电镜扫描制样全流程
扫描电镜制样
扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术SEM常规制样方法（一）——试样的取材、固定、脱水和置换一、实验目的掌握扫描电镜制样过程：从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态，从而得出接近生活状态的样品。
二、实验原理不论动物或植物组织，要求取材时操作必须快速，组织表面要清洁，必要时需超声波清洗，原理同TEM取材，但需强调的是SEM观察表面结构，所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。
取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间，所用的器械要锋利、洁静，避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤，常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。
三、实验器材样品（动物或植物）、双面刀片、培养皿、l.5ml离心管、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、0. 1M PBS缓冲液，乙醇、乙酸异戊酯。
四、实验步骤1、取材要求动作轻、迅速、准确，为了保持生活状态，应在固定前清洗掉表面杂质，即，迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗，也可超声波器中超10s-30s，使样品所带的污物除去（如：气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等）。
2、固定（前固定）经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中，间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。
样品固定的目的：使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。
如果样品没有很好地固定，那么样品在脱水时可能变形，破坏了样品的生活状态，也就是说，固定不好的材料，电镜下不能反映真实结构，所以这一步很重要。
3、冲洗0. 1M PH7.2 PBS缓冲液洗：30分钟中间换3-4次，因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀，所以在后固定之前，用0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后，样品才可能进入锇酸固定液。
4、后固定：1%四氧化锇后固定1-2小时。
5、冲洗：重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次，因四氧化锇与乙醇反应，所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇，样品才能进行脱水。
6、脱水脱水剂为乙醇，室温进行为了减少人工损伤，需要梯度脱水：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每级15-20分钟，如果是动物样品，脱水时间可5-10分钟，脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止，最后100%乙醇要重复2-3次，保证样品绝对无水。
扫描电镜细菌制样方法
细菌样品前处理取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。
（1)收集菌体:①液体培养基中的菌体，可取培养液8000rpm离心3～5min，弃上清,倒入2。
5％戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体，可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落（注意不要刮下培养基)。
将菌液吸入小离心管，离心后换入新鲜戊二醛固定。
(2）固定，脱水按常规方法。
2.5%戊二醛,2～4h→磷酸缓冲液清洗3次→1%锇酸4～6h →缓冲液清洗3次→乙醇梯度脱水，30％,50％,70%,85％，95％各一次,100％乙醇2次,15～20min/次→乙酸异戊酯置换2次,20min/次（注意：每步均需离心,8000rpm，3～5min，弃上清，倒入下一种试剂，滴管来回吸几下,打散菌块）。
（3）临界点干燥：普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条,将长边35mm平均分成3份，对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状.将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。
放入临界点干燥器样品室,进行CO2临界点干燥。
一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意，需用液态CO2置换2～3次）。
(4）离子溅射金：沿两端书钉剪开滤纸包，将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿，轻摇尽量分散菌体。
碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上，另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。
离子溅射金后,即可进行扫描电镜观察。
细菌样品特殊制备方法；1，固体培养基中的菌体用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌.然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内加入适量1％锇酸，盖上含有样品的瓶盖,熏蒸固定2h以上。
然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金,进行扫描电镜观察。
2，液体培养基中的菌体取一定的培养液，8000rpm离心3~5min,弃上清液，加入2.5％戊二醛固定2h,pH 7。
2磷酸盐缓冲液清洗，然后加入蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2min，用滤纸吸去多余溶液。
扫描电镜样品制备生物技术
离子溅射原理
优点：
喷镀颗粒较细，不至于掩盖样品的微细结构 喷镀均匀 二次电子收获量较高
组织导电技术：
原理：金属盐类化合物与生物样品中的蛋白
质、脂类、淀粉等呈化学性结合，使样品表面 离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子之 间，使样品表面电阻降低，从而避免了样品充 电。可避免样品热损伤。
材料防止挤压，观察面做好标记
（二）样品清洁漂洗
一般：生理盐水、5％碳酸钠或与固定液相应的缓冲液 大量粘液：预固定，再用蛋白水解酶 表面形态复杂、皱折凹陷多，不易清洗的样品 ：低频超声波 观察组织、细胞内部结构（如血管等）：灌流清洗后再取材
（三）样品的固定
目的：保持生物样品的微细结构和外部形貌。
扫描电子显微镜样品制备技术
SEM结构
扫描电子显微镜原理
一、常规扫描电镜样品制备技术
样品表面必须清洁 样品要干燥而不失原形 样品要有良好的导电性能 注意辨认和保护观察面
（一）取材要点
材料大小适宜
观察表面结构：直径＜5mm，高度3～5mm 观察内部结构：直径＜2mm，高度3mm± 满足观察内容条件下，样品块尽量小。
原因： 表面张力 目的： 消除表面张力
方法： 空气干燥法 冷冻真空干燥法 临界点干燥法
临界点干燥法
原理：临界状态下表面张力为零 处理液： CO2
临界温度（31.1℃） 临界压力（73个大气压）
操作程序：
取材→双固定→丙酮脱水→中 间液（醋酸异戊酯）置换脱水 剂→液态CO2置换中间液→加 热气化（温度40℃，压力 95~100kg/cm2，3~5分钟） →缓慢放气取样→喷镀→观察。
分辨率为 25 Å （SEM 60 Å ） 4．复型膜由铂、碳粒子组成，可长期保存。
扫描电镜细胞样品制备步骤
扫描电镜细胞样品制备步骤嘿，咱今儿就来讲讲扫描电镜细胞样品制备那些事儿哈！
你想想看，细胞那么小的玩意儿，咱要想好好观察研究它们，可得下一番功夫呢！就像咱要给一个小娃娃打扮得漂漂亮亮去参加重要活动一样。
首先呢，得把细胞好好地收集起来。
这就好比去果园摘果子，得小心翼翼地把果子从树上摘下来，不能弄伤了它们。
咱得用合适的方法把细胞从它们生长的地方轻轻地取出来，可不能太粗鲁啦！
然后呢，就是给细胞洗个澡啦！把它们身上那些不需要的杂质啥的都洗掉，让它们干干净净的。
这就像是咱自己洗澡一样，把身上的脏东西都洗掉，清清爽爽的。
接下来，就是固定啦！这可重要得很呢！就好像给细胞穿上了一件坚固的铠甲，让它们能保持住自己的形态，不会东倒西歪的。
不然等会儿咱观察的时候，它们都变形了，那可咋整呀！
再之后，就是脱水啦！把细胞里面多余的水分都去掉，就像咱把湿漉漉的衣服晾干一样。
这一步可得仔细着点儿，不能让细胞受损哦！
接着呢，是干燥啦！让细胞处在一个干燥舒适的环境里，这样它们才能好好地被我们观察呀！
再往下，就是镀膜啦！这就好像给细胞披上了一层神秘的外衣，让它们在电镜下能更好地显现出来。
最后，就可以把制备好的细胞样品放到扫描电镜里面去观察啦！哇塞，你能想象到吗，通过电镜看到细胞的那一刻，就好像打开了一个微观世界的大门，里面有着无数的奥秘等着我们去探索呢！
你说这是不是很神奇呀？咱通过这一步步的操作，就能看到细胞的各种奇妙之处啦！所以呀，可别小瞧了这扫描电镜细胞样品制备的步骤哦，每一步都马虎不得呢！咱得像对待宝贝一样精心地去处理这些细胞，这样才能得到最准确、最有价值的观察结果呀！这可不是闹着玩的事儿呢！大家可得认真对待哟！。
扫描电镜实验步骤
扫描电镜实验步骤
扫描电镜是一种高分辨率的显微镜，可以用于观察微小的物体表面结构。
在进行扫描电镜实验时，需要按照以下步骤进行操作。
第一步：样品制备
样品制备是扫描电镜实验的关键步骤之一。
样品应该具有一定的厚度和尺寸，以便于在扫描电镜中进行观察。
通常情况下，样品需要进行固定、切片、染色等处理，以便于观察。
第二步：样品表面处理
在进行扫描电镜实验之前，需要对样品表面进行处理。
这是因为扫描电镜只能观察样品表面的结构，而不能观察样品内部的结构。
常用的样品表面处理方法包括金属喷镀、碳喷镀、真空蒸镀等。
第三步：扫描电镜操作
在进行扫描电镜实验时，需要将样品放置在扫描电镜的样品台上，并调整扫描电镜的参数，如电子束的加速电压、扫描速度、探针电流等。
然后，通过扫描电镜的探针扫描样品表面，将样品表面的结构转化为电子信号，并通过电子显微镜将其显示出来。
第四步：图像处理和分析
在获得样品表面的图像之后，需要对图像进行处理和分析。
常用的
图像处理方法包括增强对比度、去噪、调整亮度和对比度等。
而图像分析则可以通过计算机软件进行，如图像分割、形态学分析、三维重建等。
扫描电镜实验是一项复杂的实验，需要进行样品制备、样品表面处理、扫描电镜操作和图像处理和分析等多个步骤。
只有在严格按照实验步骤进行操作的情况下，才能获得准确的实验结果。
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
扫描电镜SEM制样步骤
扫描电镜S E M制样步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN扫描电镜观察制样步骤固定：1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入 5ml 的离心管中,2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时3、置于 4℃冰箱中固定12小时。
冲洗：用 0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗 3 次，每次 10 分钟。
每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。
Or 离心脱水：分别用浓度为30%， 50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟，干燥：将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥 12 小时。
粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上预处理好的样品放入干净离心管中待检。
SEM上机测样--测定条件参数设置分子克隆实验指南第三版，1568页：25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制；先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需：0.1mol/L K2HPO4，80.2ml0.1mol/L KH2PO4，19.8ml混合即是，不用酸碱调PH。
参考文献：DOI:?10.1021/es902165yMicrobial fuel cell?based on Klebsiella pneumoniae biofilmSelecting?anode-respiring bacteria based on?anode?potential: phylogenetic, electrochemical, and?microscopic?characterizationA severe reduction in the cytochrome C content of?Geobacter sulfurreducens?eliminates its capacity for extracellular electron transfer2。
扫描电镜与透射电镜样品制作(完全版)
相关仪器的信息：透射电镜：JEOL(公司) JEM-1230（型号）TEM，产地：日本超薄切片机：Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome，产地：奥地利扫描电镜：Philips XL30 ESEM，产地：捷克临界点干燥仪：Hitachi HCP-2 Critical point dryer，产地：日本真空喷镀仪：Eiko IB5 ion coater，产地：日本包埋剂：SPI-CHEM Spurr resin，产地：USATEM样品包埋块制作有关注意事项一、取材：1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态；2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织；3、组织块大小：一般要小于1mm3。
二、固定：固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。
固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。
1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中2、使用锇酸的注意事项I 通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。
II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。
第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。
三、漂洗：应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。
四、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。
由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。
脱水过程中应注意：I 逐级脱水而不能急剧脱水；II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4℃保存。
五、渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。
金属扫描电镜的制样流程20180521
一、金属样品制备扫描电镜试样样品要求：样品不宜过大，过大的试样需要进行切割操作，切割后的样品经研磨、抛光和腐蚀后便可放到扫描电镜中直接进行观察。
切割设备：金属的切割设备选用沈阳科晶自动化设备有限公司生产的型号为SYJ-200外圆切割机，该设备切割金属时切割速度快，切割后的金属表面无热灼伤，表面形态好。
耗材：用来切割金属的一般有SiC 锯片（一般切割有色金属）、刚玉锯片（一般切割黑色金属）、全烧结金刚石锯片（适用于绝大多数材料）切割辅助设备：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的MTI-3040加热平台，该设备操作简单，温度≤200℃。
耗材：陶瓷树脂衬垫、石蜡试样的镶嵌：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的型号为CXQ-2500真空冷镶嵌机、HXQ-50自动热镶嵌机、XQ-2B 金相试样镶嵌机都可以作为金相实验镶嵌的设备。
耗材：镶料：胶木粉（热镶嵌）；水晶胶、硬性冷镶模、软性冷镶模、弹性样品夹（冷镶嵌）样品的磨抛：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的手动研磨抛光机型号有UNIPOL-820、UNIPOL-830、UNIPOL-1210三种。
自动精密研磨抛光机型号有UNIPOL-810、UNIPOL-802、UNIPOL-1202、UNIPOL-1502四种。
自动压力研磨抛光机型号有UNIPOL-1000D、UNIPOL-1200S、UNIPOL-1200M、UNIPOL-800M、UNIPOL-12601材料固定MTI 加热平台2切割SYJ-200精密切割机3镶嵌HXQ-50自动热镶嵌机4研磨抛光UNIPOL-810精密研磨抛光机5清洗VGT-1620TD 超声波清洗机6溅射VTC-16-3HD 3靶等离子溅射仪7电子显微镜KYKY-EM8000场发射扫描电子显微镜8耗材SiC 锯片、刚玉锯片、全烧结金刚石锯片、陶瓷树脂衬垫、石蜡、胶木粉（热镶嵌）；水晶胶、硬性冷镶模、软性冷镶模、弹性样品夹（冷镶嵌）砂纸、金刚石磨片、树脂基金刚石磨片、研磨纸、研抛底片、磨料、抛光垫、抛光液、抛光膏、磁力橡胶五种。
细胞扫描电镜样品制备流程
细胞扫描电镜样品制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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电镜扫描制样全流程
中南大学能源科学与工程学院谢德成
随着电镜扫描技术的迅速发展，目前采用电镜扫描技术对各种材料进行元素成分分析的需求越来越多，为方便非材料系学生学习并自己制作电镜扫描所需样品，特写此文以供参考。
一、制样
制样可以分为热镶制样和冷镶制样两种。
1、热镶制样
热镶制样就是将需要扫描的原始样品和热镶嵌料先后放入热镶机中，开机加热当温度高于130o C后镶嵌料融化包裹样品，最后得到圆筒状的镶嵌样品。
扫描样品位于圆筒的下表面中心，如图1所示。
热镶机分两种，一种是手动的，需要手工缓慢压紧样品与逐渐融化的热镶嵌料；另一种是全自动热镶机，只需加入样品和热镶嵌料即可。
热镶制样所需材料：a、原始样品b、热镶嵌料c、热镶机（可到粉冶院实验中心三楼制样室）。
热镶制样操作简单，镶嵌样品美观，但是加热与冷却过程费时，平均制作一个镶嵌样品需30分钟。
2、冷镶制样
冷镶制样就是将需要扫描的样品放入圆筒状模具底部中心，再将流态的镶嵌料注入圆筒状模具，等流态的镶嵌料固化后形成圆筒状的镶嵌样品，如图2所示。
冷镶制样方法较多，常用的有两种。
第一种是采用牙托粉作为镶嵌料，第二种是采用环氧树脂E-44，邻苯二甲酸二丁脂，乙二胺三种溶液（可到升华科研所买）按质量100:20:7配比后隔水加热形成流态的镶嵌料。
冷镶制样所需材料：a、原始样品b、流态镶嵌料c、圆筒状模具（可用薄塑料管）。
冷镶制样的镶嵌料制作较复杂，镶嵌样品较粗糙，但是所需时间短，可一次性制作多个镶嵌样品。
二、预磨
制样后得到的镶嵌样品中样品被镶嵌料所包裹，需要将样品下表面的镶嵌料磨掉直至露出样品内部水平光滑截面为止。
预磨时需要采用水磨砂纸和预磨机，水磨砂纸按规格可以分为粗磨砂纸：80目，150目，180目，240目，280目，320目；精磨砂纸：400目，500目，600目，800目，1000目，1200目；超精
磨砂纸：1500目，1800目，2000目，2400目，4000目等。
先将水磨砂纸在预磨机上固定，然后将镶嵌样品在预磨机上由粗磨逐步精磨，一般磨至2000目得到下表面比较光滑的镶嵌样品为止。
预磨所需材料：a、镶嵌样品b、水磨砂纸（可到升华科研所买）c、预磨机（可到粉冶院三楼制样室或材料院三楼预磨室或中南大学材料加工中心）。
粗磨时需要注意的是手不能使劲地压镶嵌样品，以免用力不均使得镶嵌样品的上下两个表面与水平面倾斜；精磨时应耐心细磨，以免电镜扫描时发现砂纸磨痕影响分析结果，一般应在2000目的砂纸上精磨半个小时左右。
三、抛光
预磨后的镶嵌样品不能直接进行电镜扫描，还需要进行抛光。
不同材料需要不同的抛光剂，但是所选抛光剂应具有优良的抛光性能，抛光后的工件光亮度要高，截面看起来要干净且反光，以方便在电镜下扫描。
一般采用氧化铝抛光液或金刚石微粉抛光液与酒精对精磨后的样品的下表面进行抛光。
抛光机与预磨机类似，区别在于预磨时采用水磨砂纸，而抛光时使用的是抛光布，先将抛光布贴在抛光机上，然后把抛光液均匀地洒在抛光布的抛光部分，抛光机开动后缓慢向抛光部分滴酒精，以润滑镶嵌样品与抛光布。
抛光所需材料：a、精磨镶嵌样品b、抛光布（可到升华科研所买）c、抛光机（可到粉冶院三楼制样室或材料院三楼预磨室或中南大学材料加工中心）。
抛光后的镶嵌样品先放进装满酒精的烧杯中浸泡清洗，一段时间后取出吹干后就可进行电镜扫描。
四、总结
至此，电镜扫描制样全流程结束，希望对大家有所帮助。