第六章 抗体的表达
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第六章免疫应答
第六章免疫应答第一节免疫应答的概述免疫应答（immune response）是抗原性物质激发免疫系统发生的一种生理性排异过程，即免疫细胞受抗原刺激后活化、分化及产生免疫效应的过程。
一、免疫应答的类型免疫应答是由多种细胞和分子协同完成的。
根据介导应答的主要免疫细胞及效应机制不同可将其分为T 细胞介导的细胞免疫应答和 B 细胞介导的体液免疫应答。
免疫细胞受抗原刺激后可被诱导活化，表现排异效应，但也可发生特异性不应答现象即免疫耐受（immune tolerance）。
据此将免疫应答分为正免疫应答和负免疫应答。
在生理情况下，机体通过对异己抗原的正应答和对自身组织成分的负应答发挥免疫保护作用，但在异常情况下，无论正应答还是负应答都会使机体发生病理改变。
见表6-1表6-1 免疫应答的类型二、免疫应答的过程免疫应答过程极为复杂。
为叙述方便，人为地将其分为三个阶段即抗原提呈与识别阶段，免疫细胞活化、增殖、分化阶段和效应阶段。
（一）抗原提呈与识别阶段指抗原提呈细胞（APC）提呈抗原和抗原特异性淋巴细胞识别抗原阶段。
在此阶段，APC 通过吞噬、吞饮或受体（IgGFcR 、C3bR）介导的胞吞作用，摄取、处理、加工抗原，使之与MHC 分子结合成抗原肽：MHC 分子复合物，表达于细胞表面，然后由MHC 分子将抗原提呈给T 细胞。
T 细胞通过其表面的抗原受体TCR 识别表达在APC 和靶细胞上的抗原肽：MHC 分子， B 细胞通过其表面受体BCR 识别游离抗原，进而启动活化。
（二）免疫细胞活化、增殖、分化阶段指抗原特异性淋巴细胞受相应抗原刺激后活化、增殖、分化的阶段。
此阶段包括T 、 B 细胞膜受体的交联、活化信号的转导、细胞增殖与分化以及生物活性介质的合成与释放等。
在此阶段，T 、 B 细胞经活化、增殖、分化形成效应细胞即效应（致敏）T 细胞和浆细胞。
也有部分细胞中途停止分化形成记忆细胞（Tm 或Bm）。
记忆细胞遇相同抗原再次刺激后可迅速增殖、分化为效应细胞，发挥效应作用。
抗体PPT课件
C端
骨架区（framework region, FR）
互补决定区
恒定区（constant
region, C区）
(complementarity determining region,
铰链区 (hinge region)
CDR)
7
免疫球蛋白的结构 结构域（功能区）
抗体分子每条多肽链分别由2-5个约 含110个aa折叠形成的球形结构域，具 有不同的生物学功能，又称为功能区。
von Bering Ehrlich & Metchnikoff
Edelman & Poter
Yalow Koler,Milstein & Jerne
Tonegawa
血清治疗 抗体生成、吞噬 抗体分子结构 放射免疫测定 单克隆抗体
Ig基因结构
内容
基本概念 抗体的结构 抗体的多样性和免疫原性 抗体的功能 各类抗体的特性和功能 人工制备抗体
IgA IgM
19
免疫球蛋白的结构
分泌片（secretory piece, SP） 又称分泌成分（secretory component, SC）
IgA 分子辅助成分，含糖肽链，由黏膜上皮细 胞合成和分泌，结合于IgA二聚体上，形成分 泌型IgA（SIgA）。
轻链包括VL和CL两个结构域,重链含有1 个VH和3-4个CH结构域。
免疫球蛋白的结构 ➢结构域（功能区）
(一)重链和轻链 二硫键连接 （Heavy & light chains）
重链（Heavy chain, H链）
根据H链抗原性差异(恒定区氨基酸组成和排列 顺序不同)分为5类(class)：
12
B细胞表位
第六章抗菌感染免疫
定位转移
菌群失调症的分度与转归
Ⅰ度失调--当终止使用抗生素或除去诱因时，菌群能自然恢复正常
`菌群变化 `无临床表现 可逆
Ⅱ度失调--临床表现为腹泻或慢性结肠炎, 纠正较困难
`病理波动 `慢性病 `不可逆
Ⅲ度失调 （二重感染）- 原来菌群几乎消失, 全被外来菌占领,
已成为不可逆损害，严重者引起二重感染如真菌性肠炎、肺炎等
一、 你知道乳酸菌、双岐杆菌酸奶的益处吗？ 乳酸菌、双岐杆菌是国际上承认的有益菌种，酸奶是世界上六大营养品之一，用双岐 杆菌酿制出来的酸奶营养价值是鲜牛奶的数倍，长期喝双岐杆菌酿制的酸奶：让身体年经 10岁，双岐杆菌是最佳的天然活性菌，有高活性的矿物质微元素，使人健康长寿，抑制肠 内腐败菌的繁殖，消除肠道垃圾，调解便秘与腹泻，促进睡眠，固齿，明目、抗肿瘤、排 毒养颜，强壮骨骼，对胃酸、胃胀、口臭、解酒、减肥、糖尿病、痤疮、更年期人群是最 佳的选择，是生活中不可缺少的健康食品。
厌氧菌
胃肠道、口腔、阴道、皮肤是四大菌库
正常菌群拮抗病原菌的作用
将活的鼠伤寒沙门氏菌喂给小鼠，如果要使小鼠 发病死亡，需要10万个细菌； 如果先给小鼠口服链霉素，把小鼠肠道中的正常 菌群都杀死，则只要10个活菌就可置试验鼠于死 地 两者菌量竟相差1万倍，表明正常菌群有拮抗病 原菌作用
乳酸菌、双岐杆菌酸奶的益处
微生态调节剂
（Microecological modulator）
益生菌（Probiotics），又称益生素
• 是有益细菌的活菌制剂，与抗生素(Antibiotics）相反的物质
益生元（Prebiotics）
• 是指能够选择性地促进宿主肠道内有的一种或几种益生菌生 长繁殖，而且不被宿主消化的物质，通过有益菌的繁殖增多， 抑制有害细菌生长
抗体的表达原理
100mg／L左右的表达水平，大肠杆菌体系不能
对表达产物进行糖基化，只能表达抗体分子片
段，但由于其遗传背景清楚，操作简单，成本
低，周期短等优点，亦有较广泛的应用，尤其
在研究领域。
•
酵母细胞和昆虫细胞表达体系具有
一定的糖基化功能，能表达完整抗体分
子，可达到较高表达量 ，其操作及成本
较哺乳动物细脑有一定优势，但在抗体
表达载体含有以下几种基本元件：骨架序列、选 择标志基因、表达盒以及一些特殊的调控序列。 除骨架序列外，其它元件对抗体的高效表达均存 在一定的影响。
载体系统分类
• 根据工程细胞克隆中目的基因拷贝数能否 扩增，表达载体可分为两类：
• A 可扩增表达载体系统。
• B 不可扩增表达的载体系统。
•
有一类特殊的选择标志基因可以在外
配分泌抗体的功能。
•
因此表达的各种抗体具有抗体的功能活性：
由于转染的外源DNA在COS细胞并不整合，而
是以游离形式存在并复制，因此COS细胞最常
用于抗体的瞬时表达。近年来COS细胞己用于
筛选或检测新构建的新型抗体的活性及特征，
也用于研究从噬菌体库中筛选的抗体基因在真
核细胞中表达的功能和特点，还用于各种抗体
• 此外哺乳类动物细胞还拥有完整的转录、 翻译后加工及分泌等机制，包括抗体的糖 基化、羧基化等一系列复杂的加工过程， 因而哺乳动物细胞表达系统表达的抗体通 常具有正确的折叠和空间构象以及正确的 装配，具有良好生物活性，基本近似于天 然抗体。
•
同时哺乳动物细胞还能实现抗体的分
泌性表达，表达产物可分泌至无血清或无
二重组抗体片段的可溶表达由于可溶表达的抗体可能对宿主菌产生毒性因此可溶表达载体应选用严格调控的诱导型启动子来降低本底过强的启动子因为对大肠杆菌的分泌加工能力要求过高而并不能增加分泌表达的产量有时甚至会降低可溶表达的产量诱导的强度和持续时间也会影响产物的正确折叠多数情况下可以利用降低温度来增加可溶表达的产量经验值为2432度
第六章抗体的表达
12
常用的原核表达载体分类及特征
转录载体：用以表达本身带有原核核糖体结合位 点和AUG起始密码子的目的基因T-24（+）和pET-23（+）
体
翻译载体：包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效
核糖体结合位点，用于表达一些不带有核糖体结合
位点的目的基因
pET载体系统为满足不同的需求，生产了带有His·Tag、 T7·Tag、S·Tag、GST·Tag、ompT、CBD S·Tag、 Thioredoxin、DsbA·Tag 、Trx·Tag等标签的融合蛋白，其中带 有S·Tag、His·Tag、T7·Tag的蛋白易于通过蛋白质杂交检测。
11
一种表达体系的核心是表达载体及宿主菌，而表达方法的进步也 主要体现在载体元件的优化和宿主菌基因型的改造上。 理想的原核表达载体应具有以下特征：
（1）稳定的遗传复制和传代能力；
（2）具有显性的转化筛选标记； （3）启动子的转录是可调控的，抑制时本底转录水平较低； （4）启动子转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程 中不影响表达载体的复制； （5）具备适用于外源基因插入的酶切位点，以确保目的基因 按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
第六章抗体的表达
第一节 概述
目前抗体的主要类型： 1、多克隆抗体：通过免疫手段制备。 2、单克隆抗体：通过杂交瘤技术制备。 3、基因工程抗体：包括嵌合抗体、改型抗体等，通过 基因工程手段制备，涉及设计、构建与表达等。
2
3
要想获得全长的抗体分子，就必须选择恰当的抗体表 达系统，而要使所表达的蛋白质结构不具有免疫原性 或避免半衰期过短，就需要使用一个标准的抗体工程 技术生产全人抗体。
大肠杆菌表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物表达系统酵母表达系统存在一些蛋白不能有效地折叠发酵周期较长容易污染需要考虑表达产物的卫生安全性筛选产物价格昂贵有时表达产物没有生物活性等问题都为临床生产和应用带来了不便也存在产物低表达或不表达的问题产物纯化问题依然存外源基因不能持久稳定地表达而且表达成本很高技术背景复杂存在不正确的糖基化修饰且表达量低原核表达系统具有吸引力的原因在于它的成本低生产率高和能够大规模快速的生产等优点第二节原核表达系统原核表达是指通过基因克隆技术将外源目的基因通过构建表达载体并导入表达菌株的方法使其在特定原核生物或细胞内表达
常用的原核表达载体分类及特征
转录载体：用以表达本身带有原核核糖体结合位 点和AUG起始密码子的目的基因T-24（+）和pET-23（+）
体
翻译载体：包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效
核糖体结合位点，用于表达一些不带有核糖体结合
位点的目的基因
pET载体系统为满足不同的需求，生产了带有His·Tag、 T7·Tag、S·Tag、GST·Tag、ompT、CBD S·Tag、 Thioredoxin、DsbA·Tag 、Trx·Tag等标签的融合蛋白，其中带 有S·Tag、His·Tag、T7·Tag的蛋白易于通过蛋白质杂交检测。
11
一种表达体系的核心是表达载体及宿主菌，而表达方法的进步也 主要体现在载体元件的优化和宿主菌基因型的改造上。 理想的原核表达载体应具有以下特征：
（1）稳定的遗传复制和传代能力；
（2）具有显性的转化筛选标记； （3）启动子的转录是可调控的，抑制时本底转录水平较低； （4）启动子转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程 中不影响表达载体的复制； （5）具备适用于外源基因插入的酶切位点，以确保目的基因 按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
第六章抗体的表达
第一节 概述
目前抗体的主要类型： 1、多克隆抗体：通过免疫手段制备。 2、单克隆抗体：通过杂交瘤技术制备。 3、基因工程抗体：包括嵌合抗体、改型抗体等，通过 基因工程手段制备，涉及设计、构建与表达等。
2
3
要想获得全长的抗体分子，就必须选择恰当的抗体表 达系统，而要使所表达的蛋白质结构不具有免疫原性 或避免半衰期过短，就需要使用一个标准的抗体工程 技术生产全人抗体。
大肠杆菌表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物表达系统酵母表达系统存在一些蛋白不能有效地折叠发酵周期较长容易污染需要考虑表达产物的卫生安全性筛选产物价格昂贵有时表达产物没有生物活性等问题都为临床生产和应用带来了不便也存在产物低表达或不表达的问题产物纯化问题依然存外源基因不能持久稳定地表达而且表达成本很高技术背景复杂存在不正确的糖基化修饰且表达量低原核表达系统具有吸引力的原因在于它的成本低生产率高和能够大规模快速的生产等优点第二节原核表达系统原核表达是指通过基因克隆技术将外源目的基因通过构建表达载体并导入表达菌株的方法使其在特定原核生物或细胞内表达
体液免疫
T细胞对B细胞的辅助作用
信号2 T细胞辅助
CD40
B
信号1 抗原－BCR
MHCII
Th Th
1. TCR 2. CD4 3.CD40 L
Y
细胞的协同作用
（一）APC与Th细胞相互作用 1.两个刺激信号
2.主要的细胞表面协同刺激分子
（1）B7：B7.1和B7.2（主要表达细胞 — B细胞） 配体：CD28和CTLA-4（表达细胞：CD28 — T细胞、CTLA-4 —活化的T细胞） 主要功能：B7/CD28 — 活化T细胞； B7/CTLA-4 —抑制T细胞活化。
4.初次应答与再次应答的概念与特点。
练习
1、何为免疫应答？ 2、初次体液免疫应答与再次体液免疫应答效 果有何差别？ 3、体液免疫应答分为哪几个阶段？ 4、体液免疫应答的效应有哪些？
（二）抗原刺激反应顺序分类: • 初次应答 • 再次应答
体液免疫应答
参与的细胞: 1、单核吞噬细胞系 抗原的摄取与提呈 2、T细胞 识别抗原，辅助B细胞产生抗体 3、B细胞 识别抗原，递呈抗原，产生抗体 抗原的分类 1、TI-Ag（非胸腺依赖抗原）
2、TD-Ag（胸腺依赖抗原）
体液免疫应答的过程 一、 抗原识别阶段 （一） TI抗原的识别：
三、 免疫效应阶段
（一）、B细胞对TI-Ag和TD-Ag应答的区别 TI-1、TI-2和TD抗原体液免疫应答的区别 活化B细胞 类别转换和 亲和力成熟 TI-1抗原 B1和B2， 多克隆 无 TI-2抗原 B1， 寡克隆 少数有 TD抗原 B2 有
记忆B细胞
T细胞辅助
无
个别有
有
-
-
+
（二）、Ig类转换
（ 二）对TD-Ag识别与提呈
抗体PPT课件
这个区域的氨基酸排列顺序随抗体特异性不同而有所变化。
恒定区（constant region,C）
其氨基酸数量、种类、排列顺序及含糖量都比较稳定。
江西农业大学动科院预防兽医学 谌南辉
免疫球蛋白的水解片段
木瓜蛋白酶水解IgG 得到两个相同的Fab段和一个Fc段。
胃蛋白酶裂解IgG 得到一个具有双价活性的F（ab’）2段和若干个小 分子多肽碎片（pFc’）
重链 H链 轻链 L链 可变区 V区 恒定区 C区
江西农业大学动科院预防兽医学 谌南辉
免疫球蛋白的基本结构
重链
由420-446个氨基酸残基组成，两条H链之间通过二硫键及非 共价键的亲水和疏水作用力相结合。
轻链
由210-230个氨基酸残基组成，其C端靠二硫键与H链结合。
可变区（variable region,V）
比 较 不 同 抗 体 V 区 的 氨 基 酸 序 列 ， 发 现 VH 和 VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变 化，这些区域称为高变区。三个高变区共同组成Ig 的抗原结合部位，该部位也称为互补性决定区。
江西农业大学动科院预防兽医学 谌南辉
抗体 抗原结合部
抗原 决定簇
抗原决定簇 表位
抗原结合部位 （红色部位表示抗原表位）
papain respectively.
江西农业大学动科院预防兽医学 谌南辉
江西农业大学动科院预防兽医学 谌南辉
免疫球蛋白的水解片段 的功能意义
抗体重要功能性片段 Fab、Fc。
Fa（b—fra—Fgamb—ent抗名an体称tig由识en来别b是in抗d因in为原g）具决；有定抗簇原结的合触的角功能
Fc 则是因为原先发现该片段很快能结晶
Fc（—fra—gm—en决t c定rys抗tal体iza清ble除）。抗这原部的分打介导击抗方体式的
恒定区（constant region,C）
其氨基酸数量、种类、排列顺序及含糖量都比较稳定。
江西农业大学动科院预防兽医学 谌南辉
免疫球蛋白的水解片段
木瓜蛋白酶水解IgG 得到两个相同的Fab段和一个Fc段。
胃蛋白酶裂解IgG 得到一个具有双价活性的F（ab’）2段和若干个小 分子多肽碎片（pFc’）
重链 H链 轻链 L链 可变区 V区 恒定区 C区
江西农业大学动科院预防兽医学 谌南辉
免疫球蛋白的基本结构
重链
由420-446个氨基酸残基组成，两条H链之间通过二硫键及非 共价键的亲水和疏水作用力相结合。
轻链
由210-230个氨基酸残基组成，其C端靠二硫键与H链结合。
可变区（variable region,V）
比 较 不 同 抗 体 V 区 的 氨 基 酸 序 列 ， 发 现 VH 和 VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变 化，这些区域称为高变区。三个高变区共同组成Ig 的抗原结合部位，该部位也称为互补性决定区。
江西农业大学动科院预防兽医学 谌南辉
抗体 抗原结合部
抗原 决定簇
抗原决定簇 表位
抗原结合部位 （红色部位表示抗原表位）
papain respectively.
江西农业大学动科院预防兽医学 谌南辉
江西农业大学动科院预防兽医学 谌南辉
免疫球蛋白的水解片段 的功能意义
抗体重要功能性片段 Fab、Fc。
Fa（b—fra—Fgamb—ent抗名an体称tig由识en来别b是in抗d因in为原g）具决；有定抗簇原结的合触的角功能
Fc 则是因为原先发现该片段很快能结晶
Fc（—fra—gm—en决t c定rys抗tal体iza清ble除）。抗这原部的分打介导击抗方体式的
医学免疫学 第六章？抗体
IgM
分泌型IgA
SP
IgM和分泌型IgA结构示意图
浆细胞
血清型IgA
入血
分泌型IgA
二聚体
分泌型IgA
分泌型IgA的生成和分泌过程示意图
第二节 免疫球蛋白的类型
免疫球蛋白
——可具有抗体活性，与相应抗原决定簇特异性结合。
——抗原物质，本身作为大分子糖蛋白，对异种动物或同种
异体，甚至体内其他B细胞来说又是一种抗原。 根据其抗原特异性，Ig分为三类:
酸的差异。是由不同个体的遗传基因决定，又称
同种异型遗传标志。
独特型
3.独特型（idiotype）：
是指在同一个体内，不同B细胞克隆所产生的免疫
球蛋白分子V区以及T、B细胞表面抗原受体V区所具 有的特有的氨基酸序列和 构型决定。人体体内具有数目庞大的不同的独特型 决定簇。在一定条件下，可刺激机体产生抗独特型 抗体。
型：根据免疫球蛋白轻链C区抗原特异性的不同，
可分为κ型和λ型。
人L链的κ型：λ型约为2：1（小鼠则为20：1）
亚型：λ链 可分为λ1， λ2 ，λ3，λ4四个亚型。
同种异型
2.同种异型（allotype）： 是指同一种属不同个体之间其免疫球蛋白分子所 具有的不同抗原特异性。
主要反映在Ig分子的CH和CL上的一个或数个氨基
免疫球蛋白的类型 免疫球蛋白的基因结构及其表达 抗体的功能 各类免疫球蛋白的特性和功能
单克隆抗体和基因工程抗体
第一节 免疫球蛋白的结构
一、免疫球蛋白的基本结构：
1. 四肽链结构： 2条重链(Heavy chian,H链) 2条轻链（Light chian,L链） 通过二硫键连接成“Y”形结构 组成一个Ig的单体分子。
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pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、 Thrombin pGEX-4T-2、pGEX-4T-3 pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX- Factor Xa 5X-3 pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3 PreScission
17
pGEX-4T-1载体图谱
26
利用植物表达外源蛋白的优点： 植物繁殖能力强，可以利用愈伤组织或原生质体连续培养； 可以把外源DNA整合到基因组中获得转基因植株； 一旦获得某重组抗体的转化株，要提高其产量只是农艺性 状改良问题； 能有效地组装轻链和全长重链，形成完整的抗体分子。
27
28
7
大肠杆菌表达系统
蛋 白 表 达 系 统
原核表达系统具有吸引力的原因在于它的成 本低、生产率高和能够大规模快速的生产等 优点
昆虫细胞表达系统
存在不正确的糖基化修饰，且表达量低
真 核 表 哺乳动物表达系统 达 系 统 酵母表达系统
外源基因不能持久稳定地表达，而且表达成本 很高，技术背景复杂 存在一些蛋白不能有效地折叠，发酵周期较长， 容易污染，需要考虑表达产物的卫生安全性，筛 选产物价格昂贵，有时表达产物没有生物活性等 问题都为临床生产和应用带来了不便，也存在产 物低表达或不表达的问题，产物纯化问题依然存 在
8
第二节 原核表达系统
原核表达是指通过基因克隆技术，将外源目的 基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使
其在特定原核生物或细胞内表达。人们为了获得高水
平的基因表达产物，通过综合考虑控制转录、翻译、 蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，设计 出了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同 性质、不同要求的目的基因的需要。
始密码子和S-D序列。
10
原核表达系统主要有大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表
达系统、链霉素表达系统以及枯草杆菌和蓝细菌表达 系统等。 大肠杆菌遗传背景清楚，遗传图谱明确，生物化学与 分子生物学充分了解，目的意淫表达产量高，生产成
本低，周期短等，因此仍是表达异源性蛋白质的首选
表达系统。 受大肠杆菌自身加工能力的限制，不适合表达完整的 抗体分子，多用来选择性表达Fab或scFV等抗体片段。
9
原核细胞表达系统基因表达的主要特点是：
1、原核生物只有一种RNA酶，识别原核细胞启动子，催
化所有RNA的合成，且其基因表达是以操纵子为单位。 2、转录和翻译是耦联的，连续进行。 3、缺乏真核细胞转录后的加工系统，不能去除内含子。 4、原核细胞的基因控制主要在转录水平。
5、在大肠杆菌mRNA核糖体结合位点上，有一个转录起
11
一种表达体系的核心是表达载体及宿主菌，而表达方法的进步也
主要体现在载体元件的优化和宿主菌基因型的改造上。
理想的原核表达载体应具有以下特征：
（1）稳定的遗传复制和传代能力；
（2）具有显性的转化筛选标记； （3）启动子的转录是可调控的，抑制时本底转录水平较低； （4）启动子转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程 中不影响表达载体的复制； （5）具备适用于外源基因插入的酶切位点，以确保目的基因 按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
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抗体蛋白质在大肠杆菌中的表达方式：
1、融合型表达 优点：大大提高转运蛋白的溶解性，增加表达系统的稳定性， 提高中间蛋白的折叠性，减少被降解的机会，从而增加融合蛋 白在包涵体内的表达量。 不足：让中间蛋白复性需要昂贵的蛋白酶；裂解不完全会导致 产物减少；要获得有活性的蛋白，需要很多步骤才能完成；融 合蛋白的可溶性难以保证。 2、分泌型表达 在载体中引入合适的引导肽序列，可以将抗体片段引导向胞周 空间，允许抗体片段发生折叠、二硫键形成等。用这种方式生 产的抗体片段具有与完整抗体类似的亲和常数，也有利于蛋白 的富集和进一步纯化。
学活性时间即抗体的半衰期，那么就需要选择全抗体，
需要利用培养的动物细胞或转基因动物来表达。
6
原核表达系统操作简单、成本低、周期短，应用最为 广泛，但不能对表达产物进行糖基化，且细菌类毒素 污染很难去除。重组的蛋白常以包涵体形式分泌，要 在体外折叠，费时费力，这使得大规模生产抗体受到 限制。 真核表达系统是最接近天然产生抗体的表达系统，比 较成熟且应用较多。主要用于表达完整抗体分子，已 可达到100mg/L的表达水平。但真核细胞培养有难 度，需要附加设备，需要去除癌基因序列，防止病毒 污染等。
法等理化方法及病毒感染等。
抗体在哺乳动物细胞表达系统中表达的一般操作过程： 克隆目的抗体基因（经测序验证）-准备真核表达载体-将目的
抗体基因插入表达载体中-转染-筛选-验证（PCR鉴定外源基因、
免疫印迹鉴定蛋白表达、测定scFV基因对受体细胞增殖的影响）
24
昆虫细胞表达系统：能利用信号肽将外源基因分泌到胞 外，而且能有效地进行蛋白质翻译后的加工与修饰。最常 用的是杆状病毒介导的表达系统，杆状病毒属环状双链 DNA 病毒，具有严格宿主专一性，通常感染无脊椎动物。 该系统最大的优点是蛋白表达水平高（ 1-500mg/L 昆虫 细胞培养液），但对培养基的营养要求高，要求掌握熟练 的细胞培养技术。
19
抗体原核表达的一般操作过程：
获得目的抗体基因：PCR或RT-PCR 制备表达载体：选择表达载体要根据所表达蛋白的最终应用， 如为方便纯化，可选融合表达，如为获得天然蛋白，可选择 非融合表达。 将目的抗体基因插入表达载体中（测序验证：插入方向和可 读框应都正确） 转化表达宿主菌：抗性筛选或蓝白斑筛选 诱导靶蛋白的表达 表达蛋白的分析 纯化和进一步检测
第六章 抗体的表达
1
第一节 概述
目前抗体的主要类型： 1、多克隆抗体：通过免疫手段制备。
2、单克隆抗体：通过杂交瘤技术制备。
3、基因工程抗体：包括嵌合抗体、改型抗体等，通过 基因工程手段制备，涉及设计、构建与表达等。
2
3
要想获得全长的抗体分子，就必须选择恰当的抗体表 达系统，而要使所表达的蛋白质结构不具有免疫原性 或避免半衰期过短，就需要使用一个标准的抗体工程 技术生产全人抗体。 在抗体表达过程中，选择一种合适的表达系统，要考 虑多种因素的影响，包括抗体的结构、糖基化作用以 及表达抗体的产量、纯化的难易度和生产成本等。 目前用于抗体表达的系统有原核表达系统和真核表达 系统两大类。
22
一般操作步骤： 目的基因克隆 重组载体线性化 转化 筛选 外源蛋白的表达 鉴定 放大
23
哺乳动物细胞表达系统优缺点：表达的外源蛋白最接近其天
然构象，在蛋白合成起始信号、加工、分泌、糖基化方面具 有独特优势，但在大规模培养时细胞会面临着对无血清培养 基的适应性差、细胞无限度增殖以及细胞凋亡等难题。 外源基因导入的方法：脂质体、磷酸钙、电穿孔及显微注射
4
5
表达系统的选择主要取决于表达抗体的用途和抗体的 产量，而产量影响着抗体的经济效益。
如果表达的抗体属于小分子片段，无需抗体效应作用
和药物动力学活性，选用细菌表达系统就足够了。如 scFv渗透性好，免疫原性弱，可以很快从血液中清除 掉，常用与放射免疫检测和肿瘤的原位治疗。 如果表达的抗体用于治疗，需要延长抗体的药物动力
PET
pET-21（+）、pET-24（+）和pET-23（+） 翻译载体：包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效 核糖体结合位点，用于表达一些不带有核糖体结合 位点的目的基因
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pET 28a载体图谱
14pCold 系列表源自载体Qing 等人利用冷休克基因cspA 启动子开发了一系 列独特性的冷休克表达载体。cspA基因是当温度突然降 低时，原核生物和真核生物都会表现出冷激反应，它们会 通过合成冷激蛋白来克服冷激的不利影响。在低温下表达 重组蛋白使大肠杆菌自身蛋白质合成受到抑制，促进目的 蛋白正确折叠和提高蛋白可溶性。
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第三节 真核表达系统
真核表达系统主要包括哺乳动物表达系统、昆虫表达 系统以及酵母表达系统。 真核生物基因组的特点： 1、比原核基因组大得多； 2、真核生物主要遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹 在核膜内，核外还有遗传成分，增加了基因表达调控的层 次和复杂性； 3、真核基因组为二倍体，原核基本为单倍体； 4、真核生物mRNA为单顺反子，而许多活性蛋白是由相同 或不同的多肽形成的亚基构成。 5、哺乳动物基因组中仅约10%的序列为蛋白质； 6、真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即 有外显子和内含子，转录后需经剪接去除内含子； 7、哺乳动物基因组中存在大量重复序列。
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pGEX系列表达载体
• 1987年，澳大利亚的smith和Johnson构建了表达融合 蛋白的载体pGEX。pGEX系列表达载体就是采用GST作 为载体的标签。它作为标签的好处在于它是一个高度可溶 的蛋白，希望通过它提高蛋白的可溶性；另一个原因是它 可以在大肠杆菌中大量表达。
载体名称 识别切割GST标签的酶
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酵母表达系统的优点： 1、具有强有力的乙醇氧化酶基因启动子，可严格调控外源 蛋白的表达； 2、可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，从而使表 达的蛋白具有活性； 3、营养要求低，生长快，培养基廉价，易于操作和培养， 亦有利于工业放大生产； 4、表达量高，许多蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达量可达 到g/L以上水平； 5、表达的蛋白既可存在于胞内，也可分泌到胞外。 6、糖基化程度低； 7、外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上， 这样得到的基因工程菌株比较稳定。
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常用的原核表达载体分类及特征
转录载体：用以表达本身带有原核核糖体结合位 点和AUG起始密码子的目的基因
载 体
pET载体系统为满足不同的需求，生产了带有His〃Tag、 T7〃Tag、S〃Tag、GST〃Tag、ompT、CBD S〃Tag、 Thioredoxin、DsbA〃Tag 、Trx〃Tag等标签的融合蛋白，其中带 有S〃Tag、His〃Tag、T7〃Tag的蛋白易于通过蛋白质杂交检测。