冰冻切片免疫荧光取材
各种组织冰冻切片、取材,染色等具体操作方法(连载一 脑、肠、眼球)
各种组织冰冻切片、取材，染色等具体操作方法(连载一脑、肠、眼球）1.做脑组织的冰冻切片在前期的处理过程中很重要，因为脑组织非常软。
不但要做前固定，最好是做全身灌注固定后，如果不做全身灌注固定，很难取出一个完整的大脑组织。
再段头取脑置4度4％多聚甲醛（或西奈山环保组织固定液）中后固定24小时，然后依次置入剃度PB蔗糖溶液脱水，剃度可以设为15%，20%，30%分别过夜沉底即可。
设剃度脱水是为了避免组织块冰晶的产生。
冰晶在组织片上表现为圆形或椭圆行的空洞，影响实验结果。
在做切片时可以做简单的HE染色即可分辨出是否有冰晶。
防止冰晶的另一实验注意点是在做切片前的包埋过程，要求速冻，一般放-20度下15分钟即可，温度高如室温或者4度是达不到速洞效果的，温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂。
而且产生冰晶。
2.如果想要作出满意的漂亮的实验结果，特别是免疫双标共聚焦，那就要求更高，实验的每一步都要很严格，不是我说法夸张，是因为做共聚焦要避免自发荧光的问题，而实验的每一步都可能产生自发荧光，比如4％多聚甲醛灌注液，PB蔗糖等都可以产生让我们头痛的自发荧光问题，根据我的实验经验，国产的多聚甲醛作实验很容易产生自发荧光，难以避免，不过据我导师讲，他在国外做共聚焦不存在这些问题，所以我个人认为你不妨先做单标试试看，能避免自发荧光，那最大的难题就解决了。
西奈山环保组织固定液可以降低自发荧光背景。
3.是否做漂片还是贴片的问题，脑组织两种方法都可以，唯独共聚焦例外，做共聚焦要求片子一般为30-50um，厚片才能达到三维重建的效果。
一般的贴片文献上提到的是20-30um用漂片，此法要求抗体用量较大，最好买国外原装的浓缩液。
不过我做的脑片切过4um的做一般的普通免疫荧光可以。
楼上的几位同仁说得不错。
就我们实验室的操作方法以及个人的体会说上几点：1.如果灌注固定较好的话，完全可以省去后固定这个步骤。
神经组织常规的固定液为4%的多聚甲醛，如果在其中再加入0.25-0.5%的戊二醛增加其固定时的交联作用，那么固定的效果就会更好些，脑或脊髓标本就会更硬些；我们一般用1000ml多聚甲醛固定至少2小时。
免疫荧光法—冰冻切片
免疫荧光－冰冻切片间接法
免疫荧光法实验——冰冻切片
间接法
【标本】正常肝、肝癌标本冰冻切片
【抗体和试剂】
（1）荧光标记抗体：兔抗人LAPTM-4B-N端（胞浆内）一抗；羊抗兔IgG-TRITC二抗；小鼠抗人integrin α6 McAb；小鼠抗人EGFR多抗
（小鼠抗人EGFR单抗）；羊抗鼠IgG-FITC二抗（工作浓度为1:30）；
（2）0.01mol/L pH7.4 PBS
（3）2%BSA：用于配制一抗及封闭非特异性结合位点（可用正常羊血清封闭非特异性结合位点）
（4）缓冲甘油封片：1份0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液与9份甘油混合
0.2mol/L PB：X ml 0.2mol/L Na2HPO4 + Y ml 0.2mol/L NaH2PO4
pH8.0 X=94.7ml; Y=5.3ml
【染色步骤】
1．冰冻切片室温丙酮（冷丙酮）固定10min，PBS洗5min×3；
2．2％BSA37︒C封闭60min或4︒C过夜；
3．置切片于湿盒内，分别滴加一抗37︒C 30min；
4．PBS洗5min×3；
5．分别滴加二抗37︒C 30min；
6．PBS洗5min×3；
7．若染核；用1μg/ml Hoechst33342染色10min；PBS洗5min×3；
8．缓冲甘油封片；
9．荧光显微镜下观察或-20℃避光保存；。
冰冻切片 免疫荧光组化
冰冻切片免疫荧光组化
冰冻切片和免疫荧光组化技术是生命科学中广泛应用的技术。
以
下是两种技术的简介：
1. 冰冻切片技术：冰冻切片是把组织或细胞快速冻结并切成薄
片的技术。
不同于石蜡包埋技术，冰冻切片不需要前期的化学处理和
固定，具有样品保留完整活性、切片速度快、质量高等优点。
冰冻切
片广泛应用于免疫荧光组化、原位杂交、基因组学等技术中。
2. 免疫荧光组化技术：免疫荧光组化技术是一种利用特异性抗
体对目标分子进行标记和检测的技术。
该技术在机体免疫学、病毒学、肿瘤学和神经科学等领域广泛应用，可用于检测病毒、肿瘤标志物、
蛋白质表达、分子相互作用等。
通过将免疫球蛋白标记荧光染料或酶
标记物质后，通过显微镜或荧光显微镜观察样品上的染色，并进行分析。
该技术具有灵敏、特异、可视化等优点，已成为生命科学研究中
必不可少的技术之一。
冰冻切片免疫荧光实验步骤
冰冻切片免疫荧光实验步骤1. 前言嘿，朋友们！今天我们来聊聊一个科学实验的酷炫玩法——冰冻切片免疫荧光实验。
你可能会想，这听起来有点高深，其实没那么复杂，咱们用轻松的方式来搞定它！这个实验就像是给细胞穿上五光十色的衣服，让它们在显微镜下闪闪发光。
是不是听起来有点像魔法？不过，魔法背后可是需要一系列精细的步骤哦，接下来就让我们一起踏上这趟科学之旅吧！2. 材料准备2.1 器材首先，咱们得准备好一些“武器”。
你需要的工具有：冷冻切片机、显微镜、抗体、荧光染料、冰块、以及小瓶子。
别担心，这些东西在实验室里一般都能找到。
好比去超市购物，准备齐全才能大干一场嘛！2.2 样本收集然后，咱们得搞定样本。
可以用小动物的组织，比如小鼠的肝脏或脑组织，当然也可以是细胞培养。
像选菜一样，找个健康的样本，才能做出美味的实验结果。
记得小心翼翼哦，样本可是你实验的“主角”！3. 冰冻切片3.1 制作切片接下来就是最重要的环节了！将收集到的样本放进冷冻机，设置好温度，通常是在20°C到80°C之间，具体要看你使用的试剂。
等样本冰冻得像冰棍一样，取出来，用冷冻切片机将它切成薄薄的片，厚度大约在510微米之间。
要知道，切片越薄，观察的时候越清晰，就像看电影的时候画面越高清，效果自然越棒！3.2 贴片固定切好的薄片就像鲜花一样，需要“小心翼翼”地处理。
将切片放到载玻片上，记得用一些固定液，比如丙酮或者甲醇，给它们来个“定妆”！这样能让你的切片在后续步骤中更加稳固。
让我们给这些切片点个赞，做得不错哦！4. 免疫染色4.1 抗体孵育好了，接下来的步骤就像给细胞化妆一样。
把固定好的切片放进抗体溶液里，让它们充分“泡澡”。
通常来说，先用一抗（即特异性抗体）孵育，时间可以在1小时到过夜之间，视情况而定。
这个时候，你可以想象细胞们正开心地吸收着抗体，准备好接下来的“盛宴”！4.2 荧光染料待一抗充分结合后，咱们再来一剂“荧光染料”！同样把切片浸泡在二抗（荧光标记抗体）里，接着再静置一会儿。
冰冻切片详细说明
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
⑶移至25%明胶溶液内浸6-24h。
⑷25%明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min 。
⑹蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。
切片可保存于10%甲醛液中。
⑺依检查目的而进行染色，染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。
冰冻切片 免疫荧光组化
冰冻切片免疫荧光组化都是生物医学研究中常用的技术。
冰冻切片是将组织样本冻结后，使用切片机将其切成薄片，用于病理学研究、免疫组化等方面。
冰冻切片是一种快速、简便的技术，适用于病理诊断，可以用于分析组织、细胞和细胞器的结构和功能。
免疫荧光组化是一种检测特定抗原或抗体在组织中分布情况的技术。
它利用荧光染料与抗原或抗体的结合来检测它们在组织中的位置。
这种技术可以用于研究细胞的分子结构和功能，诊断疾病，以及监测治疗的效果等。
在实际应用中，冰冻切片和免疫荧光组化常常结合使用。
首先，使用冰冻切片制备细胞或组织切片，然后通过免疫荧光染色技术检测特定抗原或抗体在切片中的分布情况，从而获得更详细的细胞或组织结构信息。
冰冻切片免疫荧光间接法实验
实验报告3.因为相同种属的一抗具有相同的同种型抗原表位，因此一种与一抗不同种属的二抗可以结合多种一抗。
间接法荧光标记一方面节省标记成本，提高通用性；另一方面提高灵敏性，使信号更强。
但容易出现非特异染色，所以要用用与二抗同种的正常血清或白蛋白与组织孵育，封闭非特异位点。
4.注意：1）一抗和二抗是不同种属来源的抗体。
2）标记二抗与一抗必须是同一类（通常用的是抗人IgG）分、均匀，同时降低非特异结合或吸附）。
3）反应后用PBS洗3次，每次5分钟。
4）在冰浴中预先用0.1MPBS 配制荧光标记二抗。
5）切片甩干，擦去多余PBS。
滴加适量的二抗，盖好湿盒。
于37℃恒温培养箱孵育2小时。
注意加二抗过程及孵育过程中避光。
6）为更好显示细胞结构，一般用蓝色DAPI衬染，以确定所检测抗原的位置。
DAPI分装后，一般用锡纸包裹避光，-20℃保存，用时提前取出解冻。
7）在二抗孵育结束前8分钟，取出湿盒，滴加荧光染料DAPI，吹吸混匀，盖好湿盒。
于37℃继续孵育8分钟。
注意实验过程中避光。
8）二抗孵育结束后取出切片置于染缸中，0.01M pH7.4PBS浸泡。
9）置于37℃摇床中摇洗三次，每次15分钟。
摇床转速一般每分钟100转，摇洗过程注意避光。
4.封片1）免疫荧光技术常用封片剂：缓冲甘油封片剂。
2）将浸洗好的切片甩干，擦去多余水分。
滴加甘油封片剂，轻轻盖上盖玻片，防止出现气泡。
待干燥后在盖玻片周围涂指甲油封边5.镜下观察立即用荧光显微镜观察。
注意：一般标本在高压汞灯下照射超过3分钟，就有荧光减弱现象。
经荧光染色的标本最好在当天观察，随时间延长，荧光强度会逐渐下降。
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜后，OCT 包埋。
-20C保存3月，-80C长期保存。
请勿保存于液氮。
2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存3，切片从-20 取出后，在通风橱放10-30 分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20 C 丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS 清洗玻片, 3X5min 从此请保持玻片湿润5, 有时,抗原修复3 小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压•微波修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）… 关注修复的温度 ,时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间）,抗原修复液必须遵循自然降温规律, 使用足量的抗原修复液… 选择不同PH 值的修复液（A 液枸盐酸缓冲液PH6.0, B 液EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6, 室温封闭1 小时封闭液：5%BSA+1 0%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in IxPBS （细胞因子,无需封闭的蛋白7, 一抗4C过夜请用封闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温1 小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DAPI 染核5min，12，DDW Rinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14,干片后4C保存石蜡切片的免疫荧光1 ，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡包块2,组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水：58 °C 20mi n-xylene 2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-, DDW5min4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润5，抗原修复过夜。
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2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。
2.1.5.1 标本制备
1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只，
麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)，
先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上），
将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。
灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳；
2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。
3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水；
脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋；
4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。
将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用；
5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。
6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。
选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。
7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。
2.1.5.2 免疫荧光染色步骤
1) 取出冰冻切片，室温放置30min，PBS 洗10min×3 次；
2) 0.4%Triton-100 浸泡10min（1000ml PBS+4ml Triton-100）；
3) PBS 洗10min×3 次；
4) 抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）；
5) PBS 洗10min×3 次；用组化笔在距离组织2mm 处划圈；
6) 5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h；
7) 一抗：甩去多余血清，不洗。
滴加PBS配置的一抗，4℃过夜。
阴性对照用PBS替代一抗；
8) PBS 洗10min×3 次；
9) 二抗：滴加Alexa Fluor488 标记的驴抗羊荧光二抗（均为1：200配置），20~25℃室温避光孵育2h；
10) PBS 洗10min×3 次；
11) Hochest33342 复染核10~20min；
12) PBS 洗10min×3 次；
13)抗荧光衰减封片剂封片，置于避光盒内；
14) Olympus F1000 激光共聚焦显微镜用488nm 波长的激光器激发绿色，计算机进行数据采集和成像。