淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究和酶的纯化
高产淀粉酶菌株筛选
高产淀粉酶菌株筛选淀粉酶是一种以淀粉为底物的酶，可以将淀粉水解为糊精、糊精、麦芽糊精等多种低聚糖。
淀粉酶在食品工业、酿造工业、纺织工业等领域有广泛的应用。
在淀粉酶生产过程中，高产酶菌株的选育十分重要。
本篇文章将介绍高产淀粉酶菌株筛选的相关知识和方法。
1. 筛选菌种在高产淀粉酶菌株筛选中，首先要选取一种基础菌株，并在培养基中加入抑制其他细菌生长的抗生素，以防止其它外来细菌的污染。
另外，为了避免淀粉酶活性的干扰，还需要在培养基中加入淀粉水解产物。
2. 筛选培养基淀粉酶生产的细菌在不同类型的培养基中的生长情况也不同。
因此，在高产淀粉酶菌株筛选中，需要尝试不同成分和配比的培养基，找到最优的培养基。
3. 筛选条件在高产淀粉酶菌株筛选中，不同的发酵条件都会影响细菌的生长和淀粉酶的产生。
例如 pH 值、温度、搅拌速度、氧气供应等。
因此，需要优化发酵条件，使其最大化淀粉酶产量。
4. 淀粉酶活性测定确定淀粉酶的活性对于筛选高产淀粉酶菌株十分重要。
一般采用碘液滴定或 Fehling 精制法来测定淀粉酶活性，选择最高活性的菌株作为高产淀粉酶菌株。
微生物菌株的选择是筛选高产淀粉酶菌株的核心工作，可通过筛选自然环境中的菌株，或采用一些基因工程技术筛选出高产酶活的工业微生物菌株。
淀粉酶检测方法是评估筛选结果的一个关键步骤，目前主要有碘液滴定和Fehling 精制法两种方法，需要选择准确、温和、操作简便的方法测定淀粉酶活性。
高产淀粉酶菌株筛选的研究具有广泛的应用前景。
目前，在食品工业、酿造工业、制糖工业、制药工业、纺织工业等领域已经取得了较为显著的应用效果。
高产淀粉酶菌株的筛选研究不仅是实现淀粉酶生产工艺的自动化，还能生产高附加值的淀粉水解产品，提高资源利用效率。
总之，无论是在工业生产还是在科学研究方面，高产淀粉酶菌株筛选都扮演着重要的角色。
通过优化菌株选型，调整培养基成分和发酵条件，以及采用高效、准确的淀粉酶检测方法，可获得高产且高效的淀粉酶制剂，为产业生产和科学研究做出贡献。
产淀粉酶菌株的分离与提纯
产淀粉酶菌株的分离与提纯摘要：淀粉酶是一种广泛应用于食品、饲料和生物能源领域的酶类。
本研究旨在从土壤样品中分离出产淀粉酶的菌株，并通过营养物质筛选和鉴定，最终获得高活性的产淀粉酶菌株。
分离出的菌株经过形态学、生化和分子生物学鉴定，最终确定为放线菌属。
通过筛选和优化培养基组成、培养条件、发酵时间等参数，获得了产淀粉酶的高产菌株，其中最高淀粉酶活性达到406.2 U/mL。
随后通过离子交换层析、凝胶过滤层析和手性分离层析等技术，对产淀粉酶菌株进行了纯化，纯化后的淀粉酶总回收率为78.5%。
本研究拓展了淀粉酶菌株的来源渠道，并提供了一种有效的产淀粉酶筛选和提纯技术。
关键词：淀粉酶；菌株分离；筛选；纯化Introduction淀粉酶是一种用来加快淀粉转化为葡萄糖片段的酶类，广泛应用于食品、饲料、纺织、造纸、医药、生物能源等领域。
因此，发现新的产淀粉酶的菌株和提高淀粉酶的产量和纯化度具有很大的应用前景和经济价值。
本研究旨在从土壤样品中分离出产淀粉酶的菌株，并通过筛选和鉴定，最终获得高活性的产淀粉酶菌株。
随后，通过离子交换层析、凝胶过滤层析和手性分离层析等技术，对产淀粉酶菌株进行了纯化。
Materials and methods样品采集从不同区域的土壤样品中采集10 g土样，放入消毒的密闭容器中，避免阳光直射和高温。
待采集完毕后立即运回实验室处理。
淀粉酶活性测定淀粉酶活性采用Miller方法测定，在37℃下反应15 min后，以0.01mol/L NaOH终止反应，读取吸收度A450。
反应体系为：淀粉溶液 1 mL、哌嗪酸盐缓冲液1 mL、酶液1 mL。
菌株分离取0.1 g土样加入0.9mL 生理盐水中，混合搅拌均匀后，依次向1.5%的琼脂糖和分别选用Luria-Bertani、Potato Dextrose Agar和Starch Agar培养基进行分离，待培养基表面形成菌落后进行传代培养。
通过形态学、生化和分子生物学鉴定，确定产淀粉酶菌株。
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。
但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。
本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。
二、分离及纯化1、材料试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等器皿：移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱其他：报纸、纱布、棉花、面线绳2、方法2.1培养基与器皿的准备和灭菌（1）培养基的配制称量1.2克淀粉。
加少量水加热溶化，然后加入6.8克营养琼脂，加水至150毫升，煮沸后倒入250ml容量的三角瓶中，加棉塞后放入高温蒸汽灭菌锅内灭菌备用。
（2）无菌水的制备分别取9ml蒸馏水加入5支试管中，加塞后用报纸包扎捆绑，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。
取90ml蒸馏水加入250ml三角瓶中，同样的操作，灭菌备用。
（3）器皿的准备将刻度吸管用报纸包扎，培养皿装入专用灭菌杯分别放入高温灭菌箱灭菌备用。
2.2菌悬液的制备和梯度稀释取10g土壤样品加入90ml无菌水中震荡, 然后静置2分钟。
取六只试管编号1—6分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml 上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作六个试管，得到10ˉ1—10ˉ6六个稀释度的菌悬液。
土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。
3．掌握分离纯化微生物的方法。
4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。
二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。
高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。
3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。
2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。
a-淀粉酶的生产工艺
a-淀粉酶的生产工艺
淀粉酶是一类能够水解淀粉并将其转化为糖类的酶。
它广泛用于食品、饲料、纸浆、
发酵等行业中。
1. 酶菌的选育和培养
淀粉酶可由多种细菌、真菌和原生动物合成，其中最常用的是泌秀菌和枯草芽孢杆菌。
选用高产菌株和适合生产的菌株进行发酵，产生高效淀粉酶。
2. 发酵工艺
发酵工艺是淀粉酶生产的关键步骤。
其主要过程是菌种培养、接种、发酵、分离等。
泌秀菌的发酵条件为温度35℃-42℃，pH为6.0-7.0，培养液中含有可溶性淀粉、氮源、
矿物质以及适量的辅助物质，如表面活性剂等。
枯草芽孢杆菌的发酵条件为温度37℃-55℃，pH为6.5-7.5，培养液中含有可溶性淀粉、氮源和矿物质等。
3. 酶液的提取和纯化
对发酵液进行酶液的提取和纯化，可以采用离心、过滤、超滤、稳态层析等方法。
离
心可将大颗粒杂质和沉淀物去除。
过滤和超滤可去除小颗粒杂质和未溶解物质。
稳态层析
能够去除其他蛋白质等酶外蛋白。
为增强淀粉酶的稳定性，可以将其进行稳定化处理。
稳定化的方法包括添加保护剂、
离子交换、交联、酯化等。
保存时，应避免酶液暴露在空气中、光照下或高温中。
一般情
况下，淀粉酶的保存温度应低于0℃。
总之，淀粉酶的生产工艺涵盖了选育和培养酶菌、发酵、酶液的提取和纯化、稳定化
和保存等多个环节。
只有采取稳定的生产工艺和高效的酶菌，才能获得高质量的淀粉酶产品。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案产淀粉酶菌株的筛选是一项重要的研究工作，它可以满足很多工业和农业领域的需求。
下面是一个设计方案，包含步骤、实验条件和分析方法。
1.步骤（1）菌株的收集和培养首先，需要收集不同环境中的样品，如土壤、水体、植物表面等。
将样品分离培养在富含淀粉的琼脂培养基中。
培养过程中，需保持适宜的温度（通常在30℃左右）和适宜的pH（通常为6-7）。
（2）淀粉酶活性筛选将分离培养基中的菌株进行淀粉酶活性筛选。
取一小部分菌株涂抹到含有淀粉的琼脂培养基上，培养一段时间后在培养皿上观察是否产生明显的透明圈。
透明圈的出现表示淀粉酶活性较高的菌株。
（3）淀粉酶活性检测和比较从产生透明圈的培养皿中挑取具有高活性的菌落，进行淀粉酶活性检测。
可采用碘液滴加法，在含淀粉的琼脂培养基上，滴上一滴碘液，观察出现的蓝色溶解圈的明暗程度，可以初步评估淀粉酶活性的强弱。
（4）纯化和鉴定筛选出具有较高淀粉酶活性的菌株后，通过纯化和鉴定，进一步确定其产淀粉酶的能力以及体外条件如温度和pH对淀粉酶活性的影响。
可采用离心、柱层析等技术对菌株进行纯化。
通过测量在不同条件下的淀粉酶活性，确定最适宜的条件。
2.实验条件（1）培养条件：温度为30℃，pH为6-7（2）培养基：含淀粉和琼脂的培养基。
（3）检测条件：培养基含有淀粉，通过碘液滴加法观察形成的蓝色溶解圈明暗程度。
3.分析方法（1）测量淀粉酶活性采用I2-KI法测定淀粉酶活性。
将一定量的菌株培养液加入含淀粉的缓冲液中，反应一段时间后，加入碘液和KI溶液，混匀后通过测量吸光度来确定淀粉转化的程度。
（2）蛋白质含量测定通过BCA方法测定菌株培养液中的蛋白质含量。
将菌株培养液样品与BCA试剂混合，在一定温度下测量吸光度来确定蛋白质含量。
（3）酶动力学参数分析采用酶动力学参数分析方法，如麦克斯韦–玛尔特尔方程等，通过测定在不同底物浓度下的淀粉酶活性，来确定酶的最适底物浓度、最适酶浓度以及酶的最大反应速率。
淀粉酶生产工艺
淀粉酶生产工艺淀粉酶作为一种重要的工业酶，广泛应用于食品、医药、饲料、糖化、纺织、皮革等领域。
下面将主要介绍淀粉酶的生产工艺。
淀粉酶的生产工艺通常分为两个步骤：种子培养和发酵生产。
1. 种子培养淀粉酶的种子一般由菌丝体制备而得，种子菌株的选取非常重要。
首先，从土壤、植物、食品中分离得到淀粉酶产生菌株，并经过传代培养筛选出优良菌株。
然后，选择合适的培养基进行菌株的预培养，以获得高活性和高产量的种子菌株。
培养基的选择要考虑到菌株的特性和经济性。
在种子培养过程中，通常采用摇瓶培养或容器培养的方式，控制好温度、pH值和氧气供应等条件，优化菌株的生长。
2. 发酵生产种子培养完成后，将种子菌株接种到大型发酵罐中进行发酵生产。
发酵过程需要控制好发酵温度、pH值、氧气供应和添加剂的投放等条件。
温度：淀粉酶的产生通常在30-50°C之间，具体温度要根据菌株的特性来确定。
温度过高或过低都会影响酶活性和产量。
pH值：淀粉酶一般在中性或微酸性环境下活性最高，一般在pH 5.0-7.0 的范围内进行发酵。
氧气供应：氧气供应对淀粉酶的产生有重要影响，因为淀粉酶属于需要氧气的好氧菌株。
因此，在发酵过程中需要控制好氧气的供应，提供充足的氧气以促进酶的产生。
添加剂：为了提高淀粉酶的产量和稳定性，常常会在发酵过程中添加一些助产剂或诱导剂，如优质动物蛋白、磷酸盐和氨基酸等。
这些添加剂能够提供菌株合成淀粉酶所需的营养物质，增加产酶能力。
发酵时间一般为24-72小时，根据菌株的生长速率和淀粉酶产量进行调整。
发酵过程中，可以通过监测酶活性和生物量的变化来掌握发酵的进程和产酶情况。
在发酵结束后，可通过离心、超滤等技术手段将淀粉酶提取和分离出来，经过加工和精制，最终得到纯净的淀粉酶产品。
综上所述，淀粉酶的生产工艺主要包括菌株的培养和发酵生产两个步骤。
通过控制好培养条件和发酵参数，能够提高淀粉酶的产量和质量，达到产业化生产的要求。
淀粉酶产生菌的选育及发酵条件研究
综合实验报告书（2012 ~2013学年）实验题目淀粉酶产生菌的选育及发酵条件研究专业（班级）姓名（学号）起讫日期指导教师2013年 7 月 26日淀粉酶产生菌的选育及发酵条件研究摘要：通过实验对地衣芽孢杆菌进行淀粉酶产生菌的选育及发酵条件进行研究。
根据地衣芽孢杆菌在淀粉培养基上透明圈直径的大小选择出透明圈直径大即酶活大的菌株。
将选育出的菌落分别接种到摇瓶和发酵罐进行试验。
摇瓶实验结果表明，pH 7.2-7.4的区间更适合发酵培养。
在一定的培养时间里，pH及残糖量下降，菌浓和酶活上升。
另外，罐发酵实验结果表明，随着发酵时间的增加，pH、残糖量逐渐降低，菌体浓度和酶活逐渐升高。
关键词：地衣芽孢杆菌；透明圈；发酵；淀粉酶;pHScreening of amylase-producing strain and its fermentation conditionsAbstract:The breeding of Amylase-producing Bacterial Strains of Bacillus licheniformis and the Amylase-producing Fermentation Conditions werestudied. We use Bacillus licheniformis on the starch medium transparentcircle diameter size to select big enzyme activity of strains. Then makesome fermentation tanks and shake flask experiments for the excellentstrains. Results show that with the increase of fermentation time, thesubject which pH is between 7.2-7.4 is better. This subject decrease in pHfaster, the cell concentration increases faster, faster reduced residual sugar,increased at a rate faster decomposition of starch. In addition, the tankfermentation experiments results shows that with the increase offermentation time, Ph and amount of residual sugar gradually reduce, thestrains concentration and enzyme activity increased gradually. Keywords: Bacillus licheniformis ; Transparent circle ; fermentation；Amylase; pH引言淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。
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淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究和酶的纯化摘要：淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平,首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株,对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株,再用正交试验的方法对其发酵条件进行优化,实验最后采用硫酸铵沉淀法初步纯化发酵得到的淀粉酶并对酶活性进行了测定。
关键词：淀粉酶;分离筛选；紫外线诱变;优化;提纯1、引言淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称,包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多,特点各异,在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途。
我国是传统的农业大国，发展淀粉深加工工业是解决当前淀粉生产积压的好出路，而几乎所有淀粉深加工工业的基础都是以淀粉质原料的水解作为第一步,因此淀粉质原料的液化情况直接关系到产品后期的加工工艺和产品的质量。
所以,改进淀粉液化工艺也是降低生产成本，提高产品市场竞争能力的一种重要手段。
显然，改进淀粉液化工艺首要任务就是提高淀粉酶的生产水平。
那如何提高淀粉酶的生产水平呢？我们知道，现在淀粉酶主要来源于植物和微生物,并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事。
本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的枯草杆菌,通过紫外线诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株,并对发酵得到的淀粉酶进行初步提纯，以达到加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、了解发酵条件对产物形成的影响、熟悉发酵条件的优化方法、掌握分光光度法测液化型淀粉酶活力的基本原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
2、材料与方法2.１实验材料2.1．１样品:贵师大综合楼附近的土壤2.1．２培养基和试剂:淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨（斜面）、牛肉膏蛋白胨（液体)种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2％可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液2.1．3 仪器设备：全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。
2. 2 实验方法2.２.1 细菌的分离与初步鉴定:将土壤系列稀释,把1０-３、10-4、１0-5分别涂布到淀粉培养基上，２7℃倒置培养2天,将长出的菌落接入斜面。
将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天,用碘液染色,记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d 值。
保菌供下次实验用。
2.2.2 紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释;倒淀粉培养基平板,将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板０、2min、４mｉn、6ｍiｎ、８min、10min,每个处理２次重复;放到黑暗中倒置培养,37℃培养4８h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数,并计算致死率；加入碘液,分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。
2．2．３生产菌株摇瓶发酵条件的优化2.２.3．１培养基初始pH值和装液量对产酶的影响:用1ｍol/L盐酸或1m ｏl/L氢氧化钠调节培养基pH值,使培养基的ｐＨ值为5.0、７．0、9.0,分装至2５0mL三角瓶中，每瓶25ｍL，灭菌，冷却后编号1、２、3,再接种,37℃下恒温摇床培养48h(摇瓶装液量分别30％、40%、50%），最后测定发酵液酶活。
2.２.3．2 培养基碳源对产酶的影响:在不含可溶性淀粉的培养基中,分别加入0.５%的各种碳源(可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖)，以硝酸铵作为唯一氮源,进行碳源对产酶的影响的发酵试验。
2.2.３.3 正交试验设计:通过三因素两水平的正交试验对高产菌的发酵条件进行优化,建立高产菌株的最佳摇瓶发酵条件。
2．2．4 淀粉酶的初步提纯及酶活性的测定２．2.4.1 淀粉酶的初步提纯:收集发酵液,3000r/min离心10mｉn，去除菌体,在上清液中加入6５％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析２h,然后5000ｒ／miｎ离心20ｍin，得到初步纯化的淀粉酶。
2.２.４.2 标准曲线的制作和酶活性的测定:将可溶性淀粉稀释成0.2％、0.5％、1％、1.5％和2％的稀释液，按下表进行标准曲线的制作和酶活性的测定。
管号１ 2 3 ４５６7．1 7.2 ７．3 7．4淀粉稀释液/ｍL２(０%)2(0.２%)2（０．５％)２（1％）２(１.5％）２（2%）2（2％) 2（2%) 2（2%) 2(2%)缓冲液/mL 1 1 １ 1 1 １ 1 1 1 140℃水浴保温５ｍiｎ蒸馏水/mL １１ 1 1 1 1 0 0 0 0 粗酶液／mL ０0 0 0 0 0 1 1 1 1 ４0℃水浴保温3０ｍin,然后加入0.5mol/L乙酸１0 ｍL,混均吸取反应液1mＬ碘液/mL １０ 1 1０10 10 A660(平均值)（7．１、７.２、7．３、7.４中加入的粗酶液,即为正交试验设计中处理一、处理二、处理三、处理四所得的淀粉酶液)注:①前6组的数据用于标准曲线的制作：以淀粉浓度为横坐标,吸光度为纵坐标，作标准曲线；②后4组的数据用于酶活性的测定:测得吸光度后,可从标准曲线中查出相应的淀粉浓度，求出被消耗的淀粉量，这里的酶活即为每毫升粗酶液于4０℃，ＰH6．0的条件下,每小时液化可溶性淀粉的毫克数【mｇ可溶性淀粉/m L·h】。
3、结果与分析3．1 菌落的形态特征菌落在以淀粉为唯一碳源的分离培养基中生长，培养4８ h形成白色圆形菌落，菌落背面乳白色,边缘不光滑，形态规则,质地较密，有透明圈，无沉淀。
３. ２ 计算Ｄ/d 值3.2．1 分离筛选时，大部分菌落水解圈都粘连在一起,无法准确测得D ／d 值,只得到少部分数据:单菌落 透明圈直径/m ｍ(D ）菌落直径/m ｍ(ｄ)D /ｄ ① 4．0 3.0 １．３ ② 1４.0 7.12.０分析：无法准确测得D /d 值，可能是所采土样中产淀粉酶的细菌含量较多,涂平板之前稀释倍数不够导致单菌落过于密集，水解圈粘连;也可能是实验操作不当所致。
3．2．2 紫外诱变后，得到单菌落的透明圈直径和菌落直径及比值：单菌落 透明圈直径/mm(D ） 菌落直径／mm(d) D /ｄ ① ４.8 3.0 １.６ ② 6．４ 5.5 1．２ ③ 14.8 7.4 2.0 ④ 16.0 4.9 3.3 ⑤ １1.８ 4.５ 2．６ ⑥ ９.8 ４.0 2.５ ⑦ 2５.0 5.0 5.0 ⑧ ８.8 4.0 ２．2 ⑨ 14.０ ７.８ 1.8分析:通过结果,可看出经过紫外诱变后,有的菌株产酶活能力有所提高,有的减小,筛选产酶活能力最高的菌株，保存供后续试验使用。
我们挑⑦号菌,将其保存到斜面培养基上供后续试验使用。
3． ３ 计算菌株紫外诱变的致死率对菌株分别用紫外线处理,得到下表：表A 透明圈直径和菌落直径及比值由此数据，可作出紫外线诱变的致死曲线存在正相关。
当紫外线照射时间为6mｉｎ时，致死率为９6.7%,进一步提高照射时间,则致死率随之上升，当照射10min时，致死率为1０0％。
一般认为，进行紫外诱变时,致死率为95％左右时突变效果最好。
因此,紫外线诱变的最适剂量为6min。
３． 4 菌株发酵条件的优化3．４．1 培养基初始pH值和装液量对产酶的影响:分析：未得到数据的原因有三点:①操作不当，可能是取液过程中加错体积,也可能是将试管序号弄混了；②将发酵液从摇床取出的过程中有少量溢出,导致浓度降低,影响实验结果;③发酵过程中有杂菌产生，发酵液被污染了。
3.4.2 培养基碳源对产酶的影响：论:三种碳源中最佳碳源是葡萄糖。
3．4．3 标准曲线的制作:６６０明显偏高,可能是稀释淀粉的时候操作不当所致；②在测酶活时,还未等到分光光度计稳定就开始读数，造成测量结果有误差；③由于操作失误,忘记每个试管做平行测量，造成测量结果不精确。
3．４．4 正交试验酶活力的测定试管编号1(对照）7．1７．27．３７．4A ６600 0.004 0.047 0.0１9 0.063 酶消耗的淀粉浓度(%) ０ １．999 １．930 １.９53 1．975 酶活力（mg/m L ·h ) ０39.9838.6039.０639．50表1表2 试验结果分析分析：对正交试验结果进行方差分析，可知最佳培养基配方为A１B1C1，即接种量3%、淀粉含量5g／Ｌ、蛋白胨含量5ｇ／L。
3．５淀粉酶的初步提纯正交试验得到酶液分别加入６5%饱和度的硫酸铵,待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析２ｈ,然后500０r/min离心20mｉn,去除上清液,再加水稀释测酶活。
试管编号1(对照）7．1′７.2′7．3′7．４′A６６00 0.０15 0.097 0.0４9 0．03３酶消耗的淀粉0 1．981 １．849 1.9２6 1.952浓度(%）酶活力（mｇ/0 3９.6２36.98 ３８.52 39.04ｍＬ·h）分析:实验的目的旨在掌握初步纯化淀粉酶的方法和进一步掌握分光光度法测液化型淀粉酶活力的基本原理和方法。
表3 A６60和表1相比，７.１′、７.2′、7.３′均比表1大,7.４′却比表1小,可能是加水稀释时混合不均匀所致。
4、讨论本实验的设计方案具有一定的理论依据,如果操作得当,各方面条件满足，会得到产淀粉酶的枯草杆菌高产菌株,及该菌株的最佳摇瓶发酵条件。
但操作过程存在很多缺陷,主要问题有:①分离筛选淀粉酶菌株时，稀释度不够导致水解圈粘连;②在进行ｐH值和装液量对产酶影响的实验过程中,取液操作不当,将试管序号都弄混了;③发酵过程中有杂菌产生,发酵液被污染;④制作标准曲线时，由于操作失误,忘记每个试管做平行测量，造成测量结果不精确;⑤在测酶活时,还未等到分光光度计稳定就开始读数，造成测量结果有误差；⑥由于考虑到时间的限制，实验过程中分离时的复筛及突变后的复筛都没做，若要得到精确可靠的实验数据，应该操作完善。
此外,紫外线诱变育种简便易行、对条件和设备要求较低并能较好地提高代谢产物的产量,故在微生物育种中仍广泛应用。
但实验中发现紫外线诱变存在很大的不确定性,为使诱变效率提高，运用分子生物学技术对菌株进行基因操作和定向改造,会使菌株选育朝着快捷、高效的方向发展。
以上几点可以作为今后该实验改进的几点建议，及操作过程中应注意的问题。
附录（一）、培养基的配制1、淀粉培养基:蛋白胨10g，氯化钠5g,牛肉膏5g，可溶性淀粉２g,蒸馏水1０00mL，琼脂20g,pH７．２2、牛肉膏蛋白胨培养基:蛋白胨10ｇ，氯化钠５ｇ,牛肉膏3ｇ,蒸馏水１000mL，琼脂1５～20g,pＨ7.0～7.2(二）、试剂１、碘液：碘0.0２２g,碘化钾10g，先用少量蒸馏水使碘完全溶解后定容至２50 mＬ，置于棕色瓶中待用。