序列。
Sanger测序法的原理虽然简单，但是在实际操作中需要严格控制各种条件，才能得到准确的测序结果。
首先，需要保证DNA片段的纯度和完整性，避免在复制过程中出现断链或者杂质。
其次，需要控制好二进制脱氧核苷酸三磷酸酯的加入浓度，以及DNA聚合酶的活性，避免过多或过少的停止合成。
最后，在分离和测定DNA片段的过程中，也需要精确地控制各种条件，以确保准确的测序结果。
尽管第一代测序技术已经被新一代测序技术所取代，但是Sanger测序法作为第一代测序技术的代表，仍然具有重要的意义。
它的原理和方法为后续测序技术的发展奠定了基础，同时也在一些特定的应用场景中仍然具有一定的优势。
因此，了解第一代测序技术的原理，对于理解整个测序技术的发展历程和原理具有重要的意义。
总的来说，第一代测序技术即Sanger测序法的原理是通过DNA聚合酶在DNA模板上合成一条新的DNA链，加入特殊的二进制脱氧核苷酸三磷酸酯，当新链中遇到这种特殊的核苷酸时，DNA聚合酶会停止合成，通过测定这些停止的位置，就可以确定DNA序列。
sanger 测序法
sanger 测序法Sanger测序法，也称为链终止法，是一种生物学技术，用于在DNA或RNA分子中确定序列的方法。
简而言之，它可以帮助我们找出基因或其他生物分子的确切顺序。
Sanger测序法是20世纪70年代由Frederick Sanger等人开发的，并于1980年获得了诺贝尔化学奖。
Sanger测序法基于DNA链延伸的原理。
它需要以下四个主要组成部分：一些待测序的DNA分子，起始DNA链和末端DNA链、DNA酶、DNA聚合酶和核酸清单（the dideoxynucleotide terminating mix）。
DNA聚合酶会将待测序DNA与一个起始DNA链配对，并在这些DNA酶的作用下，在每个位置上加入一个dNTP（简称deoxynucleotide，即包含脱氧核糖的核苷酸），形成新的DNA链。
银行测序法通过加入dideoxynucleotide，即复合物ddNTP，来终止DNA链的生长。
这是因为在ddNTP中，没有一个3'羟基，这一羟基在DNA链延伸过程中分子向当前分子加上新的碱基（A，T，C或G）起到了重要作用。
因此，在存在ddNTP的反应中，DNA聚合酶无法将ddNTP添加到DNA的3'端，因此DNA链的延伸停止。
这样，我们就能够确定每个位置上所以存在碱基的类型，进而确定该DNA分子的真实序列。
Sanger测序法的优点是其稳定性和准确性，其缺点在于它需要大量的实验操作，并且只能处理少量的DNA序列。
然而，由于测序技术的突飞猛进，Sanger测序法已经成为前基因组时代，即在基因组大规模测序技术出现之前，进行单个基因或低质量DNA样品测序的首选技术。
现在，高通量测序技术已经取代了Sanger测序法，并且可以处理大规模的基因组序列，让我们能够更快速和准确地了解生物分子中的基因组和其他信息。
总之，Sanger测序法是一种基于DNA链延伸原理的技术，用于确定DNA分子中低数目的准确序列。
sanger法测序步骤
sanger法测序步骤
Sanger法测序的步骤如下：
1.在进行聚合反应时，有可能结合上ddNTP且终止反应，也有可能结合上正常dNTP正常反应，直到结合上ddNTP终止反应。
反应结束生成长短不一的含有荧光标记的DNA片段混合物（荧光颜色与模板的碱基有互补对应的关系）。
2.过滤混合物，去除ddNTP等其他杂质，只留下长短不一的DNA片段。
3.上机测序。
先在长长的中空的玻璃毛细管中注入丙烯酰胺溶液，用紫外光照射丙烯酰胺溶液发生聚合反应变成聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶对于在其中电泳的核酸有分离作用，短的片段在其中电泳得快，长的片段在其中电泳的慢。
把DNA片段混合物，加到有聚丙烯酰胺凝胶的毛细管的一段，在毛细管的两端加上高电压，DNA片段就在电场的作用下，从负极向正极电泳。
4.从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。
sanger测序的原理和步骤
Sanger测序，也被称为双脱氧链终止法，是一种用于确定DNA或RNA序列的技术。
以下是其原理和步骤：
原理：
Sanger测序基于DNA聚合酶的DNA合成过程，通过添加双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）来终止DNA链的延伸，从而得到一系列不同长度的DNA片段。
ddNTP与普通dNTP的区别在于其3′端缺少一个羟基，这使得ddNTP在DNA合成过程中不能形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断。
通过在反应中加入四种不同的ddNTP，可以得到包含不同长度的DNA片段，从而揭示出DNA分子中核苷酸的顺序。
步骤：
DNA模板制备：从待测序的DNA样品中提取出目标DNA片段，并进行PCR扩增，得到足够的DNA模板。
DNA合成反应：在PCR扩增反应中，加入四种不同的dNTP和一种ddNTP。
由于ddNTP可以随机地终止DNA链的延伸，因此可以得到一系列不同长度的DNA片段。
电泳分离：将得到的DNA片段进行电泳分离，使不同长度的DNA 片段得以分离。
检测：通过放射自显影等技术对电泳结果进行检测，从而确定DNA 序列。
氨基酸测序的几种方法
氨基酸测序的几种方法
氨基酸测序是生物学中非常重要的一项技术，它可以帮助我们了解蛋白质的结构和功能。
在氨基酸测序中，有几种常用的方法，下面我们来一一介绍。
1. Sanger测序法
Sanger测序法是一种经典的测序方法，它是通过DNA聚合酶在DNA模板上合成新链，同时加入一种特殊的二进制反应淬灭剂，使得在每个位置上只有一种氨基酸被加入。
然后，通过电泳分离不同长度的DNA片段，就可以得到DNA序列。
这种方法可以测序较长的DNA片段，但是需要大量的时间和成本。
2. 质谱法
质谱法是一种快速、高效的氨基酸测序方法。
它利用质谱仪对蛋白质进行分析，通过测量蛋白质分子的质量和荷电量，可以确定蛋白质的氨基酸序列。
这种方法可以测序较短的蛋白质片段，但是需要高端的仪器和技术。
3. Edman降解法
Edman降解法是一种经典的氨基酸测序方法，它是通过将蛋白质分子中的N端氨基酸逐步去除，然后进行分析，得到氨基酸序列。
这种方法可以测序较短的蛋白质片段，但是需要大量的时间和成本。
4. 高通量测序法
高通量测序法是一种新兴的氨基酸测序方法，它利用高通量测序仪对蛋白质进行分析，可以同时测序多个蛋白质分子，大大提高了测序效率。
这种方法可以测序较长的蛋白质片段，但是需要高端的仪器和技术。
氨基酸测序是生物学中非常重要的一项技术，它可以帮助我们了解蛋白质的结构和功能。
不同的测序方法有各自的优缺点，我们需要根据实际情况选择合适的方法。
sanger法测序
sanger法测序桑格尔法（Sangersequencing）又称手性测序或费尔马特技术，是一种等位基因组学技术，其原理是根据DNA分子的定位及其多态性，以放射性核素的探针辅助，进行DNA序列的精确测定。
这一技术由桑格尔夫妇在1977年首次提出，随后经多年改进，已成为普及的基因组学技术之一。
因本技术的高效、准确，一般用于各种基因组学研究，如基因组测序、遗传病研究，基因组重组分析、基因鉴定及蛋白质结构研究等。
桑格尔法测序技术分为两个阶段：一种是DNA扩增，即在指定反应条件下，用DNA聚合酶将体外DNA放大；第二阶段是DNA序列的定位。
具体来说，在DNA序列定位过程中，将单链DNA样本分成几份，让每份样本受到一组限制酶的影响，以酶切后生成一系列相应长度的DNA片段（即DNA序列）。
每份样本与一种探针荧光标记结合，随后将这些DNA序列与探针荧光标记溶解，最后将这些DNA序列放入自动测序仪，能够在荧光模式下瞬间检测到酶切体系中单核苷酸的浓度及其组合，从而可以计算出定位序列，最终实现DNA序列的精确测定。
桑格尔法的应用非常广泛，在基因组学研究中，它可以实现大型基因组的分析，还可以对小基因组及染色体进行测序，有利于深入研究生物物种多样性。
此外，桑格尔法测序也可以用于克隆鉴定、核酸分析、抗药性分析、药物开发和蛋白质结构鉴定等，广泛的应用于医学研究、药物开发及转化医学领域。
虽然使用桑格尔法测序技术在基因测序和临床诊断中取得重大进步，但也存在一定的局限性，如不易处理GC和AT富集的序列、高结构和多元结构的序列处理等。
在今后的研究中，需要进一步优化桑格尔法测序技术，提高基因组学数据的准确度；并且需要利用一些新技术，如氨基酸编码和计算等，提高桑格尔法测序技术的灵活性。
总之，桑格尔法测序是一种在基因组学研究技术中普遍应用的仪器和方法，为医学研究、基因治疗及其他转化医学领域带来很大的发展。
思维的发展和互联网的发展，很可能会为桑格尔法测序带来新的发展，也可能为改进和优化技术提供新的设计思路。
sanger测序法检测snp原理
sanger测序法检测snp原理
Sanger测序法是一种常用的DNA测序方法，它通过确定DNA序列中的碱基顺序来揭示DNA分子的组成。
在Sanger测序中，DNA分子首先被复制成许多不同长度的DNA片段，这些片段在末尾带有不同的放射性或荧光标记。
然后，这些DNA片段会通过电泳在聚丙烯酰胺凝胶中分离，根据片段长度的不同，可以将它们分成不同的带。
接下来，片段会被读取并分析。
在测序的每一步中，将引入一种特殊的二进制末端核苷酸，这会导致碱基延伸，并在相应的位置停止。
通过对每一个带进行测序，可以得到每个片段的具体序列。
这些序列接下来可以组装在一起，以便得到整个DNA分子的序列。
在检测SNP（单核苷酸多态性）时，Sanger测序法可以识别碱基序列中的差异。
如果在测序的特定位置上存在SNP，则在测序时会观察到对应SNP位置的不同碱基信号。
通过比较不同样品的测序结果，可以确定不同样品之间的差异和SNP 的存在。
总的来说，Sanger测序法通过测量DNA序列中的碱基顺序差异来检测SNP。
通过对不同样品的测序结果进行比较，可以确定SNP的位置和存在情况。
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CCME 03
测序引物问题：
现象：每个峰后面有个同样荧 光信号的小“尾巴”。 原因：合成是引物多一个碱基。 对策：重新合成引物。
现象：每个峰前面有个同样荧光 信号的小“尾巴”。 原因：合成时引物少一个碱基。 对策：重新合成引物。
引物或模板不纯：
现象：整个峰图噪音都比较高； 原因：引物或模板不纯； 对策：选用高纯度的引物，或模版纯化要充分。
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解决方案：1、检测模板浓度 及纯度；2、减少反应体积优 于提高模 板稀释度；3、检测 引物浓度是否 正确；4、检测 是否有不易测通的 区域存在。
CCME 03
测序结果背景高并且信号值低(<150)
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原因： 1、部分测序反应失败；2、模板量太多或太少； 3、 测序反应后纯化丢失了部分样品；
加样时注意事项：
back
4. 加样使用的枪头在枪头盒中的位置对应测序反应 板每个孔的位置；每加完一种试剂后都要在黑色 背景上检查，有少加或漏加情况时应立即补足， 确认无误后方可进行下一步操作；
5. 加错试剂时立即在测序反应表中记录，在新的板 孔中重新加样；
6. 加不同试剂或相同试剂加入含有不同试剂的板孔 中，必需换枪头；
上PCR仪注意事项：
back
1.上机前确认样品板的孔都加了样品；
2.确认PCR程序是否正常终止；
3.程序结束后，观察每孔是否有蒸干现象；
4.连续使用PCR仪时，两轮之间让机器待机20 分钟以上。
测序检测所用的3730XL
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CCME 03
测序峰图的简单分析
我们所用的峰图分析软件为： Sequence Scanner V 1.0
• SBT法HLA高分辨分型已逐步在欧美国家 推广，并成为“金标准”。目前我们华大 也以SBT法为主，并结合SSP方法进行HLA 的配型。
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CCME 03
HLA的介绍
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PCR-SBT法分型的基本流程
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CCME 03
测序原理
双脱氧链终止法（Sanger法）：
1977年，英国人Fred Sanger 发现，如果在DNA复 制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的 DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止 DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的dd NTP决定的。
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4
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HLA的介绍
HLA分型
1、血清学分型 2、细胞学分型 3、DNA分型
①PCR-RFLP技术 ②PCR-SSO技术 ③PCR-SSP技术 ④PCR-SBT技术
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CCME 03
HLA的介绍
• PCR-SBT: 以PCR扩增所要分析的基因片断 ，然后对DNA序列进行分析，可以直接得 到基因型。分辨率高，可大规模进行，精 确度高，能直接发现新的等位基因。
上PCR仪：
1. 短暂离心后上PCR仪。
2. 测序反应程序： 96℃，2min→｛96℃，10s→55℃，
5s→60℃，2min｝×25cycles→15℃，∞；
3. PCR仪程序运行结束后冷却到15℃，退出程序， 取下测序反应板，记录PCR仪运行情况；在纯化板 左边画上“√”代表已上PCR仪；冰箱冷藏区特定位 置保存，待纯化，并通知纯化岗同事。
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13 CCME 03
测序反应实验前准备
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• 预约PCR仪 • 编写测序反应表 • 根据要检测的样品数计算试剂的需要量 • 查看实验所需的耗材是否够用 • 用70％乙醇擦桌面，不能残留粉尘
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CCME 03
Mix配制
Step1：按实验需要的体系和用量计算各组分的加量， 冰上或4℃避光缓慢解冻2.5×BigDye；
Mix配制注意事项
back
①对多个使用相同引物的测序反应可以把引物加到 mix中
②配制mix和稀释引物的millipore水应分别使用； ③吸取不同的试剂要换枪头； ④试剂打开后应立即吸取并盖好盖子，接触样品的
容器、试剂严禁长时间暴露在空气中，时刻防止 污染！
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17 CCME 03
引物稀释
Sanger法测序
--在HLA-SBT分型中应用
杨华志 唐金凤 胡志锋 周巧云 杨晓琴 2009.10
目录
• HLA的介绍 • 测序原理—Sanger法测序 • 测序反应操作流程及注意事项 • 简单的峰图分析
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CCME 03
HLA的介绍
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3
CCME 03
HLA的介绍
为什么要进行HLA检测
CCME 03
引物稀释
液体稀释： 根据以下公式计算（通常使用液浓度＝3.2pmol/μL）
加水量=(储存液体积×储存液浓度/使用液浓度)-储存 液体积
按预算的体积在1.5mL离心管中加入millipore水， 吸取所需体积的指定引物储存液加入水中，充分振 荡30秒，离心10秒，备用。
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CCME 03
CCME 03
POLY结构对信号的影响：
Poly在序列的 前端对信号影 响较小
Poly在序列的 后端对信 号影响较大
Poly-G/poly-C很容易导致信号中断和信号乱：
back
Thank you!
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CCME 03
整板峰图的大概情况：
原始数据Raw窗口：
无反应
原因：1、模板质量差；2、模板浓 度过高或者过低；3、纯化时样 品 丢失；4、引物降解或者加错； 5、 Bigdye浓度过低或者失效；6、 水 污染；7、PCR仪温度不稳定
解决方案：1、检测模板纯度； 2、调节模板浓度；3、换新的 引物；4、 提高Bigdye浓度； 5、换水；6、检 测PCR仪；7、 保证纯化时酒精的浓 度及体 积，倒甩时速度不能高于
稀释引物注意事项
back
1、引物稀释前要离心，液体引物12000rpm 离 心30s,干粉引物12000rpm离心2min。
2 、打开干粉引物离心管盖时动作尽量轻缓， 打开的角度不超过45°。
3、每次稀释引物前，均需用新的millipore水。 4、加水稀释时注意枪头的更换，避免交叉污
染。 5、稀释完后，将引物的流水号和引物名称一
第11页模板的序列。
CCME 03
测序原理 PCR与测序反应的比较
PCR
DNA 聚合酶 Taq酶
引物
一对
底物
dNTP
模板
量少
产物
等长的DNA片段
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back
测序反应
测序酶 单向
dNTP+ddNTP* 质量要求高
长短不一的片段 3’端带荧光标记
CCME 03
测序反应操作步骤
• 实验前准备 • Mix配制 • 测序引物稀释 • 编板号（日期_S位点_测序引物_纯化板编号_（其它）） • 反应加样 • 短暂离心后上PCR仪
5×buffer
0.85 μL
Primer（3.2p） 1.0 μL
去离子水
1.85 μL
-------------------------------------
5μL
DR位点用1/20体系
1/20体系：
模板
1.0 μL
Bigdye（2.5×）
0.4μL
5×buffer
0.8μL
Primer（3.2p）
PCR产物20-50ng；质粒100-200ng
3.2pmol
0.5μl
0.4μl 0.3μl 0.2μl
0.75μl 0.8μl 0.85μl 0.9μl
5μl
Step2：振荡3秒或颠倒5次混匀，离心10秒，冰上或 4℃避光保存，当天使用；剩余mix可-20℃保存，避 免反复冻融，解冻2次内用完。
• HLA 是迄今为止发现的多态性最高的基因系统 之一，它与同种异体器官移植的排斥反应密切 相关，而且该基因的高度多态性在法医学上的 亲子鉴定、个人识别以及疾病相关性和人类进 化研究方面也起着重要作用。
• HLA配型在器官移植中是必要的。HLA的相容 性程度（配型的符合程度）是决定移植物长期 存活的主要因素之一。
干粉稀释 Step1：按合成报告单上的分装规格计算稀释至所需浓
度应加入的超纯水； Step2：将干粉离心12000rpm， 2min； Step3：加入一定体积的millipore水后盖好离心管盖； Step4：振荡1分钟，室温放置30分钟，使其充分溶解； Step5：再次振荡30秒，离心10秒。
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1.0 μL
去离子水
1.8μL
--------------------------------------------
5μL
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21 CCME 03
加样时注意事项：
1. 使用前检查移液器量程设定是否准确； 2. 使用时检查吸取液体量是否准确，排液后枪头内 不能有残留； 3. 在距管口3-5毫米处贴管壁加微量试剂.
N
H H
OH
H H
OH （ H）
OH（H）
OH OH（H）
脱氧核糖核苷酸通过形成3,5-磷酸二酯键延长DNA链
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CCME 03
测序原理
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10 CCME 03
测序原理
经PCR扩增反应，可以得到一系列长度不同的产物，由于ddNTP带有荧
光标记，对产物进行电泳分离，并用相应的仪器进行检测，就可以读出
一对应写在新的Ep管上。
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CCME 03
反应加样
• 按《测序反应表》将待测样本和测序引物摆放到 96试管架上对应位置；移液器调至所需量程；实 验用品放在便于操作的位置；测序反应板标记板 号后开始加样。