第三章 动、植物细胞培养产酶

早在1907年，美国的Harrison在世界上首次将蛙的神经组织 在试管内培养成功，建立起动物组织体外培养的第一块基石。 1950年前后，Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细 胞中生长病毒的报告，开拓了以动物病毒为研究对象的新领域。 作为大规模细胞培养，Copsik等人成功的进行了有关仓鼠 肾细胞的悬浮培养。
细胞株是通过选择或克隆化培养，从原
代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、
生化特性或特异标记的细胞群。
细胞系是由原先组成原代培养物的所有
细胞类型组成。
小鼠组织块 ，用胰蛋白酶处理后变成单个细胞， 24h后（贴壁生长）的成纤维细胞
四、培养条件的影响与控制 1.温度：一般控制在36.5℃. 2.pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。 3.渗透压: 应与细胞内渗透压相同。 4.溶解氧：根据情况随时调节。
第三章
动、植物细胞培养产酶
动、植物细胞培养是通过特定技术获得优良 的动、植物细胞，在人工控制条件的反应器中 进行细胞培养，获得所需产物的过程。
与微生物细胞相比，动物细胞和植物细
胞具有各自不同的特性，需采用各自不同
的培养工艺。
动物细胞模式图
植物细胞结构
动物细胞
植物细胞
植物、动物、微生物细胞的特性比较
目前，利用动物细胞培养的方法生产的有用产品
a.疫苗
b.激素
c.多肽生长因子 d.酶 e.单克隆抗体 f.非抗体免疫调节剂
一、动物细胞培养的特点
1.细胞生长速度慢（需添加抗生素）
2.细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感
3.反应过程成本高，产品价格贵 4.细胞具有锚地依赖性 5.原代细胞一般繁殖50代
2.大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无 菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA的液体MS培 养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条 件下震荡培养12d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入 含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中， 25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。
四、培养条件的影响与控制 1.温度 2.pH 3.通气与搅拌 4.光照的控制 5.前体的添加 6.诱导子的应用
五、植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例 1.大蒜愈伤组织的诱导
选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先 用70%乙醇消毒20s，再用0.1%氯化汞消毒10min，然后无菌水 漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d 光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。
胡萝卜和烟草的组织培养。
1966年Klein指出，能利用植物细胞培养物代替收 集或栽培植株来生产生化制品。
近年来通过植物细胞培养产酶的研究已经取得可喜进展
一、植物细胞培养的特点
1.提高产率 2.缩短周期 3.易于管理、减轻劳动强度 4.提高产品质量 5.其他
二、培养基的特点 应用最广的是MS培养基和LS培养基 MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为 烟草细胞培养而设计的培养基。LS培养基是在 其基础上演变而来的。
细胞培养的目的及其在研究工作中意义： 目的是获得细胞产物 1.能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动。
2.便于使用各种不同的研究技术对细胞进行研究。
3.易于附加物理、化学、生物药物等实验因素。 4.能同时提供大量生物性状相似的实验材料。
三、动物细胞培养方式
细胞培养是指离体细胞在无菌培养条件下的分 裂、生长，在整个培养过程中细胞不出现分化， 不再形成组织。
随着基因工程技术的发展，人们逐渐认识到有许多基因产 物不能在原核细胞内表达，它们需要经过真核细胞所特有的翻 译后修饰，以及正确的切割、折叠后，才能形成与自然分子一
样的功能和抗原性。使得动物细胞一跃成为一种重要的宿主细
胞，用以生成多种生物制品等。这些采用大规模细胞培养技术 生产贵重药品在临床诊断、治疗和预防等方面都有重要意义。
染物所破坏。支原体对动物细胞培养的威胁最大，因
为其感染力强且不易检出。
因此，大规模细胞培养成功的必要条件是要有一个
设备精良的细胞库。在细胞库中的冷冻细胞不受污染。
动物细胞培养基的配方十分复杂，并且还需补充血清 原料的质量控制和培养基的生产是大规模细胞培养的 主要问题 因为血清来源困难，质量不稳定，残留血清给产物提 纯带来困难等
动物细胞的体外培养的条件 动物细胞的体外培养，模拟体内的条件， 因此，其重要的条件可以概括为无菌、生 长环境和营养。
培养的动物细胞的存活
渗 透 压
水 的 质 量
营 养 条 件
气 体 条 件
温 度 条 件
PH 条 件
无 菌 条 件
五、动物细胞培养产酶实例
以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原活化剂（tPA)为例
动物细胞培养与微生物培养的不同点
a.动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差； b.生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素； c.大多数动物细胞需附着在固体或半固体的表面生长； d.对营养要求严格； e.大规模培养时，不可简单地套用微生物培养的经验。
动物细胞生长十分缓慢，并易为大多数微生物污
3.酶的分离纯化
细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞 破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。
第二节 动物细胞培养产酶 由于动物细胞体外培养具有明显的表达产物 的优点，为传统微生物发酵所无法取代，因此， 生物技术中许多有价值的生物制品，需要借助 于动物细胞培养而获得，这种需求极大地促进
了动物细胞培养技术的发展。
三、培养方法：——悬浮细胞培养
①细胞株的建立（外植体与愈伤组织） ②扩大培养 ③大罐培养
外植体： 从植株取出，用于植物组织培养的植物组织（包括 根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。 愈伤组织：
将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左右培 养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。
水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织
3.细胞培养的目的及其在研究工作中意义？ 4.动植物细胞培养产酶有何特点？ 5.举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程？
是一种丝氨酸蛋白酶，它可以催化纤溶酶原水解，生成纤
溶酶，它能催化血栓中的血纤维蛋白水解，对血栓性疾病有
显著疗效。
人黑色素瘤细胞培养生产tPA的工艺过程
人黑色素瘤细胞培养基的配制
人黑色素瘤细胞培养
tPA的分离纯化
思考题： 1.微生物、动物和植物细胞之间的差异主要有那些？
2.简述动植物细胞培养的工艺条件及其控制措施？
三者之间的差异主要有：
植物细胞>动物细胞>微生物细胞。
动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。
植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。
植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。
植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。
植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。
பைடு நூலகம்
第一节
植物细胞培养产酶
1902年，德国植物学家G.Haberlandt就预言植物细 胞培养的可能性。 1937年前后，法国和美国科学家分别成功的进行了
二、培养基 1.天然培养基 2.合成培养基 3.无血清培养基
天然培养基包括
体液 组织提取液 市售各种血清 水解乳蛋白 胶原 鸡血浆，鸡胚浸出液
合成培养基的主要成份有：
氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、其
它辅助物质
无血清培养基
目前，大多数动物细胞的体外培养，都不同程
度地依赖血清等天然培养基。无血清培养基的 研制是细胞工程中的一个重要课题。
细胞种类 植物细胞 微生物细胞
1～10 0.3-6 简单
动物细胞
10～100 ﹥15 复杂
细胞大小/um 200～300 倍增时间/h 营养要求 ﹥12 简单
光照要求
对剪切力 主要产物
大多数要求
敏感
不要求
大多数不敏感
不要求
非常敏感
色素、药物、 醇、有机酸、氨 疫苗、激素、 香精、酶等 基酸、抗生素、 单克隆抗体、 核苷酸、酶等 酶等
培养动物细胞的步骤
1.无菌取出目的细胞所在的组织用培养液漂洗干净；
2.用无菌刀割掉多余部分并切成小组织块； 3.小组织块置于解离液中离散细胞； 4.低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移到培养瓶中。
动物细胞培养：
1.悬浮培养
方式 2.贴壁培养
3.固定化细胞培养
微导管培养法
微载体培养法
微胶囊培养法