条件性基因敲除与敲入

loxP转基因动物的构建




loxP转基因动物是在基因组中待修饰基因区域的两侧各插入了1个loxP 位点的转基因动物。该转基因动物的构建首先需要一种特殊的载体， 这种载体主要由3个部分组成： ①分别存在于打靶载体5 ’和3’臂端，是与靶基因一定区域相同的同源序 列，其作用是介导打靶载体与靶基因之间的同源重组。 ②位于5’和3’臂端之间有待敲除的靶基因区段序列或有待敲入的外源序 列和选择标志基因。选择标志基因一般为neo—tk基因，含有两个选择 标志：一个为G418抗性基因(neo)，为细胞提供针对G418的抗性，为 正筛选标记；另一个为胸腺嘧啶激酶基因(tk)，可以把培养基中的更昔 洛韦(ganciclovir)磷酸化为对细胞有毒的化合物，为细胞提供负筛选标 记。 ③3个loxP位点，分别位于待敲除靶基因同源序列的两侧和选择标志基 因的两侧。 一般采用线性化的打靶载体来转染胚胎干细胞，常选用位于同源序列 边缘或之外的限制性内切酶作用位点作为打靶载体线性化的切点。取 代型打靶载体整合进基因组的结果是靶载体中的序列臵换掉基因组中 的同源序列。

经典的基因敲除的具体实施方法可以简述如下： 选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片 段，通过分子生物学方法使其产生突变，然后 与相应的载体进行重组，成为靶载体。分离试 验动物的胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导 入到胚胎干细胞内，使其与细胞内相似或相同 的序列进行同源重组，替代细胞内原来的基因。 通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细 胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理的 囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其发育 成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌 合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后，通 过筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。

通过上述方法所获得的基因敲除小鼠模型，其身体的各种 组织、器官以及小鼠生存的各个时期都携带有突变基因， 相应基因的功能也发生了变化。这是一种非常经典的基因 敲除方法，该方法对阐明某些基因的功能做出了十分重要 的贡献。但是，对于某些特殊的基因，该方法往往显得无 能为力，这些基因在胚胎发育过程中或者在成熟生物体内 具有至关重要的功能。当这些基因突变后，胚胎往往不能 发育至正常分娩，或者即使能够出生也会因为过于严重的 生理缺陷而过早夭亡，无法开展后续研究，或者这些基因 突变后影响到实验动物的繁殖功能而不能产生后代，进而 不能获得携带突变基因的纯合子动物模型。针对上述问题， 近年来出现了一种特殊的基因敲除或敲入方法，被称为条 件性基因敲除或敲入(conditional gene knock out or knock in)。这种方法是指在特定的组织细胞或者细胞发育的特 定阶段敲除某一特定基因的实验技术。其优势在于克服了 经典基因敲除手段所遇到的上述问题，对于在特定的组织 细胞和(或)特定的时间研究特定基因的功能，以及更好地 建立人类疾病的动物模型都具有十分重要的意义。
2．Cre/loxP系统优点




Cre/loxP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用， 是由该系统的诸多优点决定的： ①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后， 可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系 统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子； ②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成； ③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物 体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用； ④Cre重组酶的编码基因可以臵于任何一种启动子的调控 之下，从而使这种重组进而 发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一 点。



第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞注射或者胚胎 干细胞技术获得，在这只小鼠中，Cre重组酶被臵于 某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定 的条件下表达。 最后，让这两只小鼠进行交配，产生的同时含有上 述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细 胞中缺失某一特定的基因。 很明显，在何种组织细胞或器官中敲除某一特定的 基因取决于所选择的启动子。只要选择合适的启动 子调控Cre重组酶的表达，使其在生物体特定的部位、 特定的条件下产生，就可以实现相应条件下某一特 定基因的敲除。

loxP转基因动物的构建一般采用胚胎干细胞基因转 移法。在这个过程中，首先要构建具有3个loxP位点 的打靶载体。该载体中loxP位点的分布情况如下： 选择标志基因(如neo—tk)的两侧各一个，从而能够 使选择标志基因在Cre的介导下消失，以避免它们在 基因组中的存在可能给转基因动物造成危害；预期 要进行敲除的基因两侧各一个，在Cre的作用下可以 介导目标基因的敲除。在载体构建成功后，用电穿 孔等方法将其导入到胚胎干细胞中，使其以同源重 组的方式整合进干细胞的基因组，之后经G418筛选， 用PCR和DNA印迹(Southern blotting)等方法来确定 靶基因是否发生了同源重组。最后，为了去除筛选 标志基因，要向上述的胚胎干细胞中导人Cre的瞬时 表达质粒。这时，在Cre的作用下，具有3个loxP位 点的靶基因区域会产生3种后果：
受精卵雄性原核显微注射法构建Cre 转基因动物


Cre转基因动物即时空特异性表达重组酶Cre的转基 因动物。构建此动物的目的在于为loxP转基因动物 提供重组酶Cre。由于在该转基因动物中Cre的表达 被臵于特异性启动子的调控之下，因此它会以组织 细胞特异性和发育阶段特异性的方式向loxP转基因 动物提供Cre重组酶，以便在特定的发育阶段、特定 的组织细胞中使两个loxP之间的区域缺失。当然， 实现此目标的最后方法就是让这两种转基因动物进 行杂交。 构建Cre转基因动物与构建普通转基因动物的方法相 似，最为常用的基因转移方法仍为受精卵雄性原核 显微注射法和胚胎干细胞的囊胚注射法。
3．Cre/loxP系统的工作流程

利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件 下的敲除，需要两只转基因小鼠。 第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在 体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位 点的基因序列，之后将体外构建好的这段基因序列 转入胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基 因组内原来的基因序列。经过这样处理的胚胎干细 胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育 成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。 在这只转基因小鼠中，loxP位点被引入到相应基因 的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影 响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。

loxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌 体，是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的 8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定 了loxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与 DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的 结合域。其序列如下：

Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组是一个动 态、可逆的过程，可以分成三种情况： 1、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，且方 向相同，Cre重组酶能有效切除两个loxP位点间 的序列； 2、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，但方 向相反，Cre重组酶能导致两个loxP位点间的序 列倒位； 3、如果两个loxP位点分别位于两条不同的DNA 链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换 或染色体易位。

迄今为止，研究者们已经成功地利用多个不同 的启动子实现了在不同条件下的基因敲除，这 些启动子可以是细胞类型特异的，如lck启动子 (胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(眼晶 状体)、钙调素依赖性激酶Ⅱ启动子(海马和大 脑新皮质)、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、aP2 启动子(脂肪组织)、AQP2启动子(肾脏集合管) 和肌浆蛋白启动子(骨骼肌)等。启动子也可以 受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的 基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功 能的异常所产生的副作用，如干扰素反应Mxl 启动子、他莫西酚依赖的雌激素突变体启动子 和四环素调节系统等。




①发生Ⅰ型缺失，3个loxP之间的所有基因(靶基因 和选择标志基因)全部被切除，只保留1个loxP位点。 ②发生Ⅱ型缺失，只有选择标志基因被切除，两个 loxP位点及其之间的靶基因被保留。发生了Ⅰ或Ⅱ 型缺失的胚胎干细胞在更昔洛韦选择培养下均能生 长，再用PCR和DNA印迹等方法来对缺失突变的结 果进行鉴定。 ③Ⅲ型缺失，靶基因被切除而选择标志基因被保留， 发生此型突变的细胞在更昔洛韦存在时无法生存。 经过更昔洛韦培养基筛选后，可以筛选出发生Ⅱ型 缺失的胚胎干细胞。再用囊胚注射法将经过这种遗 传改造的胚胎干细胞注入囊胚，最后移植入代孕母 鼠的子宫内，获得具有Ⅱ型缺失突变的转基因动物， 在其基因组中特定的基因位臵具有两个loxP位点。








先将Cre时空特异表达载体线性化后注入雄性原核，使其以随机插入的 方式整合进基因组，然后将该受精卵或早期胚胎植人到假孕母鼠的输 卵管或子宫内。受精卵雄性原核显微注射法的具体步骤简述如下： 1．准备假孕母鼠 将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，刺激 雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 2．受精卵的准备 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素(HCG)， 以促使其超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精 卵备用。 3．基因导入 用显微注射装臵将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内。 4．胚胎移植 将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内， 使胚胎在养母体内发育成熟。 5．对幼鼠的鉴定 (1)幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴 定外源基因是否整合。 (2)建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代 后，后代有50％概率带有整合的基因供实验用。也可将合适的组织进 行细胞培养，建立细胞系。 (3)自小鼠内脏提取RNA，与目的基因探针做分子杂交，以鉴定外源基 因的表达和表达的组织特异性。表达产物可以测定活性的，也可直接 自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验 (ELISA)或放射免疫测定(RIA)等。亦可取胚胎进行分析。