组蛋白修饰的研究方法

一、背景

许多组蛋白的各种翻译后修饰（PTM （即甲基化，乙酰化，泛素化和SUM 化）发生在赖氨酸位点。虽然在被覆盖的组蛋白折叠域内发现了少数的修饰位点，但是翻译后修饰在柔韧的N-末端尾部区域却是相当普遍的。许多组蛋白修饰能够调节染色质结构中重要的功能性变化，并通过直接地改变染色质结构/动态变化或通过招募组蛋白修饰蛋白和/ 或核小体改构复合体来实现。

组蛋白翻译后修饰已经被发现能影响许多基于染色质的反应，包括转录，异染色质的基因沉默和基因组稳定性。由于能影响到整个转录程序，与基因表达相关的修饰尤其具有特殊意义。在多种体外模型中，组蛋白翻译后修饰代谢途径的缺陷与基因表达失调有关。这在某些情况下

也与人类疾病相关，并已在免疫缺陷和各种人类癌症中得到验证。因此, 组蛋白标志物是如何被调节的以及如何影响PTM特异性结合蛋白的相

互作用将继续成为重大的研究领域。

确定组蛋白翻译后修饰的功能往往涉及到研究修饰的丰度和结合伴侣。这里所描述的方法将对这些方面进行总结，其中包括了详述组蛋白纯化方法、制备位点特异性修饰的重组组蛋白、基于多肽的PTM结合蛋

白表征体系以及染色质免疫共沉淀样品不同分析手段的实验方案的总结。二、组蛋白修饰的研究方法

①细胞裂解

通过免疫印迹来检测组蛋白修饰时可以用经SDSLaem m样品缓冲液提取

得到的全细胞裂解液。对于动物细胞株而言，离心得到的细胞可以直接在样品缓冲液中重悬并煮过后上样；然而需要注意的是，一些实验方案中还会推荐在提取步骤后对样品进行超声处理。除了碱性预处理步骤是可选的以外，真菌蛋白提取物可以用同样的方式来进行准备。然而, 如果实验上必须尽量减少样品处理时间的话该步骤是可以省略的。只要注明该步骤的省略以及后续实验样品均以同样方式处理即可。提取之后再通过离心除去样品中的不溶性组分，将可溶性的全细胞提取物留在上

清中。

②组蛋白富集

在一些实际应用中，有必要检测富集有组蛋白的组分或纯化的组蛋白；富集的样品可以是分离得到的细胞核或者是染色质的粗提取物。从后生动物细胞或者酵母中提取细胞核十分简单，基本上只需要三个步骤：低渗膨胀（酵母要先将细胞壁消化掉以后）、利用机械力剪切进行细胞膜裂解（例如用杜恩斯匀浆器进行破碎或者在旋涡混合器上温和震荡）和通过离心分离细胞核（图1A）。染色质粗分离也是很简单的，只要在去垢剂裂解步骤后用离心将染色质沉淀即可（图1B）。

③组蛋白纯化

一些现有的组蛋白纯化实验方案是相当好的，并且易于遵循。在这里介绍的方法中，组蛋白是使用稀硫酸溶液从细胞核中提取的，然后通过柱层析纯化（图1C）。此方法的优点在于核酸和许多非组蛋白由于在酸性pH值下是不溶的，可以很容易地通过离心来去除掉。可溶的含有

组蛋白的组分就可以用三氯乙酸（TCA来沉淀，并且如果需要的话，可以通