病毒转基因技术原理-概述
转基因的基础知识
转基因的基础知识目录1. 转基因概述 (2)1.1 转基因的定义 (2)1.2 转基因技术的发展历史 (3)1.3 转基因技术的分类 (4)2. DNA及基因的介绍 (5)2.1 DNA的结构与功能 (7)2.2 RNA和基因表达 (8)2.3 基因的识别和分离 (9)3. 转基因的方法学 (10)3.1 直接基因运输法 (12)3.1.1 显微吸管法 (13)3.1.2 电穿孔法 (14)3.1.3 粒子轰击转化法 (15)3.2 载体介导的转基因技术 (16)3.2.1 病毒载体 (17)3.2.2 细菌载体 (18)3.2.3 人工染色体载体 (19)3.3 基因编辑与基因驱动 (20)4. 转基因伦理与法律考量 (22)4.1 转基因伦理争议 (24)4.2 转基因法律法规现状 (25)4.3 公众认知与消费者权利 (26)5. 转基因在农业中的应用 (27)5.1 转基因作物开发 (28)5.2 转基因农作物的益处与风险 (30)5.3 转基因作物的常见类型 (31)6. 转基因在生物医药领域的应用 (32)6.1 基因治疗 (33)6.2 基因工程用于疫苗与药物 (34)6.3 转基因动物模型 (36)7. 转基因的未来趋势 (37)7.1 新基因编辑工具的发展 (38)7.2 转基因技术的精确性与安全性提升 (40)7.3 生态系统平衡与生物多样性保护 (41)7.4 全球化与转基因的国际合作 (42)1. 转基因概述又称基因工程，是一项革新性的生物技术，通过基因操作改变生物遗传物质，赋予其新的特性或增强现有特性。
核心原理是将目标基因（如抗病基因、抗虫基因、提高营养价值等）从一个生物体（供体生物）分离并插入到另一个生物体的基因组中（受体生物），从而改变受体生物的基因组成。
这一过程能够使受体生物获得新的功能，例如抵抗特定病害、耐受农药、提高产量、增强营养价值等。
转基因技术广泛应用于农业、医药、环境保护等领域，对人类生活产生了深远影响。
病毒转基因技术原理腺相关病毒课件
腺相关病毒的监管现状与政策建议
监管机构
各国政府设立了相应的监管机构 ，负责监督和管理病毒转基因技
术的研发和应用。
法规制定
各国政府制定了一系列法规和标 准，以确保病毒转基因技术的安
全性和可靠性。
政策建议
建议各国政府加强国际合作，共 同制定和完善病毒转基因技术的
监管政策和标准。
未来展望与研究方向
未来展望
06
CATALOGUE
腺相关病毒的安全性评价与监管现状
腺相关病毒的安全性评价
宿主范围
腺相关病毒的宿主范围窄，主 要感染分裂期细胞，对静止期
细胞不感染。
免疫原性
腺相关病毒的免疫原性低，不 会引发明显的免疫反应。
基因整合
腺相关病毒的基因整合频率低 ，不会引起基因突变。
毒性
腺相关病毒的毒性很低，对动 物和人体无毒害作用。
病毒转基因技术原 理腺相关病毒课件
目录
• 病毒转基因技术概述 • 腺相关病毒概述 • 腺相关病毒作为基因治疗载体的优势与局
限 • 腺相关病毒的基因转移机制 • 腺相关病毒在基因治疗中的应用案例 • 腺相关病毒的安全性评价与监管现状
01
CATALOGUE
病毒转基因技术概述
病毒转基因技术的定义与特点
04
新产生的病毒粒子通过 细胞膜释放到细胞外， 完成基因转移过程。
腺相关病毒的免疫反应与逃逸机制
宿主细胞对腺相关病毒的感染会产生 免疫反应，如产生抗体和细胞毒性T 细胞等。
了解腺相关病毒的免疫反应与逃逸机 制有助于提高基因转移效率和安全性 。
腺相关病毒通过逃逸机制逃避宿主细 胞的免疫攻击，如抗原变异和免疫抑 制等。
总结词
腺相关病毒在罕见病基因治疗中具有独 特优势，为罕见病患者提供了新的希望 。
《转基因技术及应用》课件
THANK YOU
汇报人：
食品安全：可 能对人体健康 产生影响，如
过敏反应等
防范措施：加 强监管，建立 完善的转基因 技术安全管理 体系，提高公 众对转基因技 术的认识和接
Байду номын сангаас受度。
转基因技术的发展 前景与展望
转基因技术在农业领域的发展前景与展望
改善作物品质：通过转基因技术改 善作物的营养成分、口感、外观等
品质
应对气候变化：通过转基因技术提 高作物的抗旱、抗寒、抗热等能力，
基因治疗：通过转 基因技术治疗遗传 性疾病，如血友病 、地中海贫血等
生物反应器：利用 转基因技术生产生 物反应器，提高药 物生产效率和成本 效益
转基因技术的安全 性评估
转基因食品的安全性评估
转基因食品的定义：通过基因工程技术改变生物的遗传物质，从而获得具 有特定性状的食品。
安全性评估的内容：包括对转基因食品的毒性、过敏性、营养成分、环境 影响等方面的评估。
1983年，科学家首次将外源基因导入动 物中，开启了转基因动物的研究
1994年，美国批准了第一种转基因食 品——转基因番茄的上市，标志着转 基因食品的商业化
2000年，中国批准了第一种转基因食 品——转基因抗虫棉的上市，标志着 中国转基因食品的商业化
2010年，科学家首次将外源基因导入 人类胚胎中，开启了转基因人类的研究
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医药工业：转基因技术在医药工业 中的应用，如转基因疫苗、药物等
环保工业：转基因技术在环保工业 中的应用，如转基因微生物在污水 处理、废物处理等方面的应用
生物制药领域的应用
基因工程药物：通 过转基因技术生产 具有特定功能的蛋 白质药物
高三生物讲义《转基因技术》
第一讲转基因技术1．1 基因工程的理论基础1．基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。
2．理论基础（1）基因拼接的理论基础：①DNA是生物的主要遗传物质；②DNA的基本组成单位都是4种脱氧核苷酸；③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
（2）外源基因在受体内表达的理论基础：①基因是控制生物性状的独立遗传单位；②遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向；③生物界共用一套遗传密码。
1．2 DNA重组技术的基本工具1．限制性核酸内切酶：“分子手术刀”（1）来源：主要从原核生物分离纯化出来。
（2）作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列；并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（3）举例：Eco RⅠ限制酶SmaⅠ限制酶2．DNA连接酶：“分子缝合针”（1）作用：将双链DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（2）类型：①E·coli DNA连接酶：从大肠杆菌中分离得到的，只能连接互补的黏性末端，不能连接平末端。
②T4DNA连接酶：从T4噬菌体中分离出来的，既能连接互补的黏性末端，又能连接平末端，但连接平末端的效率比较低。
3．基因进入受体细胞的载体：“分子运输车”（1）具备条件：①能在宿主细胞内稳定保存并复制；②有一个至多个限制酶切割位点，以便与外源基因相连；③有标记基因，以便进行筛选。
（2）常用载体：质粒、噬菌体和动植物病毒的DNA。
例题精讲【例1】与“限制性内切酶”作用部位完全相同的酶是（）A．反转录酶B．RNA聚合酶C．DNA连接酶D．解旋酶【答案】C【例2】下列粘性末端属于同一种限制性内切酶切割而成的是（）A．①③B．②③C．③④D．②④【答案】A【例3】图示某DNA片段，有关该图的叙述中，不正确的是（）A．①②③可形成DNA的基本组成单位B．④在基因中的排列顺序包含着遗传信息C．DNA复制时解旋酶作用于⑤D．DNA连接酶可连接⑤处断裂的化学键【答案】D【例4】现有一长度为1000碱基对(bp）的DNA分子，用限制性核酸内切酶Eco RⅠ酶切后得到的DNA 分子仍是1000 bp，用KpnⅠ单独酶切得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子，用Eco RⅠ、KpnⅠ同时酶切后得到200 bp和600 bp两种长度的DNA分子。
基因转移技术
影响DEAE-葡聚糖的转染效率的主要因素：细胞的数 量、DNA的浓度和DEAE-葡聚糖的浓度最为重要。大 体说来，按每个直径10cm的培养皿中加入 1～10ug的 转染DNA，并使用每毫升培养基含100～400ug DEAE-葡聚糖的溶液，对于绝大多数类型的细胞，都 能得到很好的转染效率。由于DEAE-葡聚糖对有些细 胞具有毒性，因此用低浓度溶液作短时间的接触反类是将目的基因转导入体外培养的细胞或导入从 体内取出的细胞，观察目的基因在细胞中的表达，这 项技术称基因转染(gene transfection )技术。通常情 况下，该技术转入的目的基因不与细胞染色体发生整 合，而是在细胞质呈现暂时性表达，随时间推移而逐 渐减弱或消失。为了使目的基因进入细胞后能与细胞 基因组DNA发生整合、产生永久性的表达，需用病毒 载体将目的基因导入细胞，并发生整合；
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在1987年，Vlein首先报道了应用此技术将 TMV（烟草花叶病毒）RNA吸附到钨粒表面， 轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒RNA能进 行复制，并以同样技术将CAT(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)基因 导入洋葱表皮细胞。现在，该技术已在烟草、 水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜 豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上 成功。
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它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方 法， 1.可直接用不含有原核载体DNA片段的外 源基因进行转移； 2.外源基因的长度不受限制, 可达100kb ； 3.实验周期相对比较短。
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二、电穿孔法(Electroporation)
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电穿孔(electroporation)是指在高压电脉冲的作用下 使细胞膜上出现微小的孔洞。从而导致不同细胞之间 的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。几乎所 有类型的细胞，包括植物的原生质体、动物的初生细 胞，以及不能用其它方法(诸如磷酸钙或DEAE-葡聚糖 法)转染的细胞，都可以成功地使用电穿孔技术进行基 因转移。此项技术具有操作简便，基因转移效率高等 优点。
病毒转基因技术原理 腺相关病毒
病毒转基因技术原理腺相关病毒
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第一节腺相关病毒简介
l生物学特性 l致病性与免疫性
第一部分生物学特性
l血清型 l病毒结构 l病毒复制 l对理化因素的抵抗力
血清型
lAAV是从腺病毒的污染物1965年、人群或非人灵长类动物等 的组织中分离鉴定到的, l共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株variants， l通过签名PCRsignaturePCR技术,利用高度保守序列扩增Cap 基因的一小段可变区的DNA序列,以筛检是否是新的AAV分离 株,然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap或和Rep基 因的全长序列，在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵 羊、山羊和蛇等的不同组织器官,发现了大量的具有多样性的 AAV的基因组，但新分离的病毒株,尚未进行血清学分型,通称 为变株， lAAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守,与AAV-2 型较为类似,不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异， 50~80%AAV-2抗体在人群中检测出，
第二节腺相关病毒载体 转基因技术原理
l蛋白表达型腺相关病毒载体
―三成分包装系统 ―自我互补型AAV载体self-complementaryAAVvector,scAAV l基―因打反靶式型剪腺接相型关A病AV毒载载体体trans-splicingAAVvector,tsAAV lrA―AV衣的壳纯蛋化和白定修量饰型AAV载体
转基因技术知识（2）
转基因技术知识(2)转基因技术原理转基因技术的原理是将人工分离和修饰过的优质基因，导入到生物体基因组中，从而达到改造生物的目的。
由于导入基因的表达，引起生物体的性状，可遗传的修饰改变，这一技术称之为人工转基因技术(Transgene technology)。
人工转基因技术就是把一个生物体的基因转移到另一个生物体DNA中的生物技术。
具有不确定性。
常用的方法和工具包括显微注射、基因枪、电破法、脂质体等。
转基因最初用于研究基因的功能，即把外源基因导入受体生物体基因组内(一般为模式生物，如拟南芥或斑马鱼等)，观察生物体表现出的性状，达到揭示基因功能的目的。
植物转基因植物是基因组中含有外源基因的植物。
通过原生质体融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程技术获得，改变植物的某些遗传特性，培育优质新品种，或生产外源基因的表达产物，如胰岛素等。
在过去的二十年里，随着分子生物学各领域的不断发展，植物基因的分离、基因工程载体的构建、细胞的基因转化、转化细胞的组织培养、植株再生及外源基因表达的检测等各项技术日趋成熟和完善，有关植物基因工程的研究日新月异，许多以前根本不可能的基因转化工作在越来越多的植物上获得成功。
研究转基因植物的主要目的是提高多肽或工业用酶的产量，改善食品质量，提高农作物对虫害及病原体的抵抗力。
常规的药用蛋白大部分是利用生化的方法提取或微生物发酵获得的，这类活性物质一般在活细胞中含量甚微，且提取过程复杂，成本高，远远满足不了社会的需要。
应用转基因植物来生产这些药用蛋白，包括疫苗、抗体、干扰素等细胞因子，可以利用植物大田栽种的方式大量生产，大幅度降低生产成本，提高产量，还可以获得常规手段无法获得的药物。
利用植物来生产疫苗的最大优点是他可以作为食品直接口服。
通过各种植物转基因技术将多台疫苗基因转入植物，从而得到表达多肽疫苗的转基因植物。
随着抗体基因工程能将抗体基因(从小的活性单位到完整抗体的重、轻链基因)从单抗杂交瘤中分离出来，人们就开始想办法利用转基因植物来表达这些抗体。
病毒转基因技术原理腺相关病毒课件
ITR
ITR中的前125个核苷酸具有回文结 构，其中还存在两个小的内部回文结 构，可自身折叠后经碱基配对、形成T 字形的发夹结构；剩余的20个核苷酸， 保持非配对状态，称为D序列（D sequence）。 ITR中还具有Rep结合元件（Rep binding elements， RBEs) RBE和 RBEˊ ， 以及一个末端解离位点TRS （terminal resolution site）等重要序 列。 ITR是在AAV生物学中重要的顺式
右端的ORF（Cap基因）
由P40启动子指导转录，产生两个转录物，可编码三个病毒衣壳蛋白， 即VP1，VP2和VP3。 这些衣壳蛋白利用共同的ORF ，但转录起始位置不一致。 一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8/10。 构成这些病毒体的衣壳蛋白的比例的差异，最有可能会影响病毒的感染 性，尤其是VP1含量低的情况下。缺乏VP1的病毒体没有感染性。
AAV-3 AAV-4 AAV-5 AAV-6 AAV-7
受体和辅助受体
α2–3/α2–6 N linked SA HSPG, FGFR1, HGFR, integrins, 37/67 kDa LamR HSPG, 37/67 kDa LamR α2–3 O linked SA α2–3 N linked SA, PDGFR HSPG, α2–3/α2–6 N linked SA
AAV的复制周期可以分为两个阶段
AAV成功感染细胞后，依据是否有辅助病毒存 在的情况下：裂解阶段（ lytic stage）和溶原性阶 段（lysogenic stage）
溶原性阶段（lysogenic stage）:在缺乏辅助病毒如AdV、HSV等感染的 情况下，AAV几乎不能复制，基因表达受到抑制，AAV基因组会整合到 染色体q13.4的一个4kb大小的区域（命名为AAVS1），建立潜伏感染
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小鼠的Байду номын сангаас炎链球菌的转化试验
转导(transduction )
现象:“U”型管实验 定义: 分类和应用:普遍性转导
局限性转导
局限性转导
转染 (transfection)
现象: 感染(infection)、病毒感染 定义: 广义和狭义 分类和应用:物理化学方法
生物学方法(病毒载体)
课程背景
1980s, 转基因技术随分子克隆技术出现
2003年，我国SFDA批准了全球第一种基因治疗药物“今 又生”上市。（State Food and Drug Administration） 2005我国SFDA批准了全球第二种基因治疗药物HB101 2009年12月18日出版的《Science》杂志将”return of gene therapy”作为年度重大的科学突破之一。 2012年12月欧盟批准地第三种基因治疗药物上市。 迄今，多达1900种基因治疗临床试验方案并正在进行临床 试验。转基因技术正成为分子医学的一种革命性的技术手段， 并已成为治疗许多遗传性和获得性疾病的潜在希望所在。
研究生高水平课程——《病毒转基因技术原理》
第一章 转基因技术概述
范雄林 86-27-83650639 华中科技大学同济医学院病原生物学系
主要内容
基因转移方式 真核细胞的转基因技术 外源基因表达读框的构建原理
1. 定 义
基因转移（gene transfer）: 自然发生
转基因技术(transgene technology): 人工利用
构建外源基因的基本要素
转录控制元件 翻译控制元件 病毒复制包装信号
复习思考题
影响外源基因进入真核细胞的因素。 物理、化学和病毒载体转基因技术的优缺
点比较。 不同病毒载体转基因技术的优缺点比较。 外源基因表达读框的构建原理。
外源基因转移入真核细胞的类型和方法
病毒颗粒型载体(病毒介导的转基因技术)
假型病毒载体（复制缺陷性病毒载体）：具有感染性 重组型病毒载体：具有感染性
DNA病毒载体：AdV, AAV,HSV-1,etc. RNA病毒载体: HIV, etc. 杂合型病毒载体
不同类型转基因技术方法的优缺点比较
野生型病毒的自然感染、病毒载体转染和质粒经化学法介导的转染
3. 基因转移入真核细胞的方法
基因转移入真核细胞的影响因素 外源基因转移入真核细胞的类型 和方法 构建外源基因的基本要素
基因转移入真核细胞的影响因素
转移入原核细胞的影响因素:
限制-修饰系统 质粒宿主范围和相容性 同源重组与非同源重组
真核与原核细胞具有显著区别; 外源基因要进入真核细胞，要突破三大障碍; 理想的转基因技术方法
外源基因转移入真核细胞的类型和方法
质粒型载体:
物理方法 传统的针头注射
显微注射 粒子轰击 电穿孔 流体动力学 包裹微球 超声
化学方法
磷酸钙法 脂质体法 DEAE-Dxtran法
常用的物理方法介导基因转移
问题
社会公众对健康需求的增加 生命科学和医学研究的推动 对转基因技术的安全和伦理关注持续增加。
课程内容
分为理论课与实践课 转基因技术概述 病毒转基因技术原理、纯化制备技术和医学应用
—DNA病毒 —RNA病毒 —杂合病毒
生物安全 医学伦理问题 表达外源基因的复制缺陷型重组腺病毒的构建和鉴定
2. 常见的基因转移方式
转化(transformation)
转导(transduction )
转染 (transfection)
现象
定义
分类 用途
转化 （transformation ）
现象: 肺炎链球菌的转化试验 定义: 分类和应用:自然转化:感受态,宿主菌种类
人工转化: 低温CaCl2、电穿孔