外周血PBMC的分离
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
pbmc细胞
pbmc细胞PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell）即外周血单个核细胞，包括外周血中的淋巴细胞、单核细胞和浆细胞。
它们在免疫系统中起着重要的作用，对于维持人体免疫反应的平衡至关重要。
本文将介绍PBMC细胞的特点、分离方法以及其在科研和临床应用中的意义。
一、PBMC细胞的特点PBMC细胞是一类具有明显异核的淋巴细胞，包括单核细胞和浆细胞等。
它们存在于外周血液中，由于其特殊的形态结构以及免疫功能，被广泛应用于免疫学研究和临床诊断。
二、PBMC细胞的分离方法PBMC细胞的分离通常采用密度梯度离心法。
具体步骤如下：1. 收集外周血样本，使用抗凝剂稳定血液。
2. 将血液轻轻慢慢倒入离心管中。
3. 加入相应比例的生理盐水或离心液，轻轻混合，保证离心液平稳沉淀。
4. 将离心管置于离心机中，根据不同实验要求选择合适的离心速度和离心时间。
5. 取出离心管，观察离心液的分层情况。
6. 用移液器小心地取出中间的乳状层，该层为PBMC细胞层。
7. 将PBMC细胞层移至新的离心管中，加入培养基进行后续实验或研究。
三、PBMC细胞的应用意义PBMC细胞在免疫学研究和临床应用中具有重要的意义。
1. 免疫学研究PBMC细胞可用于体外实验，研究细胞介导的免疫反应机制，评估不同物质对免疫系统的影响。
例如，通过研究PBMC细胞的细胞因子产生水平，可以评估特定免疫刺激对机体免疫功能的激活情况。
2. 免疫功能评估PBMC细胞可以用于评估疾病患者的免疫功能状态。
通过检测PBMC细胞中各类免疫指标的表达水平，可以评估免疫系统的活性和功能状态，为临床诊断提供参考依据。
3. 细胞治疗PBMC细胞在细胞治疗中也有广泛应用。
例如，通过采集患者的PBMC细胞，经过体外扩增和处理后，再注入患者体内，可以增强患者的免疫反应和抗肿瘤能力，达到治疗的效果。
四、结语PBMC细胞作为外周血单个核细胞的代表，具有重要的免疫学意义。
PBMCs的分离和计数
不着色）
活细胞数
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
密度梯度离心法分离PBMCs：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
注意事项
• 稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上 ，使两者形成一个清晰地界面。
• 细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，切勿打破形 成的细胞层。
PBMCs的分离和计数
实验目的和要求
• 掌握PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)分离的方法 • 掌握细胞计数的方法
实验原理
外周血中细胞种类
细胞密度
红细胞和多核白细胞
1.092-1.093
PBMC(淋巴细胞和单核细胞)
1.074
淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypague 1.077
实验步骤
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
肝素抗凝静脉血1-1.5
ml 加等体积的Hank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
(交界液面：一定不要打乱)
离心（2000rpm， 25min）
血浆
分液 红细胞 粒细胞
PBMCs层
用Hank′s液洗、离心 (1500 rpm，5min) 重复2次
细胞计数
数上不数下，数左不数右。
细胞计数板
细胞计数
用100ulHank’s液重悬细胞
取10ul细胞悬液+40ul Hanks'液 +50ul台盼兰, 混匀
取10ul于细胞计数板上
进行细胞计数
实验结果计算
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 2个大方格内细胞总数 ×104×稀释倍数
外周血单个核细胞
步骤 2 – 洗涤PBMC
用毛细吸管仔细吸取第二层的单个核细胞（灰白色层）
将所得PBMC用洗液（RPMI-1640液或PBS）洗涤一次
2000rpm×10min
用1ml的RPMI-1640或PBS定容细胞，并混匀
步骤 3 –台盼蓝染色PBMC
用100μl加样器吸取已定容混匀的PBMC100μl与100μl的 2%台盼蓝染液混合 用100μl加样器吸取少许加入计数板下，计数
步骤 1 - 分离PBMC
采集静脉血约4ml，加入含0.1ml肝素溶液（125-250U/ml） 的抗凝管中，混匀
吸取2mlPBS置干净试管中，并与抗凝血混匀 吸取3ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中，
将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入稀释的抗凝血
离心2000rpm×25min
密度梯度离心分离PBMC
外周血单个核细胞的分离
(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)
常用方法
聚蔗糖—泛影葡胺密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation)
分离液的密度是关键：1.077 PBMC包括淋巴细胞和单核细胞 血浆和血小板由于密度较低,故悬浮于分层液的上部;红 细胞与粒细胞由于密度较大,故沉于分层液的底部;PBMC 密度稍低于分层液,• 故位于分层液界面上,这样就可获得 PBMC。
注：该步骤可省略，不染色而直接计数PBMC
步骤 4 –计数PBMC
1.计数4个大方格中（即64个小方格）所有细胞数 2.计数原则：数上不数下，数左不数右。 3.总数除以4，所得数据×104即为1ml液体中的细 胞总数 4.每ml健康成人血可分离出1×10 数4个大方格细胞数分别为：87，79，91，85 总数为： 87+79+91+85=342 一个大方格的平均数为：342/4=85.5 1ml液体中细胞量为：85.5×104 如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据 的2倍。
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
pbmc分离步骤
pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。
以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。
•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。
•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。
3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。
•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。
•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。
4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。
5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。
6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。
•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。
注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。
•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。
•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。
这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。
人全外周血血浆与PBMC分离
人全外周血血浆与PBMC分离
前期准备：离心机降温；
冻存液配制：血清：DMEM:DMSO按5：4：1的比例配制
1.拿到血，配平，500g x4℃离心5分钟，升6降5(加速度);
2. 上清为血浆，取上清分装至冻存管保存至-80℃冰箱；
3.往剩余的血中加入3-4ml PBS稀释血液，取50ml离心管加入15-20ml人外周血淋巴细胞分离液(Ficoll) ，用胶吸管将血缓慢加入装ficoll的离心管中。
4．400g x20℃离心25分钟，升5降0(加速度);
5.离心完后轻轻吸掉上清，取中间飘浮的一层细胞，加4-5ml PBS，400G离5分钟，升6降5(加速度),
6. （方法同冻细胞）加入3-5ml冻存液，分装至冻存管冻存3-5管，转到程序降温盒，放入-80℃冰箱冻存。
pbmc增殖实验原理
pbmc增殖实验原理
PBMC增殖实验是一种常用的细胞生物学实验，用于研究外周血
单个核细胞（PBMC）的增殖能力。
PBMC是一种混合细胞群，包括淋
巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。
进行PBMC增殖实验的原理主
要包括以下几个方面：
1. PBMC分离和培养，首先，从外周血中分离PBMC，通常采用
密度梯度离心法。
然后将PBMC进行培养，提供适当的营养物质和生
长因子，以促进其生长和增殖。
2. 刺激因子的作用，在培养PBMC的过程中，可以加入不同的
刺激因子，如激活剂、抗原或药物等，以模拟体内的免疫应答过程。
这些刺激因子可以激活PBMC，促进其增殖和分化。
3. 测定增殖活性，通过不同的方法来测定PBMC的增殖活性，
常用的方法包括MTT法、放射性核素标记法、流式细胞术等。
这些
方法可以定量或定性地评估PBMC的增殖能力。
4. 数据分析和解释，最后，对实验结果进行数据分析和解释，
比较不同条件下PBMC的增殖活性，探讨刺激因子对PBMC增殖的影
响，从而揭示PBMC在免疫应答中的作用和调控机制。
总的来说，PBMC增殖实验的原理是通过培养PBMC并加入刺激因子，测定其增殖活性，从而研究PBMC在免疫应答中的生物学特性和调控机制。
这种实验方法在免疫学和临床医学研究中具有重要的应用价值。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
外周血PBMC的分离
原理
外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
外周血
红细胞
粒细胞
单个核细胞
血小板
淋巴细胞
单核细胞
1.030~1.035
1.075~1.090 Ficoll：1.077±0.001 (PBMC)
1.092
1.093
实验步骤
注意事项
1500rpm, 20℃ , 30min
PBMC
红细胞粒细胞
Ficoll
稀释外周血 Ficoll
稀释的血浆、血小板 ⏹ 1.采血，稀释
（外周血：稀释液=1：2）
⏹ 2.在离心管中加入Ficoll ，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll ：稀释血=1：2） ⏹ 3.18℃，1500r/min ，离心30min ⏹ 4. 轻轻吸取PBMC 层移入另一试管中
⏹
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min 离心5min ，弃上清。
⏹每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞
⏹Ficoll应适量，外周血应充分稀释
⏹温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果
⏹在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面⏹吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液
而导致血小板污染。