纤维素酶的生产及分离纯化

随着人们对纤维素酶研究工作的深入，纤维素酶必将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用。如何加大对纤维素酶研究和开发的科技投入和经费投入，改变目前规模小、工艺设备落后、菌种酶活低、生产成本高、生产技术水平低下的现状，尽快采用各种行之有效的高新技术，发展具有中国自己知识产权的新酶种、新产品、新剂型，满足市场的需求是当务之急。同时，动物纤维素酶与微生物酶系有所不同，作为一个新的纤维素酶体系，它的研究也具有重大的理论价值，因此，可能成为纤维素酶研究的热点。
(6)电泳：电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。当把一个带净电荷的颗粒放入电场时，就会受到电场力的作用，带电颗粒在电场中向一定方向泳动，速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和黏度成反比。当颗粒是两性电介质性质的蛋白质分子时，它在一定pH溶液中电荷量是独特的。由于不同的蛋白质等电点和分子量是不同的，因此经泳动后就形成了泳动度不同的区带。利用此性质，可以将混合液中不同的蛋白质区分开，同时也可以对其纯度进行测定。现在电泳法已成为开展生物化学和分子生物学研究的必不可少的常规工具。
其生产工艺过程是将玉米秸秆粉碎至20目以下，进行灭菌处理后，送发酵釜内发酵，同时加入纤维素酶菌种，发酵时间约为70 h，控制温度低于60℃，将净化后的无菌空气从釜底通入，进行物料的气流搅拌，发酵完的物料经压滤机压滤、超滤浓缩、喷雾干燥，制得纤维素酶产品。其流程为:
空气→过滤
↓
原料→发酵罐→浸泡→粗滤→超滤提取→成品
物质被起始缓冲液洗涤出来，形成了第一个层析峰；然后适当地改变起始缓冲液的pH或增加离子强度等方法，把物质S从固相载体上解离下来，并形成第二个层析峰，可以将有效成分与杂质较好地分离开来。使用亲和层析法，不论加入何种样品液，由于柱体积小、上样量大、洗脱流速快等原因，都只能得到一个层析峰，所以分辨率高。本法广泛应用于分离纯化蛋白质、核酸、激素等物质。
２，液体发酵法
液体发酵生产时，将原料送入发酵罐内发酵，同时接入纤维素酶菌种。发酵过程中，需要从发酵罐底部通入无菌空气对物料进行气流搅拌，发酵完后的物料经过处理可得到纤维素酶产品。液体发酵法生产纤维素酶，原料利用率高，生产条件易控制、产量高、劳动强度小、产品质量稳定，但动力消耗大，设备要求高。液体深层发酵的方法具有培养条件容易控制，不易染菌，生产效率高等特点。因此，目前此方法是大规模生产的可行方法。
(1)盐析法：盐析法就是在溶液中加入中性盐使各种蛋白质依次分别沉淀的方法。其原理是根据蛋白质在溶液中由于表面带电的氨基酸残基与溶剂分子(H20)相互作用，所以能保持溶解状态，当加入盐离子时，蛋白质分子周围所带电荷增加，促进了与溶剂分子的相互作用，使溶解度增加，此现象称为盐溶，在盐浓度较低时以这种情形为主；但当盐浓度继续增加达到一限量，大量盐离子使水浓度相对降低，蛋白质的水化作用减弱，相互凝聚而沉淀下来，称为盐析。选择一定浓度范围的盐(如0～25％饱和度硫酸铵)使杂质蛋白沉淀而有效成分呈盐溶状态，经离心分离得到上清液后，再选择一定浓度范围的盐溶液使有效成分等物质呈盐析状态而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。此法是蛋白质进行分级沉淀时常用操作步骤，常选用的盐是硫酸铵。
(4)离子交换层析：离子交换层析是根据物质所带电荷的差别进行分离纯化的方法。离子交换剂以纤维素、葡聚糖凝胶等不溶性物质为母体，通过酯化、醚化或氧化等化学反应，引入阳性或阴性离子的特殊制剂，可与带相反电荷的化学物质进行交换吸附。对于呈两性离子的蛋白质、酶类、多肽等物质与离子交换剂的结合力，取决于它们的物理化学性质和特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于等电点(pI)时，被阳离子交换剂吸附；反之被阴离子交换剂吸附。对于呈胶体状态的大分子物质一般使用选择性好的弱酸性离子交换剂。离子交换层析法是常用的层析方法之一，广泛应用于多种生化物质的分析、制备、纯化等。
(5)高效液相色谱(HPLC)；又称为高速或高压液相色谱，其分离或纯化各种化合物的原理基本上与普通的液相层析相似。但高效液相色谱具有灵敏、快速、分辨率高及重复性好等特点，不仅适用于很多不易挥发，难热分解物质(如蛋白质、氨基酸及其衍生物、核酸、激素、单糖、寡糖等)的定性和定量分析，而且也适用于上述物质的制备和分离。特别是近十年来出现了几种与HPLC相近的快速蛋白液相色谱(FPLC)，低压液相色谱(LPLC)和中压液相色谱(MPLC)，其中FPLC能在惰性环境下，以极快的速度通过成百上千次层析把复杂的混合物分开，如果连续进样，短时间内能制备出大量的欲纯化物质。
(2)凝胶过滤：凝胶过滤又叫分子筛层析，是利用分子筛效应分离纯化生物大分子和测定其分子量及样品脱盐的一种色谱方法。凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致的球状颗粒。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子物质，而不能排阻某些小分子化合物。当样品进入色谱柱时，由于被分离物质的分子质量不同。较大的分予不能通过孔道进入凝胶颗粒的微孔内部，与流动相一起先流出色谱柱；分子质量小的物质可通过部分孔道，更小的分子可通过任意孔道进入珠体内部。这样小分子向下流动的速度必然比大分子慢，结果是分子质量大的物质先从柱中流出，分子质量小的则后从柱中流出而达到分离的目的。凝胶过滤具有设备简单、操作方便、重复性好及样品回收率高等特点，所以该方法除了常用于分离纯化蛋白质，核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质外，还可测定蛋白质的分子量、样品浓缩和脱盐等方面。
纤维素酶
纤维素酶编号：EC3.2.1.4。它是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用，是可以将纤维素分解成多糖或单糖的蛋白质或ＲＮＡ。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木酶属、曲霉属和青霉属。
纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。
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种子→摇瓶(床)
纤维素酶的分离纯化
纤维素酶的组分大多为糖蛋白，工业上用于生产纤维素酶的粗酶制剂常采用硫酸铵沉淀法、酒精沉淀法、丹宁沉淀法和离心喷雾干燥等方法。但在纤维素酶分析研究上主要采用一系列蛋白质分离纯化技术，如分级沉淀、色谱法、电泳法等。目前，对粗酶的提取大多采用硫酸桉分级沉淀法；对酶活力的测定国际上一般采用Horikoshi方法；对蛋白质的测定按考马斯亮蓝(Bradford)法；还原糖的测定采用３,５一二硝基水杨酸(DNS)法。以下介绍一些常用的纯化方法：
(3)亲和层析：亲和层析的原理与抗原一抗体、酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力，在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力。将具有识别能力的载体L以共价键的方式固化到含有活性基团的基质M上，制成亲和吸附剂M－L，又称为固相载体。当把固相载体装入小层析柱后，将欲分离的样品液通过该柱。此时样品中对配体有亲和力的物质S可借静电引力、范德华力等作用吸附到固相载体上，无亲和力的
纤维素酶的生产方法：
１，固体发法
固体发酵法以玉米、稻草等植物秸秆为主要原料生产纤维素酶。该法投资少，工艺简单，产品价格低廉。然而固体发酵法存在着根本上的缺陷——不可能像液体发酵那样随着规模的扩大，大幅度降低成本。以秸秆为原料的固体发酵法生产的纤维素酶很难提取和精制。目前生产厂家只能采用直接干燥、粉碎来得到固体酶制剂，或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂，产品外观粗糙，质量不稳定，杂质含量高；劳动强度大、生产效率低；易污染杂菌。国内外对木霉纤维素酶的研究较多，但木霉一方面毒性嫌疑大，使之应用受到限制；另一方面普遍存在着β-葡萄糖昔酶活力偏低的缺陷，致使纤维二糖积累，影响了酶解效率。