淀粉酶菌株的选育发酵工艺的研究和酶的纯化模板
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计
产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。
二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。
因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。
主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。
淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。
产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。
三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。
淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。
牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。
4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。
四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。
（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。
用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。
但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。
本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。
二、分离及纯化1、材料试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等器皿：移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱其他：报纸、纱布、棉花、面线绳2、方法2.1培养基与器皿的准备和灭菌（1）培养基的配制称量1.2克淀粉。
加少量水加热溶化，然后加入6.8克营养琼脂，加水至150毫升，煮沸后倒入250ml容量的三角瓶中，加棉塞后放入高温蒸汽灭菌锅内灭菌备用。
（2）无菌水的制备分别取9ml蒸馏水加入5支试管中，加塞后用报纸包扎捆绑，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。
取90ml蒸馏水加入250ml三角瓶中，同样的操作，灭菌备用。
（3）器皿的准备将刻度吸管用报纸包扎，培养皿装入专用灭菌杯分别放入高温灭菌箱灭菌备用。
2.2菌悬液的制备和梯度稀释取10g土壤样品加入90ml无菌水中震荡, 然后静置2分钟。
取六只试管编号1—6分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml 上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作六个试管，得到10ˉ1—10ˉ6六个稀释度的菌悬液。
淀粉酶产生菌的筛选、培养与选育
功能微生物（淀粉酶产生菌）的筛选、培养与选育22100934 程雅楠摘要：以产淀粉酶细菌的筛选和选育为目标，通过培养基制备及灭菌、菌种的分离筛选与纯化、菌种的鉴定、培养条件的优化以及淀粉酶产生菌的紫外诱变育种等五个过程，并测定了诱变后菌株的16s序列，初步掌握了对某菌种进行筛选、选育及诱变的必需步骤。
关键词：产淀粉酶细菌筛选选育诱变育种淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株。
淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的尤为重要。
此次试验试图从土壤中分离出产淀粉酶的细菌，通过紫外线诱变育种等条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。
以达到加深对菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
1材料和方法1.1材料1.1.1 来源：南师大北区教学楼附近的土壤。
1.1..2培养基：淀粉培养基的配制①固体培养基膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
②液体培养基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
优化条件培养基配制：①淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 4.0 。
②淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L， K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 7.2 。
碳源培养基：①淀粉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。
淀粉酶菌株的选育发酵工艺的研究和酶的纯化
淀粉酶菌株的选育发酵工艺的研究和酶的纯化摘要：淀粉酶是最早用于工业生产同时迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，第一通过淀粉培养基从土壤中选择出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，选择出产量高、性状优良的突变菌株，再用正交试验的方法对其发酵条件进行优化，实验最后采纳硫酸铵沉淀法初步纯化发酵得到的淀粉酶并对酶活性进行了测定。
关键词：淀粉酶；分离选择；紫外线诱变；优化；提纯1、引言淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶，是最早用于工业生产同时迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有宽敞的用途。
我国是传统的农业大国，进展淀粉深加工工业是解决当前淀粉生产积压的好出路，而几乎所有淀粉深加工工业的基础差不多上以淀粉质原料的水解作为第一步，因此淀粉质原料的液化情形直截了当关系到产品后期的加工工艺和产品的质量。
因此，改进淀粉液化工艺也是降低生产成本，提高产品市场竞争能力的一种重要手段。
明显，改进淀粉液化工艺首要任务确实是提高淀粉酶的生产水平。
那如何提高淀粉酶的生产水平呢？我们明白，现在淀粉酶要紧来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此选择出高产、稳固的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事。
本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的枯草杆菌，通过紫外线诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳固的淀粉酶产生菌株，并对发酵得到的淀粉酶进行初步提纯，以达到加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识、把握紫外线诱变育种的原理和方法、了解发酵条件对产物形成的阻碍、熟悉发酵条件的优化方法、把握分光光度法测液化型淀粉酶活力的差不多原理和方法、把握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
2、材料与方法2. 1 实验材料2．1．1 样品：贵师大综合楼邻近的土壤2．1．2 培养基和试剂：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨（斜面）、牛肉膏蛋白胨（液体）种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2％可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液2．1．3 仪器设备：全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。
土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。
3．掌握分离纯化微生物的方法。
4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。
二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。
高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。
3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。
2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案产淀粉酶菌株的筛选是一项重要的研究工作，它可以满足很多工业和农业领域的需求。
下面是一个设计方案，包含步骤、实验条件和分析方法。
1.步骤（1）菌株的收集和培养首先，需要收集不同环境中的样品，如土壤、水体、植物表面等。
将样品分离培养在富含淀粉的琼脂培养基中。
培养过程中，需保持适宜的温度（通常在30℃左右）和适宜的pH（通常为6-7）。
（2）淀粉酶活性筛选将分离培养基中的菌株进行淀粉酶活性筛选。
取一小部分菌株涂抹到含有淀粉的琼脂培养基上，培养一段时间后在培养皿上观察是否产生明显的透明圈。
透明圈的出现表示淀粉酶活性较高的菌株。
（3）淀粉酶活性检测和比较从产生透明圈的培养皿中挑取具有高活性的菌落，进行淀粉酶活性检测。
可采用碘液滴加法，在含淀粉的琼脂培养基上，滴上一滴碘液，观察出现的蓝色溶解圈的明暗程度，可以初步评估淀粉酶活性的强弱。
（4）纯化和鉴定筛选出具有较高淀粉酶活性的菌株后，通过纯化和鉴定，进一步确定其产淀粉酶的能力以及体外条件如温度和pH对淀粉酶活性的影响。
可采用离心、柱层析等技术对菌株进行纯化。
通过测量在不同条件下的淀粉酶活性，确定最适宜的条件。
2.实验条件（1）培养条件：温度为30℃，pH为6-7（2）培养基：含淀粉和琼脂的培养基。
（3）检测条件：培养基含有淀粉，通过碘液滴加法观察形成的蓝色溶解圈明暗程度。
3.分析方法（1）测量淀粉酶活性采用I2-KI法测定淀粉酶活性。
将一定量的菌株培养液加入含淀粉的缓冲液中，反应一段时间后，加入碘液和KI溶液，混匀后通过测量吸光度来确定淀粉转化的程度。
（2）蛋白质含量测定通过BCA方法测定菌株培养液中的蛋白质含量。
将菌株培养液样品与BCA试剂混合，在一定温度下测量吸光度来确定蛋白质含量。
（3）酶动力学参数分析采用酶动力学参数分析方法，如麦克斯韦–玛尔特尔方程等，通过测定在不同底物浓度下的淀粉酶活性，来确定酶的最适底物浓度、最适酶浓度以及酶的最大反应速率。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案
“产淀粉酶菌株的筛选”设计⽅案产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选⼀、实验⽬的：1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微⽣物的完整操作步骤。
2.巩固以前所学的微⽣物学实验技术。
3.学习淀粉酶活性的测定⽅法。
⼆、实验原理：1.α-淀粉酶是⼀种液化型淀粉酶，它的产⽣菌芽孢杆菌，⼴泛分布于⾃然界，尤其是在含有淀粉类物质的⼟壤等样品中。
2.从⾃然界筛选菌种的具体做法，⼤致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。
a)采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究⼀下⾃⼰打算筛选的微⽣物在哪些地⽅分布最多，然后才可着⼿做各项具体⼯作。
在⼟壤中⼏乎各种微⽣物都可以找到，因⽽⼟壤可说是微⽣物的⼤本营。
例如厨房⼟壤、⾯粉加⼯⼚和菜园⼟壤中淀粉的分解菌较多。
b)富集培养：富集培养就是在所采集的⼟壤等含菌样品中加⼊某些物质，并创造⼀些有利于待分离微⽣物⽣长的其他条件，使能分解利⽤这类物质的微⽣物⼤量繁殖，从⽽便于我们从其中分离到这类微⽣物。
c)初步筛选：i.（选择培养基）初筛使⽤选择培养基对菌种进⾏培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出⽬的菌种，从⽽进⾏培养。
ii.（鉴别培养基）初筛利⽤鉴别培养基，通过添加⼀些特殊的试剂或成分来鉴别出⽬的菌种，从⽽筛选出来并对其进⾏培养。
d)分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的⽬的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从⽽得到纯种的菌落。
纯种分离的⽅法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢⼦或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
e)性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进⾏性能测定后才能决定取舍。
三、实验材料：1.培养基配制：a)培养基按以下⽐例配制后，加蒸馏⽔调⾄100%；b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋⽩胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、琼脂粉0.8%、⽜⾁膏0.5%、pH7.0；c)分离培养基：⽟⽶粉2%、黄⾖饼粉1.5%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO4 0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加⼊）、Na2HPO40.2%、pH7.0。
产_淀粉酶菌株的分离_鉴定及酶学性质研究
try. Methods: A- amylase- producing strains were isolated from soil samples by initial screening with iodine solution and the flasks fermentation. Then strains were identified based on partial 16S rDNA gene sequence aligned with the GenBank database and its morphological characteristics.
脱盐后, 对其酶学性质进行初步研究。结果: 从土壤中筛选到一株高产 A- 淀粉酶菌株, 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis XL- 15。 该 菌株所产 A- 淀粉酶的最适反应温度为 50e , 最适作用 pH 为 6. 5; Ca2+ 和 Mn2+ 对酶有激活 作用, 而 Cu2+ 、Zn2+ 和 EDTA 对酶有 抑
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淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究和酶的纯化
摘要: 淀粉酶是最早用于工业生产而且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一, 为了提高淀粉酶的生产水平, 首先经过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株, 对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变, 筛选出产量高、性状优良的突变菌株, 再用正交试验的方法对其发酵条件进行优化, 实验最后采用硫酸铵沉淀法初步纯化发酵得到的淀粉酶并对酶活性进行了测定。
关键词: 淀粉酶; 分离筛选; 紫外线诱变; 优化; 提纯
1、引言
淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称, 包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶, 是最早用于工业生产而且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多, 特点各异, 在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途。
中国是传统的农业大国, 发展淀粉深加工工业是解决当前淀
粉生产积压的好出路, 而几乎所有淀粉深加工工业的基础都是以
淀粉质原料的水解作为第一步, 因此淀粉质原料的液化情况直接
关系到产品后期的加工工艺和产品的质量。
因此, 改进淀粉液化工艺也是降低生产成本, 提高产品市场竞争能力的一种重要手段。
显然, 改进淀粉液化工艺首要任务就是提高淀粉酶的生产水平。
那如何提高淀粉酶的生产水平呢? 我们知道, 现在淀粉酶主要来源于植物和微生物, 并经过发酵完成生产, 因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事。
本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的枯草杆菌, 经过紫外线诱变育种及发酵条件优化
来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株, 并对发酵得到的淀粉酶进行初步提纯, 以达到加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、了解发酵条件对产物形成的影响、熟悉发酵条件的优化方法、掌握分光亮度法测液化型淀粉酶活力的基本原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
2、材料与方法
2.1实验材料
2．1．1样品: 贵师大综合楼附近的土壤
2．1．2培养基和试剂: 淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨( 斜面) 、牛肉膏蛋白胨( 液体) 种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2％可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液
2．1．3仪器设备: 全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光亮度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。
2.2实验方法
2．2．1细菌的分离与初步鉴定: 将土壤系列稀释, 把10-3、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上, 27℃倒置培养2天, 将长出的菌落接入斜面。
将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天, 用碘液染色, 记录透明圈大小和菌落直径, 计算D/d值。
保菌供下次实验用。
2．2．2紫外线诱变育种: 取活化后的菌种配成菌悬液、稀释; 倒淀粉培养基平板, 将菌悬液涂布其表面; 用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min, 每个处理2次重复; 放到黑暗中倒置培养, 37℃培养48h, 分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数, 并计算致死率; 加入碘液, 分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径, 计算D/d值; 将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。
2．2．3生产菌株摇瓶发酵条件的优化
2．2．3．1培养基初始pH值和装液量对产酶的影响: 用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节培养基pH值, 使培养基的pH值为5.0、7.0、9.0, 分装至250mL三角瓶中, 每瓶25mL, 灭菌, 冷却后编号1、2、3, 再接种, 37℃下恒温摇床培养48h( 摇瓶装液量分别30％、40％、50％) , 最后测定发酵液酶活。
2.2.
3.2培养基碳源对产酶的影响: 在不含可溶性淀粉的培养基中, 分别加入0.5％的各种碳源( 可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖) , 以硝
酸铵作为唯一氮源, 进行碳源对产酶的影响的发酵试验。
2.2.
3.3正交试验设计: 经过三因素两水平的正交试验对高产菌的发酵条件进行优化, 建立高产菌株的最佳摇瓶发酵条件。
2．2．4淀粉酶的初步提纯及酶活性的测定
2.2.4.1淀粉酶的初步提纯: 收集发酵液, 3000r /min 离心10min, 去除菌体, 在上清液中加入65％饱和度的硫酸铵, 待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h, 然后5000r /min 离心20min, 得到初步纯化的淀粉酶。
2.2.4.2标准曲线的制作和酶活性的测定: 将可溶性淀粉稀释成0.2％、 0.5％、 1％、 1.5％和2％的稀释液, 按下表进行标准曲线的制作和酶活性的测定。
管号
1
2
3
4
5
6 7．1 7．2 7．3 7．4
淀粉稀释液/mL 2( 0％) 2( 0.2％)
2( 0.5％)
2( 1％)
2( 1.5％)
2( 2％) 2( 2％) 2( 2％) 2( 2％) 2( 2％)
缓冲液/mL
1
1 1 1 1 1 1 1 1 1
40℃水浴保温5min
蒸馏水/mL 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 粗酶液/mL
1
1
1
1
40℃水浴保温30min, 然后加入0.5mol /L 乙酸10mL, 混均吸取反应液1mL
碘液/mL
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 A 660( 平均值)
( 7．1、7．2、7．3、7．4中加入的粗酶液, 即为正交试验设计中处理一、处理二、处理三、处理四所得的淀粉酶液)
注: ①前6组的数据用于标准曲线的制作: 以淀粉浓度为横坐标, 吸亮度为纵坐标, 作标准曲线; ②后4组的数据用于酶活性的测定: 测得吸亮度后, 可从标准曲线中查出相应的淀粉浓度, 求出被消耗的淀粉量, 这里的酶活即为每毫升粗酶液于40℃, PH6.0的条件下, 每小时液化可溶性淀粉的毫克数【mg可溶性淀粉/mL·h】。
3、结果与分析
3.1菌落的形态特征
菌落在以淀粉为唯一碳源的分离培养基中生长, 培养48h形成白色圆形菌落, 菌落背面乳白色, 边缘不光滑, 形态规则, 质地较密, 有透明圈, 无沉淀。
3.2计算D/d值
3．2．1分离筛选时, 大部分菌落水解圈都粘连在一起, 无法准确测得D/d值, 只得到少部分数据:
单菌落透明圈直径/mm(D) 菌落直径/mm(d) D/d
① 4.0 3.0 1.3
②14.0 7.1 2.0
表A 透明圈直径和菌落直径及比值
分析: 无法准确测得D/d值, 可能是所采土样中产淀粉酶的细菌含量较多, 涂平板之前稀释倍数不够导致单菌落过于密集, 水解圈粘连; 也可能是实验操作不当所致。
3．2．2紫外诱变后, 得到单菌落的透明圈直径和菌落直径及比值: 单菌落透明圈直径/mm(D) 菌落直径/mm(d) D/d
① 4.8 3.0 1.6
② 6.4 5.5 1.2
③14.8 7.4 2.0
④16.0 4.9 3.3
⑤11.8 4.5 2.6
⑥9.8 4.0 2.5
⑦25.0 5.0 5.0
⑧8.8 4.0 2.2
⑨14.0 7.8 1.8
分析: 经过结果, 可看出经过紫外诱变后, 有的菌株产酶活能力有所提高, 有的减小, 筛选产酶活能力最高的菌株, 保存供后续试验使用。
我们挑⑦号菌, 将其保存到斜面培养基上供后续试验使用。
3.3计算菌株紫外诱变的致死率
对菌株分别用紫外线处理, 得到下表:
由此数据, 可作出紫外线诱变的致死曲线
96.7％, 进一步提高照射
时间, 则致死率随之上升, 当照射10min时, 致死率为100％。
一般认为, 进行紫外诱变时, 致死率为95％左右时突变效果最好。
因此, 紫外线诱变的最适剂量为6min。
3.4菌株发酵条件的优化
3．4．1培养基初始pH值和装液量对产酶的影响:
分析: 未得到数据的原因有三点: ①操作不当, 可能是取液过程中加错体积, 也可能是将试管序号弄混了; ②将发酵液从摇床取出的过程中有少量溢出, 导致浓度降低, 影响实验结果; ③发酵过程中有杂菌产生, 发酵液被污染了。
3．4．2培养基碳源对产酶的影响:
分析: 由上表数据可知, 培养基的碳源为葡萄糖时酶活性最大。
从而得出结论: 三种碳源中最佳碳源是葡萄糖。
3．4．3标准曲线的制作:。