真菌药敏试验规范化操作
真菌药敏标准操作规程
真菌药敏标准操作规程真菌药敏标准操作规程一、实验室准备1. 实验室应设有专门的真菌药敏实验室，确保实验操作的安全性和准确性。
实验室的温度应保持在20-25摄氏度，相对湿度不超过60％。
2. 实验室应配备必要的设备和试剂，包括培养箱、显微镜、培养基及药物试剂等。
3. 实验人员应穿戴个人防护用品，包括实验服、手套、口罩和护目镜等，确保工作区的清洁和无菌。
二、标本处理1. 收集患者真菌感染标本，包括病理组织、血液、尿液、呼吸道分泌物等。
标本应立即送到实验室进行处理。
2. 标本处理前，应进行外部消毒，消毒方法可以是用70％的乙醇擦拭外表面。
3. 标本应立即进行处理，避免存放时间过长，以防真菌生长导致结果不准确。
三、真菌培养1. 将标本分散在适量的无菌生理盐水中，进行稀释。
注入培养基琼脂平板和液体培养基中，分别进行固体培养和液体培养。
2. 样本应在常温下放置，避免光照，保持湿润，以利于真菌生长。
3. 观察培养过程中真菌的生长情况，包括菌落形态、颜色、透明度等。
四、药敏实验1. 在培养基上划线，将待测真菌分散在培养基中。
2. 向培养基中加入不同浓度的药物，利用层析法、扩散法等方法进行药物敏感性测试。
3. 观察药物对真菌的抑菌效果，包括抑菌区直径和抑菌程度。
4. 根据药物敏感性测试结果判断真菌的药物敏感性，分为敏感、中度敏感、抵抗。
五、数据分析和结果判断1. 测定抑菌区直径，记录数据。
2. 根据抑菌区直径和抑菌程度，将真菌分为敏感、中度敏感和抵抗。
3. 结合临床情况和药物用药指南，判断真菌感染的治疗方案。
六、结果报告和存储1. 将测试结果进行记录和整理，制作报告。
2. 将结果报告及时反馈给医生。
3. 将结果数据进行存储，备份和管理，以便后续研究和参考。
七、质量控制1. 每批药物敏感性测试都应包含阳性对照和阴性对照，以确保测试结果的准确性和可靠性。
2. 定期进行质量控制，检查培养基的质量和药物敏感性测试的准确性。
药敏试验操作方法
药敏试验操作方法
药敏试验操作方法一般包括以下步骤：
1. 菌株选取：选择适当的病原菌株进行测试，一般使用已知药敏性的参比菌株作为对照。
2. 菌液的制备：将菌株接种到培养基上培养，培养至菌量合适后，采用生理盐水调制成适宜浓度的菌悬液。
3. 菌液的稀释：取一定数量的菌悬液，根据草浆法或直接法进行适当稀释，使菌量达到目标细菌的浓度，一般为0.5-2×10^8个CFU/mL。
4. 抗生素的制备：按照制备好的抗生素试纸或试剂盒的说明，将抗生素溶液或药片溶解成合适浓度的抗生素溶液。
5. 稀释菌液的扩散：将已制备好的菌液均匀涂布在含有良好的抗生素稀释浓度梯度的培养基上。
6. 培养基的培养：将涂布了菌液的培养基在合适的温度（通常为35-37）下培养约16-20小时。
7. 结果的解读：通过观察培养基上微生物的生长情况，判断细菌对抗生素的敏
感性。
一般，对抗生素敏感细菌培养后，会在培养基上形成清晰的抑菌圈，直径会随着对菌体敏感程度的增加而扩大。
8. 数据记录和分析：记录抗生素的名称、浓度、菌株信息、抗菌圈直径等数据，并进行统计和分析。
需要注意的是，药敏试验的具体操作方法可能会因实验目的、试验样本、试剂等因素而有所不同，因此在进行药敏试验前应详细阅读试剂盒或试纸的使用说明，并按照说明书操作。
深部真菌药物敏感试验标准操作规程
深部真菌药物敏感试验标准操作规程1．目的规范深部真菌药物敏感试验操作规程，确保药敏结果的准确。
2．适用范围本操作规程适用于念珠菌属和新型隐球菌。
3．选药原则根据CLSI M27-A2的建议选择以下受试药物，5-氟胞嘧啶（5-FC）、两性霉素B（AMB）、氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）、伏立康唑（VRC）。
4．质控见表5-55.表5-55 深部真菌药敏试验质控结果5．试验材料和仪器ATB FUNGUS 3，无菌生理盐水，ATB电子移液器。
ATB F2培养基。
6．操作步骤6.1 打开一个0.85%氯化钠培养基安？（或API培养悬液），采集不超过4日的菌落，制备成浊度相当于2McFarland的悬浮液。
用Farland试剂盒的标准浊度管比较，或使用ATB比浊仪DENSIMAT，此菌悬液必须在准备后立即使用。
6.2 使用一移液管转移20µl此悬浮液到一ATB F2培养基的安？中。
6.3 用ATB电子移液管混匀ATB F2培养基，避免产生气泡，使用ATB电子移液管在每个杯状凹中加入135µl的ATB F2培养基，盖好试条盖子。
6.4 把试条放入一个密封容器或是一个装有吸潮纸是的GENbox型广口容器里，在有氧条件下35℃（+2℃）的环境中，念珠菌属要培养24小时（+2小时），新型隐球菌要培养48小时（+6小时）。
6.5通过ATB仪器自动判读结果。
7．判断标准见表5-56，5-57.表5-56 念珠菌分界点（单位：mg/L）药物S I R5-FC ≤4 18~20≥32AMB ND ND NDFCA ≤8 16~32≥64ITR ≤0.125 0.25~0.5 ≥1VRC ≤1 2 ≥4表5-57 新型隐球的菌分界点（单位：mg/L）药物S I R5-FC ≤4 8~16≥32AMB ND ND NDFCA ≤4 8 ≥16ITR ND ND NDVRC ND ND ND8．注意事项8.1 在自动读取数据前，应擦拭试条的中间部分，去除可能存在的小滴液体，以便仪器辨认试条代码。
药敏实验的操作规程
药敏实验的操作规程药敏实验是一种常用的实验方法，用于测试不同药物对细菌的敏感性。
其操作规程如下：1. 准备工作a. 选择适当的培养基：根据实验目的和细菌的需求，选择适合的培养基。
常用的培养基有Muller-Hinton (MH) 培养基和血琼脂基质（Blood Agar）。
b. 准备药物：根据研究的需求，选择要测试的药物，先进行浓度调节并制备药物试液。
c. 选择试验细菌：选择需要测试的细菌菌株，可选择多种细菌进行测试。
2. 制备药物试液a. 根据药物的浓度和用途，按照配制方法将药物试液制备好。
b. 对于不同药物，可根据需要设定不同的浓度梯度。
通常使用两倍稀释法制备浓度梯度。
3. 制备细菌悬浮液a. 从培养基中取出所需菌株，并用无菌生理盐水进行洗涤，以去除残余培养基或其他杂质。
b. 将菌株悬浮于无菌生理盐水中，通过眼镜划线计数法或光密度测定法调整细菌悬浮液的浓度至合适的范围。
4. 进行测定a. 在MH培养基或血琼脂基质上均匀涂布细菌悬浮液，使其形成薄膜。
b. 将培养基上涂有菌株的培养皿分成数个区域，每个区域均加入一种药物试液。
c. 用无菌的扩菌针分别在每个区域上刺入药物试液，使药物试液与菌株接触。
d. 将培养皿孵育于适当的环境条件下，一般为37℃，孵育时间根据实验目的而定，通常为24小时。
5. 结果判读a. 在观察期间，观察每个区域的菌落生长情况。
b. 比较不同药物试液对细菌生长的影响，评定其敏感性。
c. 根据实验目的和相应参考标准，判断细菌对药物的敏感性、中等敏感性或耐药性。
6. 数据处理和分析a. 统计每个药物试液对细菌的抑菌效果，记录菌落生长情况。
b. 根据实验结果，绘制抑菌效果图或者计算药物的最小抑菌浓度（MIC）。
7. 实验注意事项a. 所有操作必须在无菌条件下进行，避免细菌的污染。
b. 实验人员必须戴上手套，避免药物对皮肤造成刺激。
c. 严格按照药物的安全操作规程进行操作，避免药物泄漏和误服。
药敏试验操作方法
药敏试验操作方法药敏试验是一种常用的实验方法，用于确定某种药物对细菌的敏感性或抗性。
下面是药敏试验的一般操作方法：1. 菌株的培养与准备：首先，选择要测试的细菌株。
常用的菌株包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。
将菌株从冻存状态中转移到琼脂平板上进行培养，然后选取单个菌落进行继续培养。
2. 制备药物浓度梯度：为了测试细菌对不同浓度药物的敏感性，需要制备一系列药物浓度梯度。
可以选择常用的抗生素，如青霉素、利福平等。
根据药物的最小抑菌浓度（MIC）确定所需药物的最高浓度。
3. 制备洗涤液：制备1倍洗涤液，一般使用生理盐水或缓冲液。
如要进行中药药敏试验，可根据实验需求选择适当的提取液。
4. 制备菌悬液：从培养得到的菌落中选择单个菌落，接种到含有洗涤液的试管或培养皿中。
使用比例约为1:100（菌悬液：洗涤液），均匀混合。
5. 药物与细菌接触：将制备好的菌悬液均匀涂布在琼脂平板上，然后使用定量器将一定量的药物滴在琼脂平板上。
确定滴药量时应根据具体药物的MIC进行调整。
6. 培养与观察结果：将涂有菌悬液和药物的琼脂平板进行孵育，时间和温度可以根据具体的实验目的和菌株要求进行调整。
观察培养后的平板上是否出现菌落生长，以及菌落的数量和形态特征。
7. 结果解读与分析：根据观察到的结果，分析不同浓度药物对细菌的抑菌效果，评估细菌对药物的敏感性。
可以根据菌落的出现与否、数量的多少和生长的形态特征来判断细菌是否对药物敏感。
总结：药敏试验是一种重要的实验方法，可以评估细菌对药物的敏感性或抗性。
操作时需要注意菌株的选择和培养方法、药物浓度的制备、菌悬液的制备和药物与细菌的接触方法，以及培养和观察结果等。
通过药敏试验的结果，可以帮助医生选择适当的药物治疗感染病情。
酵母样真菌 ROSCO 法药敏试验标准操作程序
酵母样真菌ROSCO 法药敏试验标准操作程序1正确进行酵母样真菌 ROSCO 法药敏试验操作，监测耐药性酵母菌的出现及其耐药性变化，为酵母样真菌治疗提供参考依据。
2将含有定量抗真菌药物的药片贴在已接种待测菌的琼脂平板，药片所含药物吸收琼脂上水溶解后向周围区域扩散，形成递减的梯度浓度，待测菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映了待测菌对测定药物的敏感性，根据厂家提供的药敏试验判读标准，判断抗真菌药物的体外敏感性。
33.1 培养基：采用 FMH 琼脂，同时添加氯霉素控制细菌的污染。
厚度严格控制为4cm。
3.2 接种液的配置：3.2.1 接种液的配制中，浓度的控制是最为重要的，接种液过浓会导致比咯类/咪唑类抑菌圈判读困难，而出现假阴性结果。
3.2.2 对于大多数的菌株，接种浓度为 5*105CFU/ml (先配 0.5 麦氏浊度，再用生理盐水1 ：1稀释)；3.2.2.1 对于克柔氏念珠菌(C.krusei)，先配0.5麦氏浊度，再用生理盐水1：10稀释；3.2.2.2 对于隐球菌属(Cryptococcus)，先配1.0麦氏浊度，无需稀释。
3.2.3 接种前，平板先置于 35℃干燥 20-25 分钟。
对于9cm平皿吸 0.5ml接种液，14cm吸1.0ml接种液，倾注于平板表面，涂布均匀，用移液管吸走多余液体。
然后，平板在 35℃干燥10分钟，帖药片。
最终要求，在琼脂表面，菌落恰呈合生长。
3.3 培养条件：在多数情况下，应在 35℃培养 18-24 小时后马上测量抑菌圈，因为培养时间过长会导致假耐药，特别是对于咪唑/吡咯类药物。
即培养过夜后应检查平板，如果抑菌圈清晰，应该马上测量。
如果对于某些菌株在培养过夜未见生长，那么应该再多培养 24 小时。
而对于隐球菌属在 30℃ 培养 42-48 小时。
4严重系统性感染株判读标准注：氟胞嘧啶 10ug 推荐用于黑曲霉试验， 而氟胞嘧啶 1ug 适用于念珠菌和其他酵母菌 55.1.对于多烯类抗真菌药(包括两性霉素 B 和制霉菌素)，测量无可见生长的清晰的抑菌圈，抑菌圈 出现的菌落必须视为耐药突变株；5.2 对于吡咯/咪唑类抗真菌药以及特比奈芬，在正常生长菌落形成的抑菌圈内，可能会出现由较小的部分被抑的菌落形成抑菌圈。
药敏试验操作方法
药敏试验根据美国临床标准委员会 ( NCCLS )推荐的 K-B 琼脂法进行，药敏纸片选择中国生物制品鉴定所药敏纸片，试验所选择药物必须包括下列抗生素：氨苄西林 ( AMP )，阿莫西林/克拉维酸 ( AMC )，头孢噻吩 ( CFT )，头孢噻肟 ( CTX )，庆大霉素 ( GEN )，萘啶酸( NAL )，诺氟沙星( NOR)，四环素( TBT)，利福平 ( RFA)，复方新喏明( SMZ )。
(1)将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养 16~18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于 3ml 生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管( 0.5麦氏单位)相同。
(2)用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。
用棉拭子涂布整个 M-H 培养基表面，反复几次，每次将平板旋转 60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
(3)待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。
用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。
每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm ，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。
在菌接种后15分钟内贴完纸片。
(4)将平板反转，孵育18~24小时后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录(附表 5 )。
抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。
有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。
结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。
(1)制备 MH 琼脂平板应用直径 90mm 平皿，在水平的实验台上倾注。
琼脂厚为4±0.5mm(约 25-30ml 培养基)，琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在 5日内用完，使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴。
倾注平皿前应用 pH 计测 pH 值是否正确(pH 应为7.3)。
pH 过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。
真菌药敏试验规范化操作
M60
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M57-Ed1 2016.04 建立抗真菌药物流行病学折点的原理和方法
1×103~3×103 CFU/ml
• 链格孢属 30℃； • 其它35℃。 孵育条件 • 根霉21~26h； • 镰刀菌属、曲霉属、申克氏孢子丝菌
46~50h • 赛多孢属 70~74h
• 35℃ • 培养至产孢良好
丝状真菌悬液制备
• 接种物
– 分生孢子或孢囊孢子菌悬液0.4×104~5×104 CFU/ml
丝状真菌肉汤稀释法结果判读
读取生长抑制
两性霉素B
氟康唑、酮康唑 氟胞嘧啶
伏立康唑、伊曲康唑 泊沙康唑、雷伏康唑
棘白菌素
非皮肤来源 100% 50% 100% MEC
皮肤来源 80% 80% 80% 80%
微量肉汤稀释法
✓ 考虑到气溶胶、溅洒、操作环节等，建议制备菌悬液的工 作在生物安全IIA或IIB级生物安全柜内操作。
AMB
ITR
VOR
POS
CAS
MF
ECVs (n=307) 0.6%
0.3%
1%
0
0
-
WBPs (n=332) 1.5%
0.9%
2.4%
0.3%
0
0
ECVs——非野生型（non-wild type） WBPs——体外耐药（in vitro R）
Li Y, Wang H, Zhao YP, et al. J Microbiol Immunol Infect. 2018 May 17. pii: S1684-1182(18)30106-3
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CLSI真菌药敏标准文件
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M44-Ed2 2009.08 酵母菌纸片扩散药敏试验方法
7% 27%
40%
12% 14% 真菌药敏送检量
2508
13%
54%
16% 4% 13% 真菌血清送检量
4592
1万例以上 1000-9999例 100-999例 1-100例 0例
数据尚未发表
抗真菌药物
分类 多烯类
咪唑类
第一代 第二代
唑类（吡咯类）
三唑类
第三代 新一代
嘧啶类
丙烯胺类
胞嘧啶
棘白菌素类
菌株分类 非皮肤霉菌
皮肤霉菌
培养基 0.2%/2%葡糖 RPMI 1640, 0.165mol/L MOPS, pH 7.0±0.1
• PDA 35℃ 培养条件 • 毛霉目、曲霉48h；
• 镰刀菌35℃ 48~72h + 25~28 ℃至7d
接种量 0.5×104~5×104 CFU/ml
•PDA；燕麦琼脂（仅红色毛癣菌) •30℃ 4~5d 至产孢良好
酵母菌微量肉汤稀释法
• 改良培养基
– 含2%葡萄糖的RPMI, 0.165mol/L MOPS, pH 7.0 – 含MOPS的酵母氮的基础肉汤（新型隐球菌）
• 菌株传代
– 沙保弱培养基(SDA)或土豆培养基(PDA)，35℃ – 念珠菌 24h，隐球菌 48h
• 挑取菌落
– 0.5麦氏浊度（1~5×106CFU/ml）
1×103~3×103 CFU/ml
• 链格孢属 30℃； • 其它35℃。 孵育条件 • 根霉21~26h； • 镰刀菌属、曲霉属、申克氏孢子丝菌
46~50h • 赛多孢属 70~74h
• 35℃ • 培养至产孢良好
丝状真菌悬液制备
• 接种物
– 分生孢子或孢囊孢子菌悬液0.4×104~5×104 CFU/ml
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M57-Ed1 2016.04 建立抗真菌药物流行病学折点的原理和方法
Байду номын сангаас
基本概念
最低抑菌浓度 MIC
• 抑制菌的生长至特定程度的最低药物浓度。
最低有效浓度 MEC（曲霉-棘白菌素）
• 能够导致菌丝形成小的、圆形的、紧凑的菌丝颗粒的最低药物浓度
最低杀真菌/致死浓度 MFC
• 从显示完全抑制生长的每个MIC孔中取混悬液转种于琼脂培养基 • 真菌不生长或3~5个菌落生长的最低药物浓度
真菌药敏试验规范化操作
真菌亚专业分组与独立真菌工作区域
348家三甲综合医院真菌检测现状调研
真菌亚专业分组
(n=348)
28% 72%
有真菌亚专业分组 无真菌亚专业分组
有独立真菌工作区域医院的比 独立真菌工作区域面积 例
41%
59%
2 8平方 米
有独立真菌工作区域 无独立真菌工作区域
20%
80%
有独立真菌工作区域 无独立真菌工作区域
代表性药物 两性霉素B
咪康唑 酮康唑 氟康唑 伊曲康唑 伏立康唑 泊沙康唑 氟胞嘧啶 特比萘芬 卡泊芬净 米卡芬净 阿尼芬净
真菌药敏试验方法
• 微量肉汤稀释法
• 商品化微量肉汤稀释法 –ATB Fungus 真菌药敏试条 –Sensititre® YeastOne™比色法真菌药敏板
• 浓度梯度法 –Etest 真菌药敏试条
• 接种量
– 0.5~2.5×103CFU/ml / 0.5~2.5×105CFU/ml
• 孵育条件
– 35℃ 24h – 如生长对照孔生长较弱，延长培养至48h
微量肉汤稀释法
• 结果判读： • 两性霉素B：100%抑制 • 唑类、5-氟胞嘧啶、棘白菌素类：50%抑制
酵母菌结果判定-M60
丝状真菌肉汤稀释法
• 诱导产孢
– 大部分菌PDA 35±2⁰C 7d或至产孢良好 – 毛霉和曲霉48h，镰刀菌属35±2⁰C 48~72h然后28~30±2⁰C培养到7天。
• 1 ml 0.85%盐水，±1滴 or 0.01 ml吐温20，尽量去除菌丝片段。 • 静置3~5 min，取上清转移至无菌管，振荡15s • 使用光线路径1 cm比色杯，测定530 nm光密度： • 曲霉、拟青霉 0.09~0.13， • 镰刀菌、毛霉、波氏假阿什利霉、多育赛多孢 0.15~0.17， • 链格孢、离蠕孢 0.25~~0.3 • 悬液1:50稀释，达到最终要求浓度的2倍
M59
M59-Ed2 2018.01 抗真菌药物敏感性流行病学折点
M57
M60-Ed1 2017.11 酵母菌药敏试验参考标准
M27&M44
M61-Ed1 2017.11 丝状真菌药物敏感试验标准
M38&M51
EUCAST真菌药敏文件
• E.DEF 7.3.1 酵母菌肉汤稀释法 • E.DEF 9.3.1 产孢丝状真菌肉汤稀释法 • ECUAST推荐抗真菌药物敏感性日常及扩展的内部质控 • EUCAST临床折点依据，11个文件 • EUCAST技术说明，9个文件 • 真菌临床折点V8.1 • 免费英文版 • ChiCAST官方中文版
20 平方 米
数据尚未发表
2017年全年真菌检测送检量
348家三甲综合医院真菌检测现状调研
真菌检测各项目各数量级送检量的医院比例
(n=348)
100% 80% 60% 40% 20% 0%
平均送检量
15%
59%
18% 35% 真菌涂片送检量
5180
21%
48%
23% 53% 真菌培养送检量
7022
基本概念
临床折点 CBP
• 可将菌株分为：敏感，剂量依赖性敏感，中介，耐药或非敏感
流行病学界值 ECV
• 可区分具有/不具有耐药表型菌群的MIC或纸片法直径 • 可将菌株分为野生型（WT）与非野生型（NWT） • Vs. CBP: 仅根据体外数据建立
剂量依赖性敏感 SDD
• 通过提高剂量来达到高于正常血药浓度的目的 • 目前抗真菌药物仅用于氟康唑