荧光探针汇总 (1)
第二节 荧光探针技术基本知识
phosphorescence, depending on the nature of the excited states.
The electron in the excited orbital is paired ( of opposite spin ) to second electron in the ground-state orbital. Consequently, return
—— Principles of Fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz
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（二）基态、激发态、单重态、三重态、激发单重 态、激发三重态
分子都含有不停地运动着的电子。根据量子学理论，运动 着的电子处于一系列不连续的能量状态（即能级），可以从一
个能级向另一个能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能 量的吸收和释放。一般情况下，电子总是处于能量最低的能级 （即基态, ground state）。在一定条件下，电子可以吸收能量 （如光能、电能、热能、化学能、摩擦能等）跃迁到较高能级 （即激发态, excited state），这个过程称为激发。处于激发态 的电子是不稳定的，它总是要跃迁回基态，并将多余的能量释 放出去。跃迁的方式可能是辐射跃迁，也可能是非辐射跃迁。 以非辐射方式跃迁，能量大多转化为热能。而以辐射方式跃迁， 能量则转化为相应的光，这个过程称为发射（发光）。
平均荧光寿命的计算公式： τ=1/（kf+ΣK）
kf： 荧光化合物的荧光发射速率常数； ΣK：各种非辐射去活化过程的速率常数的总和；
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荧光发射是一种随机过程，只有少数分子其发射是在t =
超全汇总!化学发光项目及临床意义(一)2024
超全汇总!化学发光项目及临床意义（一）引言概述：化学发光是一种重要的分析技术，在临床诊断、药物研发等领域发挥着重要作用。
本文将介绍超全汇总的化学发光项目及其临床意义，以帮助读者全面了解和认识这一领域的最新进展。
正文内容：一、荧光探针类化学发光项目1. 荧光标记的抗体：通过将荧光染料与抗体结合，实现对特定生物分子的定性和定量分析。
2. 生物传感器：利用荧光信号的变化来检测和监测生物体内的特定生物化学过程。
3. 荧光探针的靶向治疗应用：通过荧光探针的靶向传递，实现对肿瘤等疾病的精准治疗。
4. 基因检测和表达分析：利用荧光探针对基因序列和表达进行快速、敏感的检测和分析。
二、生物发光类化学发光项目1. 生物体内的荧光探针应用：通过注射荧光探针进入生物体内，实现对生物体内部分子和组织的实时成像和监测。
2. 荧光蛋白标记技术：通过将荧光蛋白与蛋白质结合，实现对蛋白质的生物学功能和表达进行研究。
3. 光生物传感器：利用生物发光过程反映生物化学反应的情况，实现对生物体内特定分子和活动的检测和监测。
4. 细胞内荧光成像：通过荧光探针对细胞内特定分子和结构进行高分辨率的成像和分析。
三、化学发光在临床诊断中的应用1. 肿瘤标志物检测：通过荧光探针检测肿瘤标志物的水平，实现早期肿瘤的筛查和诊断。
2. 无创检测技术：利用生物发光技术对人体表面的信号进行检测，实现无创体内分子的定量分析。
3. 荧光显微镜检查：通过荧光探针和显微镜技术对组织和细胞的分子信息进行高分辨率的成像和分析。
4. 药物代谢研究：利用荧光探针对药物在体内的代谢过程进行实时、定量的监测和分析。
四、化学发光在药物研发中的应用1. 荧光筛选技术：通过荧光信号的变化来评估化合物的药物活性，加速新药的发现和筛选过程。
2. 荧光探针在靶向药物递送中的应用：通过合成荧光探针，实现对药物在体内靶向递送的监测和评估。
3. 蛋白质相互作用研究：利用荧光探针对蛋白质之间的相互作用进行定量分析，帮助研究蛋白质功能和调控机制。
荧光探针定义
荧光探针定义
荧光探针（Fluorescence probe），又被称作荧光化学传感器，是一类具有特征荧光的分子，它们可以根据所处环境的性质的变化，如极性、折射率、粘度等，而灵敏地改变自身的荧光性质，如激发和发射波长、强度、寿命、偏振等。
荧光探针在紫外-可见-近红外区有较强的荧光信号，因此可以用于对不同物质或生物过程的检测和标记。
荧光探针的发光原理主要是基于荧光现象，即当物质受到激发后，能够释放出一种特定波长的光信号。
荧光探针的应用十分广泛，可以用于探测分子的浓度、位置和相互作用，例如蛋白质、核酸、离子和小分子等。
荧光探针在生物医学研究、药物开发、环境监测等领域都有重要的应用价值。
此外，荧光探针还可以通过与其他技术相结合，如显微镜、流式细胞术和光谱学等，来实现对生物体系的多维度观测和分析。
荧光探针具有成本廉价、灵敏度较高、操作简捷容易、能够远距离发光、选择性优良、不容易受外界电磁场的影响、稳定性高、不需要预处理等优点。
总的来说，荧光探针是一种重要的分析工具，具有广泛的应用前景和重要的科学价值。
常见的小分子荧光探针种类
常见的小分子荧光探针种类1.引言1.1 概述小分子荧光探针是一类被广泛应用于生物领域的化学工具，通过其具有的荧光性质，可以用于生物成像、药物传递、疾病诊断等方面。
小分子荧光探针具有分子结构简单、稳定性好、探测灵敏度高等特点，在生物学研究中起着重要的作用。
小分子荧光探针的种类繁多，根据其不同的结构和功能特点，可以分为许多不同的类别。
常见的小分子荧光探针包括有机荧光探针、金属配合物荧光探针、聚合物荧光探针等。
有机荧光探针是指由有机化合物构成的荧光探针，其分子结构多样，可以通过调整结构来实现特定的探测目标。
常见的有机荧光探针包括荧光染料、荧光蛋白等。
荧光染料具有较强的荧光强度和良好的化学稳定性，可以用于细胞成像、生物传感等领域。
荧光蛋白是一类来源于特定生物体的蛋白质，其具有自身天然的荧光性质，可以通过基因工程技术进行改造和调整，广泛应用于生物研究中。
金属配合物荧光探针是指由金属离子与配体形成的荧光探针，其具有较强的荧光性能和较长的寿命。
金属配合物荧光探针具有选择性较高的特点，可以用于特定金属离子的探测和诊断。
常见的金属配合物荧光探针包括铜离子、锌离子、铁离子等的配合物。
聚合物荧光探针是指由高分子聚合物构成的荧光探针，其具有较好的溶解性和稳定性。
聚合物荧光探针可以通过调整聚合物的结构和链长来实现特定的探测需求。
常见的聚合物荧光探针包括聚合物分子探针、聚合物纳米探针等。
总之，常见的小分子荧光探针种类繁多，具有不同的结构和功能特点，可以根据具体的研究需求选择适合的荧光探针进行应用。
这些小分子荧光探针为生物学研究提供了有力的工具，有助于深入理解生命的基本过程和疾病的发生机制。
未来，随着技术的不断发展和突破，相信小分子荧光探针在生物领域的应用会得到更广泛的推广和应用。
1.2文章结构1.2 文章结构本文主要围绕"常见的小分子荧光探针种类"展开讨论。
文章分为引言、正文和结论三个部分。
在引言部分，将进行概述、文章结构和目的的介绍。
常用荧光探针小结
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视频：The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation
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三、异硫氰酸罗丹明（TMRITC）
四甲基异硫氰酸罗达明，它是一种紫红色粉末，较稳定。其最 大吸收光谱为550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC 的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同TITC。它可用于双标记 示踪研究。
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Endothelial cells under the microscope. Nuclei are stained blue with DAPI, microtubles are marked green by an antibody and actin filaments are labelled red with phalloidin.
性状多年不变，室温下也能保存两年以上。异构体I、II均 能与蛋白质良好结合，但异构体I的荧光效率更高，与蛋白 质的结合也更稳定。 FITC的最大吸收光谱为490----495纳 米，最大发射光谱为520-530nm，呈明亮的黄绿色荧光。 FITC含有异硫氰基 ， 在碱性条件下能与IgG的自由氨基 （主要是赖氨酸的-氨基）形成荧光抗体结合物。
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五、溴化乙锭
详见第四节“应用于核酸检测的荧光探针技术”
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六、DAPI （ 4‘,6-diamidino-2-phenylindole）
DAPI was first synthesised in as part of a search for drugs to treat trypanosomiasis. Although it was unsuccessful as a drug, further investigation indicated it bound strongly to DNA and became more fluorescent when bound.
荧光探针的研究及应用
荧光探针的研究及应用随着科技的不断发展，荧光探针逐渐成为生命科学研究领域中不可缺少的重要工具。
荧光探针是一种能够发射出荧光信号的分子，在分子生物学、生物医学和化学生物学等领域中有着广泛的应用。
它们可以被用来研究细胞内的分子相互作用、识别生物分子、分析细胞功能，并可以在体内用作活体成像和药物筛选的工具。
本文将简要介绍荧光探针的基本原理、常见的荧光探针类型和其在生物学研究中的应用。
一、荧光探针的基本原理荧光探针的基本原理是荧光共振能量转移（FRET），其通过将荧光分子与生物分子（生物样品）耦合，使两者之间发生相互作用，从而产生能量转移。
FRET 能量转移是从能量接受者的激发态到另一个分子的荧光染料的发射态的一种非辐射性能量转移。
在FRET中，激发荧光染料的光子会被共振耦合到另一个染料的激发态，从而使其发出荧光光子。
这样，在激发荧光染料的时候，可以用荧光染料的荧光光子来检测另一个染料的存在和位置。
荧光探针对于荧光光子的发射特征和其它的生化参数是很敏感的，所以它们可以被用来探测各种细胞和分子。
二、常见的荧光探针类型1. 荧光染料：荧光染料是最常见的荧光探针类型之一，它们有着广泛的应用，可以被用来标记蛋白质、核酸等生物分子。
常见的荧光染料包括荧光素、草铵膦、偶氮染料等。
2. 荧光蛋白：荧光蛋白是一种具有自发荧光性质的蛋白质，其最早源自于水母Aequorea victoria。
荧光蛋白可以用来跟踪胞内或胞外的重要过程，如蛋白质、核酸合成、信号传递等。
3. 量子点：量子点是一种半导体纳米粒子，具有窄的发射光谱、强的光稳定性和较大的荧光量子产率。
这些特点使得量子点成为新一代高亮度及高灵敏度的荧光探针。
三、荧光探针在生物学研究中的应用荧光探针广泛地应用于细胞内信息传递、化学生物学、生物传感、药物筛选和临床诊断等方面。
以下为举几个常见的案例：1. 细胞内信息传递：荧光探针可被用于研究细胞内信号转导、磷酸化和蛋白质相互作用等过程。
钾离子响应荧光探针
钾离子响应荧光探针
钾离子响应荧光探针是一类用于检测和测量钾离子浓度的荧光化学传感器。
这些探针通过与钾离子结合后发生荧光信号变化的原理来工作，可以用于细胞内或细胞外的钾离子检测。
以下是一些常见的钾离子响应荧光探针：
1. 比率钾传感器-1（RPS-1）：这是一种双荧光探针，设计用于细胞内的钾比例计量。
它包含一个钾敏感染料PS525和一个钾不敏感的内标荧光团香豆素343。
RPS-1能够通过基于强度的开启响应来匹配静息细胞内高水平的K+池。
2. PBFI AM：这是一种细胞渗透性的钾敏感荧光探针，用于测量细胞和细胞内区室中的钾变化。
PBFI AM在进入细胞后被酯酶水解生成PBFI，其对钾的亲和力是钠依赖性的。
PBFI AM 具有特定的吸收和发射波长，使其适用于荧光检测。
3. IPG系列探针：由ION Biosciences开发，这些探针是传统K⁺荧光探针如PBFI的替代品。
IPG 系列探针与常见的滤光片兼容，并且提供多种亲和力选项，适用于不同的应用需求，如检测胞外或胞内K⁺的动态变化。
总的来说，这些探针的设计和应用为生物学和医学研究提供了强大的工具，尤其是在研究细胞生理学和钾离子通道功能方面。
通过使用这些探针，科学家可以更准确地监测和分析钾离子在细胞活动中的作用，从而推动相关疾病治疗和药物开发的进步。
荧光探针
荧光分子探针的结构
荧光分子探针通常由三部分组成：
Fluorephore Spacer
识别基团（receptor） hv
荧光基团（fluorophore）
连接体部分（spacer）
F
S
Receptor R
Analyte
strongly fluorescent
荧光探针
什么是荧光探针？
荧光探针就是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长 光的激发下使指示剂产生荧光,通过检测所产生的荧光实 现对被检测物质的定性或者定量分析。
荧光探针受到周围环境的影响，使其发生荧光发射 发生变化，从而使人们获知周围环境的特征或者环境中 存在的某种特定信息。
荧光低 不需预处理 不受外界电磁场影响 远距离发光
Thanks for attention
经典分子信标结构
分子信标在生物分子检测中的应用
实时监测聚合酶链反应 基因变异的检测 分子信标生物传感器 活细胞中RNA的检测 DNA与蛋白质相互作用研究
展望
随着荧光探针技术的不断发展和完善,必然会给目前 较为热门的基因组学、蛋白质组学、生物芯片以及等 药物作用机制等领域带来新的发展契机，提供非常有 价值的方法和信息。
识别基团决定了探针分子的选择性和特异性，荧光基 团则决定了识别的灵敏度，而连接体部分则可起到分 子识别枢纽的作用。
荧光基团和识别基团二者连接在同一个共轭体系中，荧 光基团是该体系中最基本的组成部分，一般为芳香族的 稠环化合物，其目的是将分子识别转换成不同形式的荧 光信号，如荧光强度的增强或减弱、荧光寿命的变化、 光谱的移动等。识别基团是为了实现这一选择性识别而 合成的探针结构单元，是决定荧光分子探针和被检测体 结合的灵敏度与选择性的部分，通常也称为受体。
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1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针）原理Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。
Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。
生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度激发波长506nm 发射波长526nm （绿色）备注推荐使用2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针）原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。
Fura-2?AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。
Fura-2可以和钙离子结合，结合钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380nm激发光下则会导致荧光减弱。
这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗漏，细胞厚度差异等一些误差因素。
生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度激发波长为340nm和380nm 发射波长510nm （蓝色）备注仪器滤光片不适用3Fluo-4-AM （钙离子荧光探针）原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。
由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。
所以用氩激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。
由于Fluo 4与钙离子的亲和力和Fluo 3近似，所以使用上和Fluo 3也基本相同生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度激发波长494nm 发射波长516nm （绿色）备注用激光器激发时荧光强度强，因此不推荐4.DCFH-DA （活性氧荧光探针）原理DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。
细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度激发波长485nm 发射波长520nm （绿色）备注推荐使用5.DHR 123 （活性氧荧光探针）原理本身无荧光, 在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化, 转变成发射绿色荧光的罗丹明123 (Rhodamine 123), 因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS), 如过氧化物, 次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。
生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度激发波长507nm 发射波长529nm （绿色）备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响6.RhodamineI23 （线粒体膜电位荧光探针）原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。
生理意义标记线粒体膜电位激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm （绿色）生理意义检测线粒体膜电位备注正在使用7.Hoechst 33342 （DNA荧光探针）原理Hoechst 33342是一种可对DNA 染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。
Hoechst染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强烈的蓝色荧光。
生理意义标记双链DNA激发波长355nm 发射波长465nm （蓝色）备注正在使用8.FDA原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。
生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力激发波长495nm 发射波长520nm （绿色）备注正在使用9.PI （DNA荧光探针）原理它不能透过完整的细胞膜，但能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜而将细胞核染红，与细胞核中的DNA结合的PI发出的荧光，与未结合的PI相比，强度会增强20-30倍。
生理意义检测死细胞及凋亡晚期细胞激发波长530nm 发射波长615nm （红色）备注尝试过，但效果不好10.EB （核酸荧光探针）原理EB，不能透过细胞完整的细胞膜。
溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。
它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。
在高离子强度的饱和溶液中，大约每个碱基插入一个溴化乙锭分子。
当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。
这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。
生理意义检测死细胞激发波长545nm 发射波长605nm （红色）备注有强致癌性，不推荐11.DAPI （DNA荧光探针）原理DAPI可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，产生比自身强20多倍的荧光，且对活细胞无毒副作用。
和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。
DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。
生理意义标记凋亡和死细胞的DNA激发波长364nm 发射波长454nm （蓝色）备注与Hoechst功能相近，可以尝试12. Calcein AM原理Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。
当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色荧光，且细胞毒性很低，适合用于活细胞染色。
生理意义检测细胞膜完整性激发波长494nm 发射波长517nm （绿色）备注跟FDA功能类似，细胞毒性很低，可以长时间标记细胞，但价格比较贵13.BCECF-AM (pH荧光探针)原理BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被滞留在细胞内。
BCECF在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。
生理意义检测细胞内pH激发波长490nm 发射波长526nm （绿色）备注感觉意义不大14.Tubulin-Tracker Red (微管红色荧光探针)原理Tubulin-Tracker?Red探针为荧光染料Alexa Fluor 555标记的抗α-Tubulin小鼠单克隆抗体(克隆号为DM1A)，可以识别α-Tubulin的425-450aa。
可以用于人、小鼠、大鼠、牛、猪、豚鼠和禽类(avian)样品α-Tubulin的检测。
生理意义标记细胞内微管激发波长555nm 发射波长565nm （红色）备注红色荧光比较难拍，且价格较贵，作为筛选用可行性不大，可做机制研究用15. Lyso-Tracker Red (溶酶体红色荧光探针)原理Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。
中性红(Neutral?Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。
生理意义标记细胞溶酶体激发波长577nm 发射波长590nm （红色）备注红色荧光比较难拍，且价格较贵，作为筛选用可行性不大，可做机制研究用16. Golgi-Tracker Red (高尔基体红色荧光探针)原理? Golgi-Tracker?Red为采用Molecular?Probes公司的BODIPY?TR进行了荧光标记的C5-ceramide。
Ceramide或其类似物可以选择性地和高尔基体结合，因此荧光标记的ceramide可以用作高尔基体特异性的荧光探针。
生理意义标记细胞高尔基体激发波长589nm 发射波长617nm (红色)备注红色荧光比较难拍，且价格较贵，作为筛选用可行性不大，可做机制研究用17. ER-Tracker Red (内质网红色荧光探针)原理ER-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的BODIPY TR进行了荧光标记的glibenclamide。
Glibenclamide即glyburide，中文名为格列苯脲，是一种2型糖尿病治疗药物，可以结合主要定位在内质网上的sulphonylurea受体。
因此荧光标记的glibenclamide就可以用作内质网特异性的荧光探针。
ER-Tracker Red对于细胞的毒性极低。
生理意义标记细胞内质网激发波长587nm 发射波长615nm备注红色荧光比较难拍，且价格较贵，作为筛选用可行性不大，可做机制研究用18. Mito-Tracker Green (线粒体绿色荧光探针) (绿色)原理Mito-Tracker?Green为采用Molecular?Probes公司的carbocyanine进行了荧光标记的一种Mito-Tracker，可以用作线粒体特异性的荧光探针。
和rhodamine?123或JC-1相比，Mito-Tracker Green对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。
生理意义标记细胞线粒体激发波长490nm 发射波长516nm备注与罗丹明123不完全相同，可以考虑一试19. DiI （细胞膜红色荧光探针）原理最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光。
DiI是一种亲脂性膜染料，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。
DiI在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。
生理意义标记细胞膜激发波长549nm 发射波长565nm （红色）备注红色荧光比较难拍，且价格较贵，作为筛选用可行性不大，可做机制研究用。