抗病毒的转基因植物
基因沉默番木瓜环斑病毒复制酶基因（PRSV-Nib）获得抗病毒病番木瓜的研究
热带作物学报2024, 45(4): 837 846Chinese Journal of Tropical Crops基因沉默番木瓜环斑病毒复制酶基因（PRSV-Nib）获得抗病毒病番木瓜的研究吴清铧1,2，贾瑞宗2*，郭静远2，杨牧之2，胡玉娟2，郝志刚2，赵辉2**，郭安平2** 1. 海南大学热带作物学院，海南海口 570228；2. 海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室/中国热带农业科学院三亚研究院/中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南三亚 572024摘要：番木瓜是重要的热带经济水果。
番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus, PRSV）是番木瓜的重要病毒病，经常导致严重的产量损失和质量恶化。
自从1998年第一例转基因番木瓜问世以来，使得基于“致病菌衍生的抗病性（pathogen-derived resistance, PDR）”的抗病育种策略获得成功广泛应用。
然而依赖于序列同源性的抗病性与病毒突变导致多样性增加之间的矛盾成为番木瓜育种科学家的新挑战。
本研究拟采用RNAi策略针对复制酶（nuclear inclusion b. Nib）获得广谱抗PRSV番木瓜新种质。
通过团队已建立的胚性愈伤诱导-农杆菌介导转化-再生苗诱导的番木瓜遗传转化体系，共获得经过抗性筛选的再生苗52株，通过特异性PCR进行筛选共计获得24株转基因阳性植株。
通过对T0代田间自然发病试验中，转基因番木瓜株系抗病性明显高于非转基因对照，其中NibB5-2田间抗病性最优。
通过hi TAIL-PCR方法确定NibB5-2插入位点位于第2号染色体supercontig_30的1976766的位置。
T1代接种试验中，无病毒积累且无发病症状，初步确认具有良好的病毒抗性，为番木瓜抗病育种提供新思路。
关键词：番木瓜；番木瓜环斑病毒；Nib基因；RNA介导的病毒抗性中图分类号：S436.67 文献标志码：AGene Silencing of Papaya ringspot virus Replicase Gene (PRSV-Nib) to Obtain Virus Resistant PapayaWU Qinghua1,2, JIA Ruizong2*, GUO Jingyuan2, YANG Muzhi2, HU Yujuan2, HAO Zhigang2, ZHAO Hui2**, GUO Anping2**1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China;2. Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitor-ing and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions / Sanya Research Institutey, Chinese Academy of Tropical Agri-cultural Sciences / Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Sanya, Hainan 572024, ChinaAbstract: Papaya is an economically important tropical fruit. Papaya ringspot virus (PRSV) is an important virus dis-ease of papaya, often causing significant yield losses and quality deterioration. Since the introduction of the first trans-genic papaya in 1998, PDR-based breeding strategies for disease resistance have been successfully applied. The contra-diction between disease resistance based on sequence homology and increased virus genetic diversity became a new challenge for papaya breeding. In this study, we propose to use RNAi strategies aim at nuclear inclusion b gene (Nib) to obtain broad-spectrum resistance to PRSV papaya. With optimized embryo callus generation-Agrobatium meidated transformation-shoot regeneration, 52 shoots were obtained after resistance screening and a total of 24 transgenic posi-tive shoots were obtained by specific PCR screening for the T0 generation. In the T0 generation field natural disease test, 收稿日期 2022-12-16；修回日期 2023-02-15基金项目 海南省重大科技计划项目（No. ZDKJ202002）；海南省重点研发计划项目（No. ZDYF2022XDNY257）；崖州湾科技城菁英人才项目（No. SCKJ-JYRC-2022-67）。
转基因番茄的研究进展
1、抗病转基因番茄
• 烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、苜蓿 花叶病毒(AMV)和番茄黄花卷叶病毒(TYLCV)等是引起 番茄病毒病的主要病原。在番茄转基因抗病毒育种中， 主要利用病毒的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因、 复制相关蛋白(Replication-associated protein， REP)基因、卫星RNA基因和病毒片段的反义RNA基因等。 外壳蛋白(CP)在转基因植物中的积累可以干扰病毒脱 衣壳，抑制病毒在植物体中的复制、转运和积累从而 使转基因植株获得了病毒抗性。
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2003年陈溪利用转基因番茄作为生物反应器生产人 胰岛素，通过以口服方式摄入胰岛素来研究在抑制自身免 疫攻击以及预防I型糖尿病中所起到的作用，己经取得了 很大的进展。
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2006年, Chen等人将肠道病毒EV71的外壳蛋白VP1基
因导入番茄,外壳蛋白VP1在转基因番茄中获得了表达.用 转基因番茄喂食小白鼠,小白鼠可以抗肿瘤细胞的感染。
2003年王仁厚利用转基因番茄表达人酸性成纤维细胞生长 因子(aFGF)，通过构建的双元表达载体带有一个经过改构的 人酸性成纤维细胞生长因子基因(afgf),载体上的选择标记基 因为manA,它使得转化过程中可以使用PMI这种不含抗生素及 除草剂的选择系统。利用农杆菌介导的转化方法获得了afgf 转基因番茄植物,并且通过PCR-Southern、RT-PCR证明了afgf 在宿主基因组中的整合及表达。
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葡激酶( Staphylokinase，SAK) 是由金黄色葡萄球菌 分泌的一种纤溶酶原激活剂，首次发现于 1948 年，它可以 激活人体中的血纤维蛋白溶酶原形成血纤维蛋白溶酶，从而 溶解血栓。同其他溶栓药物相比，葡激酶具有溶栓效果好， 纤维蛋白选择性强，无显著促凝血作用等优点。 2011杜景川等人利用农杆菌介导的方法，将葡激酶( Staphylokinase，SAK) 基因导入番茄中。经 PCR、 Southern 杂交和 Northern 杂交检测，葡激酶基因已整合 到再生番茄植株基因组中，共获得 8 个转基因株系。经 ELISA 检测，转基因番茄的果实和叶片均能表达 SAK 蛋白， SAK 蛋白在果实和叶片可溶性蛋白中的比例最高分别为 3.42%和2.47%。转基因番茄中的 SAK 蛋白具有一定的溶栓 活性，溶栓比活力为 3 866 AU·mg－1。
植物转基因育种概述
别与卵细胞和极核结合， 形成受精卵和受精极核。植 物经开花、传粉和受精后， 花的各部分都发生一系列 的变化。现将受精后花或花序发育成果实和种子的过 程综合如下。 ２ 果实的类型
平 时 所 吃 的 苹 果 、香 蕉 、草 莓 、桔 子 、番 茄 等 都 是 植物的果实。植物的果实种类繁多、千变万化， 从不同 方面可以划分出不同的类型。 ２．１ 分类的依据
果实的果皮由子房发育而成的， 称为真果。除子 房外， 还有其他部分参加果皮组成的， 如花被、花托以 至 花 序 轴 ， 这 类 果 实 称 为 假 果 ， 如 苹 果 、梨 、石 榴 、瓜 类、凤梨等。另外， 根据果实是由单花或花序形成来划 分， 可分为单果、聚合果和复果三类。一朵花中如果只 有一枚雌蕊， 以后只形成一个果实的， 称为单果， 如花 生、桃； 如果一朵花中有许多离生雌蕊， 以后每一雌蕊 形成一个小果， 相聚在同一花托之上， 称为聚合果， 如 莲、草莓、悬钩子、玉兰等。如果果实是由整个花序发 育而来的， 花序也参与果实的组成部分， 就称为聚花 果， 或称花序果， 也称复果， 如桑葚、凤梨、无花果、菠
植物抗病毒机制与转基因番木瓜
!"植物病害与植物对病毒的交叉保护现象 植物病害是导致农作物减产的重要原因之一#而
其中部分病害则由植物病毒引起$ 例如#大家熟悉的 烟草花叶病毒可侵染烟草等茄科植物#引起叶片厚薄不 匀#颜色黄绿相间#呈花叶状*发病早期的植株节间缩 短#严重矮化#生长缓慢$ 水稻矮化病毒曾于 ';&$';&& 年间在菲律宾流行#导致部分地区水稻颗粒无收$
早在 ';)< 年就有人观察到#接种了烟草环斑病毒 弱毒株的烟草#虽然接种叶出现坏死斑#但植株整体获 得了对同种及相近种病毒的抗性&''$ 研究发现#其他 植物也大多存在类似现象#人们把此种现象称为交叉 保护$ 这种现象与动物接种疫苗后产生对病毒的抗性 很相似#但植物并不具备动物那样的免疫系统#也从未 有人发现在植物体内有针对病毒的抗体存在#因此两者 的机制并不一样$ 人们提出过好几种假说试图解释这 种现象#但都无法得到证实$ 直到 ';;% 年#美国科学家 YGFD.0/.0 等在研究矮牵牛花色变化时发现了 J>?干扰 现象#植物的交叉保护机制才得以最终阐明$ #"植物的抗病毒机制
成熟的病毒 与 蛋白 是 基 /J>?*$
/J>? 4FDG04C6. ! J>?
因沉默途径中的核心元件#属于一个庞大的蛋白质家
族"结合形成 J>?诱导沉默复合体! 在 JUP+"*' JUP+
中#病毒 /J>?指导与其互补的病毒基因组的切割#从而
抵抗病毒的入侵&$' #而这些沉默信号在受感染的细胞中
植物在与病毒的长期斗争中进化出了多种多样的 抗病毒机制#植物表面具有的角质层%蜡质层和细胞壁 等物理屏障足以阻止大部分的病毒侵染#一些植物还 通过突变使自身丧失病毒复制或运动所需的基因产物 而导致病毒失去侵染力$ 不过#目前最受关注的植物 抗病毒机制是 J>?沉默和 3基因介导的病毒抗性$ )(' ! 植 物 的 介 J>? 导 的 病 毒 基 因 沉 默 机 制 ! YGFD.0/.0 等为了得到花色更深的矮牵牛#将与花色形 成密切相关的查耳酮合酶基因! 456" 导入到开紫花的 野生型矮牵牛中#却意外地发现约有 'O" 的转基因后 代开白花或紫白相间的花#其 456 基因的表达比野生 型显著下调#他们当时推测可能是外源导入的 456 基 因抑制了植物内源 456 基因的表达#这就是所谓的 J>?沉默现象#即小 J>?!/J>?" 通过诱导与其互补 的 -J>?或病毒 J>?的降解或翻译抑制% 或 =>? 组 蛋白修饰等过程#抑制靶基因的表达或翻译#使得靶基 因沉默 $ &)' 病毒 沉 J>? 默现象是目前已阐明的植物
6.2 基因工程及其应用
能生产胰岛素的大肠杆菌
转基因超级小鼠
荧光小猪
导入人基因的小鼠(长出人的耳朵)——器官移植
荧光小鱼
个头特别大的转基因鲤鱼
日 本 生 产 的 转 基 因 方 形 西 瓜
日本转基因蓝色玫瑰
未来会不会出现这样的香蕉？
一、基因工程的概念——分子水平改变生物
标准概念——在生物体外，通过对DNA分子进行人工 “切割”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新 组合，然后导入受体细胞内，使重组基因在受体细胞 内表达，产生出人类所需要的产物。 基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 通俗概念——按照人们的意愿，把一种生物的个别基 因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的 细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
富含赖氨酸的转基因玉米
（二）动物基因工程——提高动物生长速度
转生长激素 基因鲤鱼
（二）动物基因工程——生产药物
转有人α-抗胰蛋白酶 基因的转基因羊
（三）基因工程药物
我国生产的部分基因工程药物
（三）基因工程药物
以候云德院士(右)为首的研究 人员，成功地研制出我国第一 个基因工程药物——干扰素
干扰素的生产车间
（四）基因治疗
我国研究人员正在制备用 于治疗的基因工程细胞
为病人注射基因工程细胞
六、转基因生物和转基因食品的安全性
目前，转基因生物和转基因食品的安全性还 没有证实，国际上对于转基因食品的管理主要有 两种态度，即欧洲国家的严格管理的态度和美国 相对宽松的态度。
三、基因操作的基本步骤
细菌 取出质粒 用相同的限制酶切出黏性末端 供体细胞 取出DNA分子 用限制酶切取目的基因
将目的基因插入质粒切口 用DNA连接酶将目的基因与质粒相连 基因工程的 将重组DNA分子导入受体细胞 遗传学原理： 基因重组 重组DNA分子增殖、表达 检测目的基因产物
抗病毒转基因植物
抗病毒转基因植物。
植物病毒病害已成为植物病害的最大类群之一，随着基因工程技术的发展，为培育抗病毒的植物品种开辟了新的途径。
目前已有多种方法获得抗病毒转基因植物。
利用植物自身编码的抗病毒基因培育抗病毒植物。
许多植物对病毒具有天然的抗性，将这些基因克隆并转化到其他植物中，可使转化的植物获得抗病毒的能力。
已报道在植物中有几种基因，其编码的蛋白具有抗病毒的功能。
商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein，PAP)是存在于商陆叶片细胞中的一种小分子糖蛋白，它可以抑制病毒蛋白的活性，具有广谱抗病毒能力。
Lodge等将编码PAP蛋白的基因转移到烟草中，获得的转化株能抵抗多种病毒的侵染。
病毒侵染植物时，植物会产生过敏性坏死斑，而过敏性坏死斑的形成是由植物内一种称为N基因表达的结果。
多数过敏性坏死斑反应是由单个基因控制，将N基因转移到番茄中，获得的转基因番茄对烟草花叶病毒（TMV）表现了强烈的过敏反应。
此外，植物病程相关蛋白pathogenesis-related protein，PR蛋白)对病毒也表现了一定的抗性，它是植物受到病毒袭击或其他因子影响后产生的一种蛋白，它可能参与植物细胞壁的抗侵染作用。
病毒外壳蛋白转基因植物。
病毒外壳蛋白(coat protein，CP)转基因植株抗病毒的机制有两种观点：其一是认为将病毒外壳蛋白基因转移到植物细胞后，转化株内CP基因表达的蛋白能将入侵病毒裸露的核酸包裹，从而阻止入侵病毒核酸的翻译和复制；其二是认为CP基因的表达可抑制入侵病毒的脱壳，从而抑制病毒的繁殖。
自1986年Beachy等将TMV外壳蛋白基因转移到烟草后，至今已有30多种植物病毒的CP基因转移到烟草等十多种双子叶植物中，并获得了抗性强弱不等的转基因植株，某些转基因植物已释放到大田中，取得了明显的经济效益。
如Monsanto公司将TMV的CP基因转移到番茄中，转基因植株的接种后发病率小于5％，产量几乎不受影响；而对照株发病率为100％，果实减产26％—35％。
高中生物选择性必修三 第3章 第3节 基因工程的应用
学习目标
1.举例说明基因工程在农牧业、医药卫生及食品工业 的应用。 2.举例说出日常生活中的转基因产品,理性看待基因工 程给我们的生产和生活带来的影响。
一、基因工程在农牧业方面的应用 1.转基因抗虫植物 (1)方法:从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因,将其导入作物 中。 (2)成果:转基因抗虫棉花、玉米、水稻等。 (3)意义:减少化学杀虫剂的使用,降低生产成本,减少环境污染。 2.转基因抗病植物 (1)方法:将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中。 (2)成果:转基因抗病毒甜椒、番木瓜等。 (3)意义:能获得用常规育种方法很难培育出的抗病的新品种。
答案D 解析萤火虫与烟草的遗传物质都是双链DNA,这是完成基因重组的 基础,①正确;自然界的所有生物几乎都共用一套遗传密码,②正确; 萤火虫的荧光素基因导入烟草细胞使得该转基因植株通体光亮,可 见荧光素基因在该植株中成功表达,即烟草体内合成了荧光素,③ 正确;萤火虫与烟草细胞合成蛋白质的方式基本相同,都是以mRNA 为模板,在核糖体上,经氨基酸脱水缩合形成蛋白质,④正确。
探究点一
探究点二
答案C 解析重组质粒形成后需要通过农杆菌转化法等方法导入棉花的叶 肉细胞;如果抗虫基因导入棉花叶肉细胞的细胞质中,转基因棉花 的花粉中不含该基因,如果导入细胞核基因中,该转基因植株相当 于杂合子,后代会发生性状分离;抗虫棉的选择作用使具有抗性突 变的棉铃虫生存下来,经过长时间积累,棉铃虫的抗性会增强。
2.科学家将萤火虫的荧光素基因转入烟草植物细胞并获得高水平 的表达。长成的烟草植株通体光亮,堪称自然界的奇迹。这一研究 成果表明( ) ①萤火虫与烟草的DNA结构基本相同 ②萤火虫与烟草共用一套遗传密码 ③烟草体内合成了荧光素 ④萤火虫和烟草合成蛋白质的方式基本相同 A.①③ B.②③ C.①④ D.①②③④
白菜转基因实验报告
一、实验背景随着科学技术的不断发展，转基因技术在农业领域的应用越来越广泛。
白菜作为我国重要的蔬菜作物之一，其转基因研究对于提高产量、改善品质、增强抗病性等方面具有重要意义。
本实验旨在通过农杆菌介导法将抗病毒基因导入白菜，探究转基因白菜在抗病毒性方面的表现。
二、实验材料与方法1. 实验材料- 白菜（Brassica rapa ssp. chinensis）：取材于本地种植的结球白菜。
- 农杆菌：选择含有Ti质粒的根癌农杆菌C58。
- 抗病毒基因：TuMV-NIa及LMV-CP。
- 植物激素：6-BA、NAA、AgNO3。
2. 实验方法1. 基因转化1.1 准备农杆菌：将根癌农杆菌C58在含有卡那霉素的YEB培养基中培养至对数生长期。
1.2 制备外植体：取白菜叶片，用70%酒精消毒后，用无菌水清洗3次，再将其切成小块。
1.3 共培养：将外植体与农杆菌混合，共培养于含有植物激素的培养基上，共培养时间为2-3天。
1.4 诱导再生：将共培养后的外植体转入含有植物激素的再生培养基中，诱导其再生。
1.5 抗性筛选：将再生植株转入含有抗生素的培养基中，筛选出阳性植株。
2. 分子鉴定2.1 PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
2.2 Southern blot检测：将转基因植株DNA进行 Southern blot，检测目的基因是否整合到植物基因组中。
3. 抗病毒性检测3.1 人工接种：将转基因植株和对照植株分别接种TuMV和LMV病毒。
3.2 观察记录：观察记录植株发病情况，比较转基因植株和对照植株的抗病毒性。
三、实验结果1. 基因转化通过共培养和诱导再生，成功获得转基因白菜植株。
2. 分子鉴定PCR和Southern blot检测结果均显示，目的基因已成功导入白菜基因组中。
3. 抗病毒性检测与对照植株相比，转基因植株在接种TuMV和LMV病毒后，发病率明显降低，表现出较强的抗病毒性。
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植物病毒的危害及作用
病毒引起的病害在数量上占植物病害的第二位。由植物 物病害的植物有：禾本科、茄科、豆科、十字花科和葫 西北引起毁灭性的植物病毒病有番茄蕨叶病毒病，花叶 花叶病毒病和烟草脉坏死病毒病等。
生产上危害较大的植物病毒病害有：烟草花叶病、黄瓜
薯病毒病、玉米矮花叶病等。
植物病毒也有可利用的价值，特别在开发基因工程的载
物研究等方面，发挥了很大的作用。
植物病毒的研究现状
植物病毒每年给世界各地的农作物生产造成严重损失，每年
因病毒侵害的损失数百亿美元，传统的防治方法已远远无法满足 求。病毒侵染之所以复杂，在于一方面病毒的高突变率所致的植 失速度远高于常规植物抗病育种速度；另一方面病毒在隐症野生 三，无亲缘关系的病毒复合侵染以及病毒侵染的持久性，特别是 的植物病毒能在土壤中存活许多年。因此，在适宜病毒介体生长 面积连作缺乏抗病基因的植物，造成的经济损失会更高。Hamilt 代初首先提出了基因工程保护的设想，在转基因植物中表达病毒 防御病毒侵染的途径之一。近 20 多年来，基因工程的发展，为防 新途径。本文就植物抗病毒工程策略中目前常用的来自于植物抗 的基因及其他策略的研究进展进行综述。
抗病毒的转基因植物
生科13103 班 ：覃林、 龙成 、黄丹萍
植物病毒病的诊断与鉴定
1 植物病毒的概念 2 植物病毒的危害和作用 3 我国植物病毒的研究现状 4 植物病毒的鉴定 5 基因工程在植物抗病的展望
1.植物病毒病的概述
病毒(virus)是一种由核酸、蛋白或其复合体构成的，可以增殖、 生物体上的非细胞形态分子生物 病毒区别于其它生物的主要特征是：
花叶症状 黄化
抗病毒转基因植物
利用植物自身编码的 基因培育抗病毒植物， 壳蛋白转基因植物，病 酶转基因植物，移动蛋 因植物，核糖体失活蛋 因植物，病毒卫星RNA 物。
转基因番茄，对病毒 表现强烈过敏反应。
病毒复制酶转基因植物
将病毒RNA复制酶基因改造后导入 物体后，看干扰病毒的复制，从而达 抗病毒的目的。将CMV缺损型复制酶 因导入烟草后，转化株对CMV表现了 度的抗性。
基因工程在抗病毒植物的应用 •所用外源基因 •植物病毒外壳蛋白基因（病原体为病毒） •人工合成的
移动蛋白转基因植物
病毒在细胞间的移动主要受病毒本身编码的移动蛋 控制，移动蛋白能够修饰胞间连丝，同时又能与病 是病毒核酸的三维结构改变成丝状的核酸-蛋白质复 通过胞间连丝。将TMV的移动蛋白基因缺失突变后 化株不仅对同一属的多种病毒具有抗性，而且对烟 黄瓜花叶病毒等具有抗性。
抗真菌转ห้องสมุดไป่ตู้因植物
植物对真菌等病 害微生物的防御主要 包括机械防护和生物 学保护两个方面。当 致病菌入侵植物时， 植物细胞壁的结构发 生变化，细胞壁的强 度和硬度增加。另一 方面，植物细胞被诱 导合成多种活性物质 如抗毒素和几丁质酶 等，以抑制真菌的生 长和入侵。
几丁质酶转基因植物
转基因烟草
几丁质酶转基因植物
广泛存在于植物和微生 能降解几丁质，该酶一 因编码。由于几丁质是 病原真菌细胞壁的主要 而利用几丁质酶转基因 治植物真菌病害中有重 正常的植物中几丁质酶 低，但当病原真菌侵染 时能诱导产生很高的几 性。Broglie等将菜豆 cDNA与CMV35S启动子重 烟草和番茄中，转化株 核菌的抗性显著提高。
转基因植物
• 转基因植物(Transgene plant)是拥有来自其他物种基因 因变化过程可以来自不同物种之间的杂交，但今天该 指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插入其他物 出拥有新特性的植物。
• 转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生 等提高其经济价值或观赏价值；作为某些蛋白质和次 生物反应器，进行大规模生产；研究基因在植物个体 正常生理代谢过程中的功能。