3.定量PCR实验设计和流程
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。
实验室应该保持干燥、清洁和无菌。
检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。
2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。
在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。
同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。
3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。
可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。
同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。
4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。
反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。
5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。
引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。
引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。
6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。
注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。
7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。
可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。
计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。
总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。
在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR原理与实验流程
林天时 王秋泉 Field Application Scientist 400 820 8982 / 800 820 8982 - 2 - 3 cnmcbsupport@
Life Technologies™ Proprietary | 1
实时荧光定量PCR技术原理
•ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统
Channel 1 2 3 4 5 6 Proprietary | 54 Life Technologies™ Dye Examples FAM™, SYBR®, SYTO®9 (MeltDoctor™), Fluorescein, SYPRO® Orange VIC®, JOE™, TET™, HEX™ NED™, BODIPY® TMR-X，TAMRA™ ROX™, Texas Red® LIZ™ Alexa Fluor®, Joda-4 Excitation Wave Lenthgh 455~485nm 510~530nm 540~550nm 570~590nm 630~650nm 650~670nm Emission Wave Lenthgh ~520nm ~550nm ~580nm ~620nm ~680nm ~710nm
455~485nm
•7500实时荧光定量PCR系统
Channel 1 2 3 4 5
Life Technologies™ Proprietary | 52
Dye Examples FAM™, SYBR® VIC®, JOE™ NED™, Cy3，TAMRA™ ROX™, Texas Red® CY5 Dye™
定量PCR如何工作?
• PCR反应液加入了 各种类型的荧光标记物
一个PCR循环
定量PCR的实验流程及注意事项
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
扩增子设计
● 扩增子长度：75-200bp ● 避免二级结构 ● 利用mFold 分析二级结构
借助熔解曲线分析结果
10,000 copies of input nucleic acid
80 copies
Amplicon
Nonspecific product
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
好的引物及扩增子设计
● 提高扩增反应的效率 ● 提高反应的特异性、减少非特异性扩增 ● 提高产量和灵敏度 ● 减少多重PCR的交叉影响
准确、可重复的结果
引物设计
● 避免二级结构 ● GC含量控制在50-60% ● 连续的G或C不超过3个碱基 ● 5’末端不含G
通过引物设计提高特异性
● BLAST ● 使用SYBR Green方法时考虑到以后采用探针法 ● 进行多重PCR的可能 ● 测试多个引物对 ● 选择无引物二聚体且扩增效率最高的引物对
未知样品 标准品梯度 阳性对照 阴性对照 基因组对照
● 校准生物学误差：看家基因 ● 降低其余误差： 样品重复实验
重复
● 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 ● 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） ● 理想的重复:
¾ 准备反应体系master mix, 包括样本 ¾ 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 ¾ 分装mix时使用一个枪头 ¾ 充分旋涡震荡5秒以上
定量PCR实验设计和流程
定量PCR实验设计和流程定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种用于测定DNA或RNA的相对或绝对数量的实验技术。
其基本原理是通过PCR扩增目标序列的DNA或RNA，然后利用荧光探针或染料测定PCR产物的数量。
以下是定量PCR实验的一般设计和流程：1.设计引物和探针：首先选择目标序列并设计引物和探针，引物应与目标序列能够特异性结合，而探针能够标记PCR产物并产生荧光信号。
设计引物和探针时需要考虑其长度、碱基组成和Tm值，以确保特异性扩增和最佳PCR反应条件。
2.样本处理：根据实验目的，收集样本并进行必要的处理，如提取DNA或RNA。
对于目标序列低浓度的样本，可能需要进行前处理步骤，如放大或浓缩。
3. 反应体系制备：准备PCR反应的组分，包括DNA或RNA模板、引物、探针、逆转录酶（如果需要进行逆转录反应）和PCR Master Mix（包含聚合酶、缓冲液和核苷酸等）。
4.PCR扩增反应：将反应体系加入PCR管或板中，然后进行PCR扩增反应。
PCR反应一般包括预变性（或逆转录）步骤、热循环扩增步骤和终止步骤。
热循环扩增步骤一般包括一系列温度变化，如变性、退火和延伸，以使DNA或RNA产生扩增。
热循环扩增的温度和时间可以根据实验设置。
5.荧光信号检测：采用荧光实时定量PCR仪检测PCR反应产物的荧光信号。
荧光探针一般会与PCR产物结合并产生荧光信号。
通过监测荧光信号的累积量，可以了解PCR反应的进程以及目标序列的相对或绝对数量。
6.数据分析：利用荧光信号检测得到的数据，进行相对或绝对定量。
相对定量是通过比较不同样本或不同时间点的荧光信号，来推断目标序列的相对数量。
绝对定量则需要使用标准曲线法，根据已知浓度的标准品的荧光信号，来计算未知样本中目标序列的绝对数量。
7.结果解读和验证：根据数据分析的结果来解读实验结果，比较不同样本之间的信号差异，并验证定量PCR实验的可靠性。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
PCR实验室操作流程
PCR实验室操作流程PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种可以通过体外合成DNA的方法，也是现代生物技术中一项重要的分子生物学技术。
PCR技术的应用广泛，包括基因测序、基因突变检测、表达定量等。
下面是PCR实验室操作的一般流程。
1.设计引物：PCR实验的第一步是设计引物。
引物是用于扩增目标DNA片段的短链DNA序列。
两个引物分别对应目标序列的两端，其长度通常在18-24个碱基对之间。
引物的碱基序列必须与目标序列互补，以确保引物的结合和扩增特异性。
2. 制备PCR反应液：将PCR反应所需的试剂制备成PCR反应液。
PCR 反应液包括模板DNA、引物、聚合酶、反应缓冲液、dNTPs和Mg2+等。
聚合酶可以是常见的Taq聚合酶，也可以是其他高保真度的热稳定聚合酶。
反应缓冲液包含缓冲盐、pH调节剂和聚乙二醇等成分。
3.加热变性：PCR反应开始前，需要对DNA模板进行热变性，将其双链DNA解开成单链DNA，以供引物结合。
一般在95℃左右进行加热变性步骤，持续1-5分钟。
4.循环扩增：PCR实验主要包括循环扩增的步骤。
循环扩增主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
变性温度一般设置在94-98℃，可以使DNA双链变为单链；退火温度根据引物序列的特性来设计，一般设置在50-70℃之间，可以使引物与DNA模板序列结合；延伸温度一般为72℃，此温度下聚合酶能够合成新的DNA链。
5.PCR循环反复：PCR反应通常进行30-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸的三个步骤。
这样可以进行指数级扩增，生成大量目标DNA片段。
6. PCR产物检测：PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳等方法对PCR产物进行检测。
将PCR产物与DNA分子量标记物一起电泳，可以通过与标准品比较得知扩增片段的大小。
也可以通过染色剂如SYBR Green等进行荧光定量，或者使用定量PCR方法定量扩增产物的数量。
7.结果分析和数据处理：根据PCR产物的结果进行数据分析和处理。
多重荧光定量pcr步骤
多重荧光定量pcr步骤
多重荧光定量PCR（Multiplex real-time PCR）是一种同时检
测多个靶标序列的PCR技术。
它利用荧光标记的探针来定量
检测多个靶标序列的扩增产物。
以下是多重荧光定量PCR的
一般步骤：
1. 设计引物和探针：根据需要检测的靶标序列设计引物和探针，确保引物和探针的特异性和互补性。
2. 制备PCR反应体系：根据引物和探针的浓度，配制PCR反
应液。
通常包括模板DNA、引物、探针、Taq酶、缓冲液和
核酸酶水。
3. 负控和阳性对照：制备负控和阳性对照，用于检测PCR反
应系统的特异性和敏感性。
4. PCR反应：将PCR反应体系加入PCR管或板中，进行PCR 反应。
PCR反应包括一系列的循环，通常包括初始变性步骤、扩增步骤和终止步骤。
5. 数据采集和分析：通过实时荧光检测仪器实时监测PCR反
应过程中荧光信号的变化，得到荧光强度 vs. PCR周期数的曲线。
通过设置阈值，用于计算Ct值（循环阈值），并根据标
准曲线计算出待测样本中靶标序列的初始浓度。
6. 结果解读：根据Ct值和标准曲线，计算出待测样本中各个
靶标序列的相对数量和浓度。
需要注意的是，进行多重荧光定量PCR时，需要确保引物和探针的特异性和互补性，避免扩增产物的交叉反应。
另外，对于多重荧光定量PCR的反应体系和参数的优化，需要根据具体的实验要求和样本特点进行调整。
以上是一般步骤，具体操作可以根据实验条件进行调整。
定量PCR的实验流程及注意事项
定量PCR的实验流程及注意事项一、实验流程：1. Primer设计：为了进行定量PCR实验，需要设计一对与目标DNA 或RNA序列特异性结合的引物。
确保引物的特异性和互补性，通过使引物的浓度相等可以最大限度地提高PCR反应的扩增效率。
2.模板DNA或RNA提取：从细胞或组织中提取目标DNA或RNA。
可以使用商业化的DNA/RNA提取试剂盒或其他方法进行提取。
注意保持样品的完整性，避免污染和降解。
3.RNA逆转录（如果需要）：如果目标是RNA，则需要使用反转录酶将mRNA转换为cDNA。
通常，使用逆转录酶和随机引物进行逆转录反应。
4. qPCR反应体系：准备PCR反应体系，其中包含引物、模板DNA或cDNA、酶（如Taq DNA聚合酶、逆转录酶等）和反应缓冲溶液。
同时还可以加入SYBR Green等荧光染料或探针以实现实时监测PCR反应的进行。
5.PCR反应条件：设置合适的PCR反应条件，如温度和时间等。
通常情况下，PCR反应会进行多个循环，每个循环包括退火、延伸和变性三个步骤。
6.实时检测PCR反应：在PCR反应过程中，使用实时荧光检测系统实时监测PCR产物的积累。
根据荧光信号变化的阈值周期数（Ct值），可以推断出目标DNA或RNA的初始浓度。
7.标准曲线构建：通过使用已知浓度的目标DNA或RNA来构建标准曲线。
将标准曲线与待测样品的Ct值进行比较，可以计算出目标物浓度。
8.数据分析：根据标准曲线和待测样品的Ct值，计算出目标物的相对或绝对浓度。
可以使用专业的数据分析软件对实验结果进行统计分析和解释。
二、注意事项：1.特异性引物设计：确保引物与目标DNA或RNA的特异性结合，避免引物与非目标序列的扩增。
2.制备PCR反应的质量控制：采用无菌、无核酸污染的试剂和实验环境，避免引入杂质干扰PCR反应。
3.避免PCR反应产物的污染：使用专门用品和设备进行PCR实验，避免引入外源性DNA或RNA。
4.逆转录反应的标准化：如果进行RNA定量PCR，应尽量标准化逆转录反应的条件，以获得准确的cDNA模板。
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Module 2: 定量PCR实验设计和流程
定量PCR的实验设计
•准确定量样品的三个基本要求•定量PCR的实验要素
•定量PCR的实验中的误差校正
准确定量样品的三个基本要求
•重复性好
•准确度高
•动力学范围宽
1. 重复性: 曲线一致性
重复性好
40个相同样本重复
2. 准确度
与正确检测数据的接近程度
3.动力学范围
能得到高质量数据的线性范围
(范围越大越好)
定量PCR的实验要素
●目的基因样品
●标准曲线标准品●监控系统阳性对照●监控污染阴性对照
●分光光度计检测：
–
DNA 纯度：OD 260/OD 280=1.8–RNA 纯度：OD 260/OD 280=2.0
●Qubit ®
荧光定量：–
分别定量DNA 、RNA 及蛋白质–
准确性、灵敏度和简便性–Qubit ®Assay (dsDNA, ssDNA, RNA, protein)
模板质量：纯度和浓度
目的基因: 样品
标准曲线:标准品
●目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系
●要求：
–绝对定量实验：标准品浓度已知
–相对定量实验：标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近
100%
•试剂质量一致：模板纯度、引物和探针的Tm值、酶活性、缓
冲液成分
•反应条件一致：循环参数相同
标准曲线:如何制备标准曲线
•Don’t:
•制备3个点的2倍标准曲线
•Do:
•推荐制备至少5个点的10倍标准曲线(4 logs)
标准曲线:标准品梯度稀释方法
10倍连续梯度稀释方法：
1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii
1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii
1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv
1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v
E = 10(-1/斜率)-1R 2≥0.99
R 2≥0.99 E = 92.85%
标准曲线: PCR 扩增效率的确定
监控系统:阳性对照
●100%能扩增出荧光信号的对照组
●正常实验中可当做阳性对照的反应孔
•标准品
•内参(管家基因)
监控污染:阴性对照
类型
•无模板对照（No Template Control，NTC）
•无反转录酶对照（No RT Control）
•……
通过扩增图谱、熔解曲线、电泳、测序等手段对阴
性对照结果进行分析，以确认反应体系中是否存在
污染
定量PCR的实验要素小结
●目标基因
样品：模板质量
●标准曲线
标准品：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系
●监控系统
阳性对照：标准品，内参(管家基因)
●监控污染
阴性对照：无模板对照，无反转录酶对照
定量PCR的实验中的误差校正
●校准生物学误差内参(管家基因)●校准物理误差参比荧光
●降低随机误差重复实验
校准生物学误差:内参(管家基因)
内参基因(Endogenous Control)
用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响
•原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成等量样品不一定获得等量提取物
•目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为单位，不同样品之间才具有可比性
•校准方法：[目的基因]/[内参]=均一化的目的基因表达量
内参的选择
●在所有待测样品中，内参的表达量应当恒定不变
●常用内参基因，如18S rRNA、GAPDH等
●Human/Mouse/Rat Endogenous Control
Product Name Part Number TaqMan® Array Human Endogenous Control Panel 4367563 TaqMan® Array Mouse Endogenous Control Panel 4378702 TaqMan® Array Rat Endogenous Control Panel 4378704
●Master Mix中ROX浓度固定
●ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Master Mix用量有关●ROX的功能：校准物理误差
–耗材质量、管盖厚度、透光性能
–反应体系监控：蒸发、操作
Reporter
ROX
R n=R FAM/ R ROX
Reporter
ROX
Rn Rn
校准物理误差:参比荧光(ROX)
ROX校准增加数据精度
降低随机误差: 重复实验
●生物学重复：样品三次重复
●技术重复：每个样品做3-4个复孔
定量PCR的实验中的误差校正小结
●生物学方面的误差：内参校正
细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等
●物理方面的误差：ROX校正
耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光学误差；反应体系监控（蒸发）。
●随机误差：统计校正
重复实验，取平均值
定量PCR 的实验流程
1）样品采集2）选择提取方法5）购买RT 和PCR 试剂6）验证实验
扩增效率
动力学范围
准确度
精密度7）正式实验
反应板设置
软件设置8）数据分析
4）选择靶基因自行设计订购试剂盒
3）选择化学方法探针法
染料法
日常实验中的注意事项
●实验室分区：样品处理区、定量PCR反应制备区、扩增区●标准品的稀释最好使用独立的一套移液器
●移液器使用带滤芯的枪头
●先加阴性对照，后加样品，再由低浓度到高浓度加标准品，最后加阳性对照
●反应后的PCR管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启●PCR管/ 8联管/板上不可用记号笔标记
●PCR管/ 8联管/板使用光学平盖或光学膜，不要裸手触摸盖或膜表面
●PCR管或8联管要对称放置
Questions?。