PH0630 活性氧检测试剂盒实验操作手册 Phygene
活性氧的检测方法
活性氧的检测方法摘要活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是一类在细胞内广泛存在且具有高度活性的分子。
活性氧对细胞膜、蛋白质和核酸等生物分子造成损伤，并参与了多种生物学过程。
因此，准确测量活性氧的水平对于揭示其生物学功能以及相关疾病的发生机制具有重要意义。
本文将介绍几种常见的活性氧检测方法，并对其优缺点进行讨论。
1. 化学染料法化学染料法是一种简单、直观的活性氧检测方法。
目前常用的化学染料包括二苯基四氮唑盐 (DAB)、硝基蓝色苯胺盐 (NBT)和氧化铁氰化钠 (FeCN) 等。
这些染料可与活性氧发生特异性反应，并在反应过程中产生可定量分析的颜色变化。
然而，化学染料法存在一些局限性。
首先，染料的选择与操作条件对实验结果有很大影响，如pH值、温度等。
其次，该方法只能提供活性氧的总量，而无法分辨各种活性氧物种的相对含量。
此外，由于染料具有较强的选择性，所检测的活性氧种类也较为有限。
因此，在应用化学染料法时需要小心考量其适用性。
2. 荧光探针法荧光探针法是一种广泛应用于活性氧测定的方法。
该方法利用已知产生荧光信号的探针与活性氧发生特异性反应，通过测量荧光信号的强度来间接测定活性氧的水平。
常见的荧光探针包括二苯基巴比妥酸 (DABCO)、二羟基联苯 (DPBF) 和二苯并硼菊酯 (DCFH-DA) 等。
这些荧光探针表现出高度选择性和灵敏性，可以用于监测不同活性氧物种的生成和消除动力学过程。
然而，荧光探针法也存在一些限制。
例如，某些荧光探针可能因自身的不稳定性而导致误差。
此外，荧光信号的测量需要专业设备的支持，且荧光信号也易受环境因素的影响。
因此，在选择荧光探针时需要根据实际需求进行权衡。
3. 电化学法电化学法是一种可探测活性氧的敏感、定量且实时的方法。
该方法是通过将活性氧还原为可测电流来测定其浓度。
电化学法常用的电极包括铂电极、碳电极和金电极等。
电化学法的优势在于其高灵敏度、实时性和可定量性。
活性氧检测试剂盒 说明书
活性氧检测试剂盒 Reactive oxygen species assay kit
货号：CA1410
规格：100-500T
产品内容：
10 mM DCFH-DA in DMSO 活性氧供体 说明书
0.1 ml 1 ml 1份
20 ºC 保存 20 ºC 保存
产品简介：
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化
物(O2•−, H2O2, •OH, ONOO−, •NO)等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过
程。采用 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今常用也是较灵敏的细胞内活性氧检探针。
DCFH-DA 没有荧光，进入细胞后被酯酶水解为 dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在时 DCFH 被氧化
3. PBS 洗涤细胞 2 次。 三、荧光检测
采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜图像检测照相，绿色荧光强度代表活性氧水平。也可进行微板荧 光分析仪(multiwell fluorescence plate reader)实时或每 10 分钟分时逐点检测荧光强弱。对于流式细 胞仪可将细胞用胰酶消化 PBS 洗涤后重悬检测。
1. 加入 DCFH-DA 于培养基，推荐初始工作浓度为 10 µM。对不同的细胞和处理，DCFH-DA 工作浓度可 为 100 nM~20 µM，需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在 1:500~1000 以上以避免 DMSO 对细胞 的影响。以 DMSO 作为溶剂对照。
2. 37 ºC 孵育细胞 30min~至几个小时，通常 30-60min 即可。孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、 DCFH-DA 浓度有关。
活性氧（ROS）测定试剂盒说明书
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
NADH氧化酶（NOX）活性检测试剂盒说明书
NADH氧化酶（NOX可见分光光度法货号：BC0630规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件试剂一液体25 mL×1瓶4℃保存试剂二液体5 mL×1瓶4℃保存试剂三液体0.5 mL×1支-20℃保存试剂四液体70 mL×1瓶4℃保存试剂五液体10 mL×1瓶4℃保存试剂六粉剂×2瓶-20℃保存溶液的配制：试剂六：临用前加入9 mL双蒸水，用不完的试剂-20℃分装保存。
产品说明：NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD+。
该酶不仅参与NAD+的再生，而且与免疫反应密切相关。
NOX能够将NADH氧化为NAD+，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：1.准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10µL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆600g，4℃离心5min。
将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
3.将上清液转移至另一EP管中，即胞浆提取物，用于线粒体中泄露NOX活性测定。
4.沉淀即为线粒体，加入200µL试剂二和2µL试剂三，反复吹打充分混匀，用于NOX活性测定，并用于蛋白浓度测定。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一个广泛存在于植物、动物和微生物细胞中的有害物质，在细胞内氧化还原反应中扮演重要角色。
活性氧包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）等，具有强氧化性。
活性氧在正常细胞代谢和维持细胞信号传导途径中发挥重要作用，但在细胞内过量生成会对细胞结构和功能造成损害，引发细胞衰老和死亡，促进炎症反应，以及导致一系列疾病的发生，包括心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等。
活性氧检测是研究活性氧与细胞过程和疾病发生关系的重要手段。
常用的活性氧检测方法包括荧光探针染色法、电子自旋共振（electronspin resonance，ESR）法、流式细胞仪法、化学法等。
下面是一种基于荧光探针的活性氧检测实验方案，具体步骤如下：材料：1.细胞培养样本（如细胞系或原代细胞）2.活性氧检测荧光探针（如2',7'-二氯二羟苯基-4'-巯基吡啶，DCFH-DA）3.PBS（磷酸缓冲盐溶液）4.离心管5.无菌1.5mL离心管6.显微镜玻片7.荧光显微镜8.细胞培养基实验步骤：1.把细胞培养在合适的培养基中，保持在37°C的恒温培养箱中，条件合适时使其达到对照组的80%～90%接种度。
2.将细胞分装到离心管中，每支40mL细胞悬液。
3.加入DCFH-DA溶液，终浓度为10mM，使细胞充分吸收荧光探针。
将培养管放入37°C恒温培养箱中孵育30分钟以进行探针进入细胞。
4.将细胞洗涤剂去除，用PBS洗涤细胞3次以除去多余探针。
5.加入1mL的PBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中，以进行离心。
去除上清液，避免细胞牵涉。
6.加入1.5mLPBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中离心，去除上清液。
7.将取得的细胞悬液滴在显微镜玻片上，并加盖玻片。
在荧光显微镜下观察细胞活性氧的荧光信号强度。
细菌氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒产品说明书(中文版)
细菌氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细菌氧化应激活性氧高质荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在细菌氧化条件下，产生荧光，来定量检测细菌活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种实验用细菌菌株氧化应激活性氧的分析。
产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定，滞留持久，荧光清晰。
技术背景细菌作为模式生物，是环境化学毒性研究的常用工具。
活性氧的检测可以用于诸如多环芳烃化合物或重金属的毒性作用以及修复（remediation）的评价指标。
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。
氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氢荧光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升级产品，一种完全自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染色剂。
仪器操作规程-pH酸度计仪器设备使用说明书精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版
pH酸度计仪器设备使用说明书
1、检查仪器的使用环境。
检查内容包括实验室是否清洁、仪器放置的平台是否稳固、阳光是否直射、温湿度范围是否合理等。
2、检查仪器外观是否完整、有误破损之处。
3、清洁仪器外观。
4、检查复合电极不用时，是否充分浸泡3M氯化钾溶液中。
切忌用洗涤液或其他吸水性试剂浸洗。
5、开机试运行，使用前，检查玻璃电极前端的球泡。
正常情况下，电极应该透明而无裂纹；球泡内要充满溶液，不能有气泡存在。
预热30分钟。
检查运行状态是否正常。
6清洗电极后，不要用滤纸擦拭玻璃膜，而应用滤纸吸干, 避免损坏玻璃薄膜、防止交叉污染，影响测量精度。
7. 检查pH 玻璃电极的贮存环境，建议条件如下：短期贮存在pH＝4 的缓冲溶液中；长期贮存在pH＝7的缓冲溶液中。
8、使用完后pH 玻璃电极的清洗玻璃电极球泡受污染可能使电极响应时间加长。
可用CCl4 或皂液揩去污物，然后浸入蒸馏水一昼夜后继续使用。
污染严重时，可用5％HF 溶液浸10～20 分钟，立即用水冲洗干净，然后浸入0.1N HCl 溶液一昼夜后继续使用。
9、检查玻璃电极是否老化，若老化可以用氢氟酸浸蚀掉外层胶层，经常能改善电极性能。
若能用此法定期清除内外层胶层，则电极的寿命几乎是无限的。
10、检查干燥剂是否有效，若无效进行更换。
氧化应激检测试剂盒使用说明
氧化应激检测试剂盒使用说明氧化应激检测试剂盒北京华越洋生物超氧化物歧化酶测试盒(SOD)超氧化物歧化酶测试盒(SOD)碱性磷酸酶检测试剂盒谷胱甘肽一还原酶测试盒总巯基测试盒/总脂酶测试盒总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP法）总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法）总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）总抗氧化能力测试盒（比色法）总谷胱甘肽检测试剂盒总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒总SOD活性检测试剂盒（WST法）总SOD活性检测试剂盒（NBT法）脂质氧化（MDA）检测试剂盒脂褐质测试盒游离脂肪酸测试盒抑制与产生超氧阴离子自由基测试盒（比色法）乙酰胆碱转移酶测试盒乙酰胆碱酯酶测试盒一氧化氮检测试剂盒（硝酸还原酶法）一氧化氮检测试剂盒（化学法）一氧化氮合成酶测试盒胃蛋白酶测试盒维生素C测试盒微量丙二醛测试盒/脂质过氧化物测试盒唾液酸测试盒（带SA标准）糖化血清蛋白测试盒（果糖胺法）（带标准）胎盘碱性磷酸酶检测试剂盒酸性磷酸酶检测试剂盒神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒神经氨酸酶检测试剂盒乳酸脱氢酶测试盒乳酸测试盒（测血清、组织等）乳酸测试盒（测全血）醛缩酶测试盒羟脯氨酸测试盒（消化法）（测培养细胞、培养液）羟脯氨酸测试盒（碱水解法）（测动物血清、组织、尿液）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测试盒抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒抗氟离子酸性磷酸酶检测试剂盒肌酸激酶测试剂盒活性氧检测试剂盒活性氧（羟自由基）测试盒（比色法）琥珀酸脱氢酶测试盒红细胞NADH高铁血红蛋白还原酶测试盒过氧化氢酶测试盒（可见光比色法）过氧化氢定量分析试剂盒（脂兼容性）过氧化氢定量分析试剂盒（水兼容性）过氧化氢测试盒谷胱甘肽还原酶检测试剂盒谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒谷氨酰胺测试盒肝/肌糖元测试盒钙调神经磷酸酶测试盒蛋白去除试剂S蛋白去除试剂M胆碱酯酶测试盒超氧化物试剂盒超微量ATP酶测试盒（可测总ATPase）超微量ATP酶测试盒（测Na+ K-ATPase）超微量ATP酶测试盒（测Ca2+ Mg2+ ATPase）超微量ATP酶测试盒（测Ca2+ ATPase）超微量ATP酶测试盒（Na+ K+、Ca2+ Mg2+ ATPase）丙二醛测试盒/脂质过氧化物测试盒ROS活性氧检测试剂盒NF-κB激活－核转运检测试剂盒H5N1神经氨酸酶抑制剂鉴定试剂盒GSH试剂盒（谷胱甘肽测试盒）（比色法）GSH—PX测试盒GSH—ST测试盒Catalase（抗氧化酶）GSH和GSSG试剂盒CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒（WST法）ATP酶测试盒（组织及细胞膜需高速离心）ATP酶测试盒（组织及细胞膜不需高速离心）ATP检测试剂盒。
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PH0630|活性氧检测试剂盒
Reactive Oxygen Species Assay Kit
Catalog No：PH0603Size：☐100~500Tests Store at-20℃
活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种基于荧光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate）的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。
进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不会通透细胞膜，因此探针很容易被积聚在细胞内。
细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。
在最大激发波长480nm，最大发射波长525nm处，使用荧光显微镜，流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号。
Rosup为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析活性氧的真正水平。
根据检测体系和检测方法的不同，本试剂盒可测定100~500次。
试剂存储
冰袋运输。
-20℃干燥避光保存，有效期一年。
试剂组分
编号组分规格保存方法
PH0630-A DCFH-DA（10mM）0.1mL-20℃，避光保存
PH0630-B活性氧阳性对照（Rosup,100mM） 1.0mL-20℃，避光保存
使用说明
检测步骤
1.装载探针
1.1原位装载探针（仅适用于贴壁细胞）
①细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞汇合度达到50~70%。
【注】：必须保证细胞状态健康，且检测时不会过度生长。
②药物诱导：去除细胞培养液，加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。
（可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照（Rosup,100mM）到常用工作浓度100μM，加入细胞，一般37℃避光孵育30min-4h 可显著看到活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异。
【如，HeLa细胞孵育30min；MRC5人胚胎成纤维细胞1.5h；】
③探针准备：探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM。
④探针装载：吸除诱导用药物，加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。
加入的体积以能充分盖住细胞为宜。
如，对于6孔板通常不少于1000μl，对于96孔板通常不少于100μl。
37℃细胞培养箱内避光孵育30min。
⑤细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
1.2收集细胞后装载探针：适用于贴壁细胞和悬浮细胞。
①细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态健康。
按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。
②药物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。
（可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照（Rosup,100mM）到常用工作浓度100μM，加入细胞，一般37℃避光孵育30min-4h 可显著看到活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异。
【如，HeLa细胞孵育30min；MRC5人胚胎成纤维细胞1.5h；】
③探针准备：探针装载前，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM。
④探针装载：去除细胞内药物，离心收集细胞，加入适当稀释好的探针，使其细胞密度为1.0×106~2.0×107。
【注】：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法，以及检测总量来进行调整。
如，对于流式分析，单管检测内细胞数目不少于104，也不可多于106。
每隔3-5min 颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
⑤细胞清洗：用无血清细胞培养液洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
2、检测
原位装载探针法：激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
收集细胞后装载探针：用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。
3、参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
DCF
的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。
DCF的激发光谱和发射
光谱参考下图。
其他事项说明：
1）对于刺激时间较短（通常2h以内）的细胞，也可先装载探针，后用活性氧阳性对照和/或感兴趣药物刺激细胞，如阳性对照刺激，应先加入适量探针于37℃避光孵育30min；然后再加入等体积2×阳性对照Rosup溶液（200μM），37℃避光诱导30min-4h；
2）阳性对照Rosup通常浓度为100μM。
通常刺激后30min-4h可以观察到显著的活性氧水平升高。
对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。
如果在刺激后30min内观察不到活性氧的升高，可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。
如果活性氧升高得过快，可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。
3）对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1∶2000～1∶5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA 的浓度为2～5μM。
探针装载的时间也可以根据情况在15～60min内适当进行调整。
4）活性氧阳性对照（Rosup）仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
注意事项
1）探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2）探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
3）尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。